全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 012018205
60 Coγ辐照对莱芜姜当代生长的影响
周　明　黄金丽　韦玉霞　关秋竹　张振贤
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京　100094)
摘 　要 :本试验以莱芜姜根茎为材料 ,用60 Coγ射线进行了 0、20、40 和 60Gy 4 个不同剂量的辐照处理 ,研
究结果表明 :辐照使莱芜姜当代 (VM1 ) 成苗率降低 ,出苗、展叶时间延迟 ,生长受到明显抑制 ,且随剂量
的增加 ,其抑制作用增强 ;对辐照当代植株进行 POD、EST同工酶和 RAPD 检测分析 ,均得到了与对照不
同的差异性谱带 ,说明辐照生姜根状茎可以使植株在分子水平上发生变异 ;莱芜姜根茎使用 LD30～40 的
中等剂量比较合适 ,适宜辐照剂量为 20～30 Gy。
关键词 :姜 ;根茎 ;辐照效应 ;RAPD ; 同工酶
BIOLOGICAL EFFECTS OF 60 Coγ2IRRADIATION ON LAIWU GINGER VM1 GROWTH
ZHOU Ming 　HUANGJin2li 　WEI Yu2xia 　GUAN Qiu2zhu 　ZHANG Zhen2xian
( College of Agronomy and Biotechnology , China Agriculture University , Beijing 　100094)
Abstract :Rhizome of Laiwu ginger were treated withγ2irradiation at the doses of 0 , 20 , 40 and 60 Gy. The results showed
that 60 Co γ2irradiation inhibited the rhizome burgeoning , and decreased the survival rate of the seedlings , rate of leaf2
expansion and the growth of plants (VM1 ) . The inhibition effects became stronger with the increase of the irradiation dose.
Different bands were found through the analysis of POD、EST isozymes and RAPD of VM1 plants ,which showed that variation
on molecular level occurred in VM1 plants. LD30～40 was appropriate for the irradiation of rhizomes of Laiwu ginger and the
optimal irradiation dose was about 20～30 Gy.
Key words :ginger ; rhizome ; irradiation effect ;RAPD ;isozyme
收稿日期 :2007201222 　接受日期 :2007204209
基金项目 :国家科技支撑计划项目 (2006BAD13B06)和农业部结构调整重大技术研究专项 (04206202B)资助
作者简介 :周　明 (19812) ,男 ,硕士研究生 ,主要从事蔬菜生理与细胞生物学方面的研究。E2mail :zhouming1981 @126. com
通讯作者 :张振贤 (19562) ,男 ,博士 ,教授 ,主要从事蔬菜生理与分子生物学方面的研究。E2mail :zhangzx @cau. edu. cn ;Tel : 010262731952　　姜 ,亦称黄姜 ,为姜科姜属多年生草本植物 ,多作一年生栽培 ,以根状茎作为产品器官 ,是集香辛调料、食品加工、中药和蔬菜为一体的重要经济作物。姜以根状茎为繁殖材料 ,而无法用有性杂交的方法培育新品种 ,长期无性繁殖会造成种性退化 ,因此改良和创新姜种质资源具有重要意义。辐照诱变育种是培育无性繁殖作物新品种的重要手段之一 ,也是当前国际上突变育种的热门研究领域[1 ] 。60 Coγ辐照是选育无性繁殖植物新品种应用最为广泛的诱变手段。通过60 Coγ辐照提高变异频率以获得新品种的研究在姜植物上尚未见报道。本研究对无性繁殖的姜根状茎进行60 Coγ辐照处理 ,以研究辐 照对姜的生长、生化 (同功酶)和分子方面的辐照效应 ,并筛选适宜的辐照诱变剂量 ,以期为姜辐射诱变育种提供技术支撑。1 　材料与方法111 　材料选择无病、新鲜、芽体饱满充实的莱芜姜 ( Zingiberofficinale Rosc. ) ,每个姜块质量 100～125g ,在 28 ℃～30 ℃进行催芽。挑取芽长 110 ～ 115cm , 粗 015 ～018cm ,带 1～2 个芽的姜块作为辐射材料。112 　试验设计与方法
