全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 042282204
ATP 发光技术测定辐照前脱水蔬菜和
调味品的含菌量
冯　敏　高　岳　吕海燕　杨书华　万定珍　王泽港
罗时石　马　飞　葛才林
(扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室 ,江苏 扬州　225009)
摘 　要 :用 ATP 发光技术测定脱水蔬菜和调味品的初始含菌量 ,发现脱水蔬菜和调味品中细菌
ATP 的生物发光强度与其初始含菌量之间显著相关 ,从样品的制备到获得 ATP 发光强度结果
的检测过程仅需 1～2h。该技术可用于辐照灭菌前的微生物检测。
关键词 :脱水蔬菜 ;调味品 ;初始含菌量 ;ATP 生物发光 ;快速检测
THE RAPID BIOLUMINESCENCE ASSAY METHOD FOR CONTENT OF BACTERIA
IN DEHYORATED VEGETABLE AND CONDIMENT BEFORE RADIATION
FENG Min 　GAO Yue 　LU Hai2yan 　YANG Shu2hua 　WAN Ding2zhen
WANG Ze2gang 　LUO SHI2shi 3 　MA Fei 　GE Cai2lin
( Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province , Yangzhou University , Yangzhou , 225009)
Abstract :The microbial colony2forming unit (cfu) in dehydrated vegetable and condiment was determined by using
ATP bioluminescence method. The result showed that bioluminescence of ATP was correlative to the microbial cfu
obviously. The detecting time was within 1～2h. This method could be applied to determine micro load of products
before irradiation sterilization.
Key words :dehydrated vegetable ; condiment ; initialization cfu of bacteria ; ATP bioluminescence ; rapid assay
收稿日期 :2004209207
作者简介 :冯　敏 (1980 - ) ,女 ,江苏射阳人 ,硕士研究生 ,从事食品辐照保鲜、灭菌研究。Email :fengmin8156 @163. com。罗时石为通
讯作者 ,Email :luoss @yzcn. net
脱水蔬菜和调味品在加工、储运过程中易被微生物污染 ,造成含菌量超标 ,使产品的销售受到了一
定的限制。辐射灭菌技术已广泛地应用于脱水蔬菜和调味品的灭菌处理。辐照前样品的初始含菌量是
制定辐照工艺的重要依据之一 ,但常规的细菌检测方法需要 24h 以上 ,所以多凭经验确定产品的辐照剂
量 ,以致造成过量照射浪费能量 ,或灭菌不彻底。因而实践中希望有一种快速、方便的细菌检测方法 ,这
已成为辐照灭菌行业迫切需要解决的问题。
荧光素2荧光素酶测定法是快速检测微生物的方法之一 ,其理论基础在于 ATP 是包括细菌在内的活
细胞中最普遍的一种能量代谢物 ,生物体内含量相对稳定。以 ATP 为能源 ,荧光素酶催化荧光素氧化
发光 :
ATP + 荧光素 + O2
荧光素酶
氧化荧光素 + AMP + PPi + 光
该方法可在几分钟[2 ]内快速地得出含菌量 ,已成功地应用于病员尿液、肉制品、饮料和酒类中细菌
的快速检测。这一技术在辐照灭菌方面的应用尚未见报导 ,本文对 ATP 发光分析技术在脱水蔬菜和调
味品初始带菌量的检测方面的应用进行了初步研究。
282　 核 农 学 报　2005 ,19 (4) :282～285Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　材料和方法
111 　供试材料　脱水香葱粉、胡椒粉和辣椒粉 ,由江苏省兴化市新益食品厂提供。荧光素酶、荧光素、
ATP 标样等试剂购自中科院上海植物生理所。
112 　提取回收率 :
回收率按内标法[3 ] ,采用下式进行计算 :
提取回收率 ( %) = 加 ATP 标样的样品 RLUmax - CK的 RLUmaxATP 标样的 RLUmax ×100 %
113 　提取液颜色的影响
配制浓度分别为 110、210、310、410、510、610、710 和 810 的柠檬黄溶液 ,取 9 支无菌试管 ,每管内加入
脱水香葱粉 1g ,1 号管作对照 ,不加柠檬黄溶液 ,2～9 号管分别加入浓度由小到大的柠檬黄溶液各 1ml ,
经提取、发光测量等过程 ,测试 ATP 的发光强度。
114 　细菌 ATP的检测
检测按以下步骤进行 :样品的制备 ;样品的稀释、匀浆 ;非细菌 ATP 的清除 ;细菌 ATP 的提取 ;ATP
的生物化学发光测定。具体如下 :
11411 　样品的制备　将每种供试材料分成两份 ,其中一份进行高压灭菌处理 ,一份不灭菌 ,并将两份材
料按一定比例混合 ,配置一组含菌量不同的样品 ,分别进行细菌菌落总数检测和细菌 ATP 生物发光测
定。
11412 　菌落总数的检验　按照食品卫生微生物学检验标准 ( GB47891221994)进行。
11413 　非细菌 ATP 的清除　称取配置好的样品 015g ,脱水香葱按 1∶20 (mΠv) 、调味品按 1∶10 (mΠv) 的比
例加入 Tris2EDTA(20mmolΠL Tris + 2mmolΠL EDTA ,pH7175)充分混匀、匀浆 ,加入等体积的 012 % Triton X2
100 和 0115 % Apyrase 混合液 ,在室温下放置 10min。
11414 　细菌 ATP 的提取 　将清除非细菌 ATP 的匀浆液在沸水浴煮沸 90s ,立即冷却后离心 3min ,取上
清液作 ATP 待测液。
11415 　ATP 的生物化学发光测定 　用 SHG2D 生物化学发光仪 (上海检测仪器厂生产) 测量发光强度。
测定条件为 :温度 25 ℃、测定时间 10s ,测量值取 10s 内的积分值 (即相对发光单位 RLU) 。测量步骤如
下 :加入 200μl ATP 待测液于发光管内 ;注入 800μl 荧光素2荧光素酶混合液 ,立即测其发光值 (RLUmax) 。
由于光线的照射能使测量值出现短暂偏高的现象 ,因此 ,测量管在放入测量室后均暗适应 15min 再
进行测量。
2 　结果与分析
211 　非细菌 ATP的清除及对发光强度的影响
在应用 ATP 生物发光检测含菌量时 ,来自于细菌以外的 ATP(主要是产品中所含动、植物体细胞游
离出的 ATP)有可能产生干扰 ,使测量结果偏高 ,因此有必要消除这部分 ATP 对发光强度测量的影响。
我们对 3 种供试材料都进行了试验 ,结果 3 种材料中非细菌 ATP 的发光强度都远小于细菌 ATP 的发光
强度 ,它们对总体发光强度的影响都小于 019 % ,从简化测量过程的角度考虑 ,在进行上述 3 种样品初始
含菌量的检测时 ,可省略清除非细菌 ATP 这一步骤。
212 　细菌 ATP的适宜提取时间与提取回收率
本试验采用 Tris2EDTA 加热提取细菌 ATP 的方法 ,提取的时间过长则有可能使 ATP 产生分解 ,而提
取的时间过短 ,则有可能对 ATP 提取不完全 ,为了掌握适宜的提取时间 ,我们以脱水香葱粉为材料 ,进
行了提取时间对发光强度影响的试验 ,结果如图 1。从图中可以看出 ,提取时间在 90s 时发光强度最大 ,
故确定提取时间为 90s。
提取回收率也是影响试验结果的关键因素 ,我们用内标法对该法的提取回收率进行了测试。结果
列于表 1 ,3 种材料的回收率都大于 95 % ,从而证实了用此法提取 ATP 的可行性。
382　4 期 ATP 发光技术测定辐照前脱水蔬菜和调味品的含菌量
图 1 　提取时间与 ATP发光强度的关系
Fig. 1 　Relation between extration time
and ATP bioluminescence
表 1 　样品 ATP提取回收率的测定试验
Table 1 　Test on reclaim rate of ATP
样品名称
sample
处理发光强度
RLU of treatment
对照发光强度
RLU of CK
回收率
reclaim rate
( %)
脱水香葱粉 dehydrated shallot powder 11198 10649 ±672 9511
辣椒粉 capsicum powder 11198 10906 ±295 9714
胡椒粉 pepper 11198 11418 ±392 102
213 　提取液的颜色对发光强度的影响
由于供试材料本身具有颜色 ,细菌 ATP 的提取液会带有或深或浅的颜色。为分析颜色对发光强度
的影响 ,我们取 9 份含菌量一致的脱水香葱粉进行试验。在脱水香葱粉的含菌量相同的情况下 ,若不加
柠檬黄溶液 ,各份材料测得的细菌 ATP 的发光强度应该相同。在材料中加入柠檬黄溶液后 ,再经提取 ,
得到的测量结果与不加柠檬黄溶液的结果发生了偏差 ,且色素的含量越高 ,偏差就越大 (图 2) 。究其原
因 ,生物发光仪对 ATP 的测量 ,是检测样品中的 ATP 在荧光素2荧光素酶的作用下所发出的荧光强度 ,
细菌 ATP 提取液的颜色越深 ,光子的淬灭就越严重 ,对发光强度的影响就越大 ,因此在进行 ATP 生物发
光测定时必须考虑颜色对测量效果的影响。
图 2 　样品提取液颜色对发光强度的影响
Fig. 2 　Effects of liquor color on
bioluminescence
图 3 　细菌总数与细菌 ATP发光强度的关系
Fig. 3 　The relation between bioluminesce
degree and total bacterial count
214 　ATP的发光强度与样品含菌量的相关性分析
以细菌菌落总数的对数值为横坐标、细菌 ATP 发光强度的对数值为纵坐标作图 ,得到的 3 条回归
方程分别是 : Y葱粉 = 114369 x - 31284 , Y胡椒粉 = 013203 x + 214467 , Y辣椒粉 = 011954 x + 211961。经统计分
析 ,在ν= 3 时 , r0105 = 0187、r0101 = 0196 ,而 3 种供试材料的 r 值分别为 r葱粉 = 0198、r胡椒粉 = 0198、r辣椒粉 =
0199 ,它们都大于 r0101 ,说明 3 种供试材料的细菌 ATP 的发光强度与细菌菌落总数都呈极显著的相关 ,
即 ATP 生物发光测试技术与常规的细菌培养方法有很好的相关性。图 3 中 3 条曲线的斜率有所不同 ,
主要是由于样品溶液带有的颜色不同。
3 　小结与讨论
结果表明 :在不需添置任何复杂设备的情况下 ,从待测样品的制备到细菌 ATP 的提取 ,直至 ATP 发
光强度的检测 ,整个过程可在 1～2h 内完成 ,具有快速、简便的特点 ,可以满足一般辐照加工企业对材料
初始含菌量快速检测的要求。且细菌 ATP 发光强度与供试材料的初始含菌量达到极显著的正相关 ,说
明 ATP 生物发光测试技术与常规的细菌培养方法有很好的相关性。但在测试过程中应考虑到细菌ATP
提取液的颜色对测试结果的影响。
482 核　农　学　报 19 卷
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