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11211 　试验设计 　对选择好的姜块用60 Coγ射线处
理 ,剂量分别为 : 0 ( CK) 、20、40 和 60Gy , 剂量率为
11467GyΠmin ,辐照处理在中国农业科学院原子能利用
研究所进行。每剂量处理 15 个姜块 ,处理后大田种
植 ,常规管理。于苗期调查统计各处理出苗和展叶时
间 ,展叶后测量计算叶片和株高生长量 ,收获时统计成
苗率及相关生长指标 ,在旺盛生长期对各处理植株进
行过氧化物酶 ( POD) 、酯酶 ( EST) 同工酶酶谱和 RAPD
检测分析。
11212 　同工酶分析 　参考胡能书等的方法[2 ] 。取叶
片约 013g ,加入 1ml 样品提取液 (011molΠL Tris2HCl ,pH
810) ,冰浴条件下研磨成匀浆 ,于 12000rΠmin 下离心
15min ,上清液即为酶粗提液 ,4 ℃备用。电泳采用垂直
板式聚丙烯酰胺凝胶电泳。缓冲系统为 Tris2甘氨酸系
统 (pH 813) ,分离胶浓度为 10 %(pH 819) ,浓缩胶浓度
为 4 % (pH 618) ,蛋白上样量为 50μg ,初始电流为
40mA ,前沿进入分离胶后稳流在 65mA ,4 ℃低温下电
泳。POD 同工酶采用醋酸联苯胺法染色 , EST 同工酶
采用醋酸萘酯 - 坚固兰 RR 盐染色法。测量计算各材
料的 POD 和 EST 酶带迁移率 ( Rf ) 。Rf = 酶带迁移距
离Π前沿指示剂距离。
11213 　RAPD 分析 　采用常规 CTAB 法提取 DNA[3 ] 。
PCR 反应物体积为 1215μl , 内含缓冲液 ( Tris2HCl
10mmolΠL , KCl 50mmolΠL , 1 % Triton2100 ) , MgCl2
20mmolΠL , dNTP 200mmolΠL , 1U Taq 酶 , 012μmolΠL 随
机引物 , 50ng 样品 DNA。PCR 反应程序 : 先 94 ℃
5min ;再 94 ℃30s , 35 ℃1min , 72 ℃2min , 进行 40 个循
环 ;最后 72 ℃5min。产物于 115 % 琼脂糖凝胶和 1 倍
TAE 电极缓冲液条件下电泳分离 , EB 染色 ,用凝胶成
像系统照像并分析。
2 　结果与分析
211 　辐照对莱芜姜出苗及成活率的影响
从表 1 可以看出 ,辐照后 ,莱芜姜出苗和展叶时间
明显延迟 ,在 20～60Gy 范围内 ,随剂量增加 ,延迟作用
增强 ,成苗率明显降低。成苗率与辐照剂量间呈很好
的线性关系 ,相关系数为 0198 ,计算其半致死剂量
(LD50 )为 40Gy。
表 1 　辐照对莱芜姜出苗和成苗率的影响
Table 1 　Effect of different dose irradiation on the seedlings burgeon and the survival rate of seedlings of Laiwu ginger
剂量
dose
( Gy)
处理根茎数
No. of rhizomes of
treatments
出苗时间
time for seedlings
burgeon(d)
展叶时间
time for leaf2
expansion(d)
成活株数
number of
survivals
成苗率
survival rate of
seedlings( %)
CK 15 13180 ±0158b 24182 ±0153c 15 100
20 15 22100 ±2197a 32167 ±2133ab 11 73133
40 15 27160 ±1169a 39140 ±1196a 7 46167
60 15 26120 ±2129a 40158 ±2169a 5 20
212 　辐照对莱芜姜 VM1 代生长的影响
从图 1、图 2 和图 3 可以看出 ,辐照后姜植株的高
度、叶片数量、叶面积虽然都随时间呈增加的趋势 ,但
随辐照剂量的增加苗期生长量的增长速度明显降低 ,
生长量也明显降低。
至收获时 ,各处理的植株生长指标个体间的差异
明显大于对照 ,其株高、茎粗、节间距、单株叶片数、单
株叶面积、单株分枝数和单株根茎鲜重均小于对照 ,且
随辐照剂量的增加而逐渐降低 (表 2) 。
213 　莱芜姜 VM1 代变异检测分析
21311 　同工酶酶谱分析 　与对照相比各处理间均有
部分植株的 POD 和 EST 同工酶酶谱出现了差异性谱
带 (图 4、表 3) 。20Gy 处理的植株 (图 4A) POD 同工酶
酶谱比对照少了迁移率 ( Rf ) 为 0122 和 0125 谱带 ,却
多了 0129 的谱带 ,12 号 (40Gy 处理 ,图 4B) 和 19 号植 图 1 　不同辐照剂量对莱芜姜苗期株高的影响Fig. 1 　Effect of different dose irradiation on theshoot height of Laiwu ginger seedling株 (60Gy 处理 ,图 4B) POD 同工酶酶谱也均比对照多了Rf 为 0129 的谱带 ;6 号植株 (20Gy 处理 ,图 4C中) EST同工酶酶谱相比对照多了 Rf 为 0127 和 0139 的谱
91　1 期 60Coγ辐照对莱芜姜当代生长的影响
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　　　　　　 表 2 　辐照对莱芜姜收获期生长指标的影响
Table 2 　Effect of different dose irradiation on the growth of Laiwu ginger in harvest stage
剂量
dose
( Gy)
株高 shoot height (cm) 茎粗 stem diameter (cm) 节间距 internodal length (cm) 单株叶片数 number of leaves per plant
平均
average
变幅
variation range
平均
average
变幅
variation range
平均
average
变幅
variation range
平均
average
变幅
variation range
CK 62131 54166～66153 0194 0185～1107 3175 3105～4181 78133 65～87
20 17162 13134～31123 0174 0141～0196 2182 1124～4104 28182 13～41
40 16138 13168～26152 0161 0131～0192 2141 1132～3196 17171 9～33
60 14156 11189～21143 0159 0136～0184 2155 1166～3177 13140 9～28
剂量
dose
( Gy)
单株叶面积 leaf area per plant (cm2) 单株分枝数 number of branches per plant 单株根茎鲜重 fresh weight of the rhizome per plant (g)
平均
average
变幅
variation range
平均
average
变幅
variation range
平均
average
变幅
variation range
CK 1292178 1182173～1434. 95 6180 5～8 462153 305120～531. 50
20 324187 181134～510. 56 4109 3～6 95133 55112～170. 40
40 189123 95196～376. 46 3186 3～6 46152 37157～73. 35
60 126153 78198～296. 94 2180 2～5 - -
图 2 　不同剂量辐照对莱芜姜苗期叶片数的影响
Fig. 2 　Effect of different dose irradiation on the
shoot height of Laiwu ginger seedling
图 3 　不同剂量辐照对莱芜姜苗期叶面积的影响
Fig. 3 　Effect of different dose irradiation on the
shoot height of Laiwu ginger seedling
表 3 　对莱芜姜辐照当代的 POD 和 EST 同工酶检测
Table 3 　The POD and EST isoenzyme analysis of Laiwu
ginger treated with different dose irradiation
剂量
dose
( Gy)
供试材
料数
Number of
meterials
出现差异谱带植株数
number of plants with
different bands
出现差异谱带植株所占比率
rate of plants with
different bands ( %)
POD EST POD EST
CK 15 0 0 0 0
20 11 5 4 45 36
40 7 2 3 29 43
60 5 2 2 40 40
带 ,17 号植株 (40Gy 处理 ,图 4D 中) EST同工酶酶谱比
对照少了 Rf 为 0131 的谱带 ,22 号植株 (60Gy 处理 ,图
4D 中) EST 同工酶酶谱比对照多了 Rf 为 0127 的谱
带。
21312 　RAPD 分析 　用筛选的 6 个随机引物对对照和 辐照材料进行了 RAPD 分析 ,发现各辐照处理均有部分植株与对照间存在稳定多态性差异 ,见图 5 和表 4。在 S163 引物扩增结果 (图 5A) 中 ,6 号植株 (20Gy 处理)比对照少了大小为 450bp 和 2000bp 的谱带 ;17 号植株 (40Gy 处理) 比对照少了大小为 220bp 和 2000bp的谱带。在 S1053 引物扩增结果 (图 5B) 中 ,6 号植株(20Gy 处理) 比对照少了大小为 1600、2000、2200 和2400bp 的谱带 ,却多了 220bp 的谱带 ;7 号植株 (20Gy处理) 比对照多了大小为 1400bp 的谱带 ; 17 号植株(40Gy 处理)比对照少了大小为 1000bp 的谱带 ,多了大小为 220bp 的谱带 ;21 号植株 (60Gy 处理) 比对照多了大小为 1500bp 的谱带。在 S2156 引物扩增结果 (图5C)中 ,4 号 (20Gy 处理) 、17 号 (40Gy 处理) 和 20 号植株 (60Gy 处理)比对照均少了大小为 250bp 和 200bp 的谱带。
02 核　农　学　报 22 卷
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图 4 　莱芜姜辐照当代 POD(A 和 B)和 EST(C和 D)同工酶电泳图谱
Fig. 4 　The electrophoresis results of POD (A and B) and EST (C and D) of VM1 plants of Laiwu ginger
1～11 : 20Gy 辐照 ;12～18 : 40Gy 辐照 ;19～23 : 60Gy 辐照。下图同
1～11 :20Gy irradiation ;12～18 :40Gy irradiation ;19～23 :60Gy irradiation. The same as following Figures.
图 5 　引物 S163 (A) 、S1053 (B)和 S2156 (C) 对莱芜姜辐照当代的 RAPD 扩增结果
Fig. 5 　PCR amplified patterns by S163 (A) , S1053 (B) and S2156 (C) primer in VM1 plants of Laiwu ginger
12　1 期 60Coγ辐照对莱芜姜当代生长的影响
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表 4 　六种引物对莱芜姜辐照当代的 RAPD 扩增结果
Table 4 　PCR amplified patterns by six primers in VM1 plants of Laiwu ginger with different irradiation doses
引物
primers
序列
sequence
供试材料数
number of meterials
出现增减带植株数
number of plants with different bands
出现增减带植株所占比率
rate of plants with different bands( %)
CK 20Gy 40Gy 60Gy 20Gy 40Gy 60Gy 20Gy 40Gy 60Gy
S163 CAGAAGCCCA 1 11 7 5 1 1 0 9 14 0
S502 CACAGCTGCC 1 11 7 5 1 1 0 9 14 0
S516 CTCTGCGCGT 1 11 7 5 2 1 1 18 14 20
S1053 CAGCCGTTCC 1 11 7 5 2 1 2 18 14 40
S2008 CCACAGCCGA 1 11 7 5 1 1 0 9 14 0
S2156 CTGCGGGTTC 1 11 7 5 2 2 2 18 29 40
3 　讨论
本试验结果表明 ,在 20～60Gy 的范围内对姜萌芽
的根状茎进行辐照处理 ,在一定程度上抑制了姜的生
长 ,VM1 代植株各处理间均发现了叶形、叶色和叶脉异
常、叶序对生、株体矮化等植株 ,在生化和分子方面也
产生了变异。
本试验对姜辐照的适宜剂量也进行了研究 ,表明
利用致死效应来确定适宜的莱芜姜辐照剂量比其他指
标 (如致矮效应) 更简单实用 ,采用使莱芜姜成活率达
60 %以上 (即LD30～40) 的中等剂量比较合适 ,适宜辐
照剂量为 20～30Gy ,这既保证了一定的选择几率又保
证了较高的突变频率。
无性繁殖植物诱变育种 ,在观赏植物上应用较
多[4～8 ] ,而在根茎类农作物 ,如甘薯、马铃薯等方面应
用较少[9 ,10 ] 。关于姜辐射育种的研究尚未见报道 ,仅
检索到其近缘植物姜黄的一篇相关研究[11 ] 。同工酶
和 RAPD 分析技术近年来常被用于辐射突变体的检测
研究[11～13 ] 。本试验中利用 POD、EST 同工酶和 RAPD
检测分析发现 ,经过辐照的莱芜姜一部分可能已经发
生了基因突变。虽是否为有益变异有待进一步验证 ,
但这说明通过辐照姜根茎可以产生较高的突变率 ,以
此诱变选育新品种是可能的。同时 ,这也可以丰富姜
种质资源 ,为间接利用突变体来改良和选育新品种提
供了条件。
参考文献 :
[ 1 ] 　赵孔南等编著. 植物辐射遗传育种研究进展 , 北京 :原子能出版
社 , 1990 , 1～12
[ 2 ] 　胡能书 , 万贤国. 同工酶技术及其应用. 长沙 : 湖南科学技术出
版社 , 1985 , 70～85
[ 3 ] 　傅荣昭 , 孙勇如 , 贾士荣 , 等. 植物遗传转化技术手册. 北京 :
中国科学技术出版社 ,1994 , 131～137
[ 4 ] 　牛传堂 , 李雅志. 美人蕉 ( Canna. L) 的辐照诱发突变. 核农学
报 , 1988 ,2 (1) : 33～39
[ 5 ] 　史燕山 , 骆建霞 , 赵国防 , 等. 晚香玉 60Coγ射线辐照诱变适宜
剂量的研究. 园艺学报 , 2003 , 30 (6) : 748～750
[ 6 ] 　秦　华. γ射线辐照水仙花鳞茎对植株生长与开花的影响. 核农
学报 ,2005 ,19 (5) :360～362
[ 7 ] 　陈秀兰 , 包建忠 ,等. 观赏荷花辐照诱变育种初报. 核农学报 ,
2004 ,3 :201～203
[ 8 ] 　敖　妍 ,张国盛 ,鲁韧强 ,潘青华. 扶芳藤种子与枝条的60 Coγ辐
照效应. 核农学报 ,2006 , 3 :202～204
[ 9 ] 　Das A , Gosal S , et al . Dhaliwal Induction of mutations for heat
tolerance in potato by using in vitroculture and irradiation. Euphytica ,
2000 , 114 : 205 - 209.
[10 ] 　王玉萍 , 刘庆昌 , 翟　红. 离子束对甘薯胚性悬浮细胞团的辐照
诱变效应. 作物学报 , 2005 , 31 (4 ) :519～522
[11 ] 　胜　利. 姜黄辐照育种阶段性 (苗期) 报告. 益阳职业技术学院
学报 , 2005 , 3 :63～64
[12 ] 　林宝刚 ,张明龙 ,等. 辐照处理新雄性不育系过氧化物酶和脂酶
同工酶分析. 核农学报 ,2005 ,4 :304～306
[13 ] 　张明龙 ,林宝刚 ,等. 甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育的遗传及
RAPD 标记. 核农学报 ,2004 ,6 :427～430
[14 ] 　贾月慧 ,张克中 ,等. 辐照亚洲百合‘pollyanna’雄性不育突变体的
RAPD 分析. 核农学报 ,2005 ,1 : 29～32
[15 ] 　任　　 ,牛西午 ,王世研 ,韩美洁. 氮离子束注入谷子种子后代基
因组的 RAPD 分析. 核农学报 ,2006 ,4 :259～262
22 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (1) :18～22
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