全 文 ：　文章编号 :100028551 (2000) 062337205
固氮球形芽孢杆菌与巨大
芽孢杆菌的混合增效作用
龙　苏1 ,2 　李法峰2 　陈　明2 　林　敏2
(11 湖南医科大学　湖南 长沙　410078 ; 21 中国农业科学院原子能利用研究所　北京　100094)
摘要 :球形芽孢杆菌 Bs7 与巨大芽孢杆菌 Bm101 混合培养时具有固氮增效作用。稀
释 400 倍的巨大芽孢杆菌的无菌上清液与球形芽孢杆菌共培养 ,同样能增强后者的
固氮活性。Bs7 (pAB576)在纯培养时的 nifA 表达活性为 684915 Miller 单位 ,与巨大
芽孢杆菌上清培养液进行混合培养时的表达活性为 750014 Miller 单位。上述结果
表明 :某些微量非碳源的活性分泌物和某些固氮调节基因可能在固氮增效作用中起
重要作用。在与水稻联合培养条件下 ,混合接种球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌可以
提高固氮菌在水稻根表的定殖能力。
关键词 :球形芽孢杆菌 ;巨大芽孢杆菌 ;混合培养 ;nifA2lacZ融合基合
收稿日期 :2000208218
作者简介 :龙苏 ,女 , (1964～) ,四川大学生物系生化专业毕业 ,讲师 ,现从事生物化学研究
球形芽孢杆菌 Bs7 与巨大芽孢杆菌 Bm101 均分离自我国华北地区水稻根际 ,具有较高的
固氮能力。在对球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌研究中曾发现两菌在共培养时有显著的固氮混
合增效现象 ,但增效机制尚不清楚。丘元盛等曾报道 ,粪产碱菌 A15 与阴沟肠杆菌 E26 混合
培养时具有明显的固氮增效作用[1 ] 。另据国外学者的报道[2 ,5 ] ,小麦和水稻等作物混合接种
固氮菌 ,其接种的促生或增产效果明显优于单一菌株接种[2 ,3 ] 。已有的研究证据表明 ,固氮混
合增效是一种代谢的协同作用 ,通过混合培养使不同菌种相互作用 ,相互提供营养或通过一些
物理、生化机制相互刺激 ,从而促进固氮菌固氮能力的提高[4 ,5 ] 。本文针对联合固氮菌混合增
效现象 ,在生化和基因表达水平上开展固氮混合增效的有关机制研究。
1 　材料与方法
球形芽孢杆菌 Bs7 和巨大芽孢杆菌 Bm101 采用 Dobereiner 限制性培养基进行培养[1 ] ,培
养基配方与培养条件参见林敏等[8 ]的方法。供体菌 E. coli S17. 1 (pAB576) 的培养介质为含
卡那霉素 ( Km50) 和四环素 ( Tc10) 的 LB 培养基。球形芽孢杆菌的 nifA 接合子在含有卡那霉素
( Km50)和四环素 ( Tc10)的 Dobereiner 限制性培养基中生长。试验中所用的菌株和质粒见表 1。
球形芽孢杆菌与 E. coli S17. 1 (pAB576)的接合实验按 Rhijn 等方法进行[6 ] 。在含有卡那
霉素 ( Km50)和四环素 ( Tc50)的 Dobereiner 培养介质中筛选接合子。接合子β2半乳糖苷酶活性
测定参照 Miller 方法[7 ] 。固氮酶活性测定按照林敏等的方法进行[8 ] 。
733　核 农 学 报　2000 ,14 (6) :337～341Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
表 1 　试验所用菌株和质粒
Table 1 　Strains and plasmids used in experiments
菌株和质粒
strains and plasmids
基因型或表型
genetypes/ phenotypes
来源或文献
sources of references
B . megaterium Bm101 wild type this lab
B . sphaerium 　Bs7 wild type this lab
Bs17 nifA2lacZ conjugatant this study
pAB576 Kmr Tc r ,Azospirillum brasilense Liang et al ,1992 [10 ]
nifA2lacZ gene fusion
2 　结果与分析
211 　纯培养及混合培养条件下 ,细菌乙炔还原活性的测定
在相同的条件下 ,球形芽孢杆菌 Bs7 与巨大芽孢杆菌 Bm101 混合培养体系的乙炔还原活
性为 337162nmol/ h·瓶 ,较 Bs7、Bm101 各单菌纯培养时的乙炔还原活性有显著提高 ,表现出
明显的增效作用 (表 2) 。将 Bs7 与稀释 400 倍的 Bm101 无菌上清液共培养 ,乙炔还原活性为
386160nmol/ h·瓶 ,明显高于 Bs7 或 Bm101 的乙炔还原活性。而 Bm101 与 Bs7 无菌上清液共
培养的乙炔还原活性和 Bm101 单菌纯培养的活性基本相同。
表 2 　球形芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的固氮混合增效作用
Table 2 　Enhanced effect of co2culture on N22fixing activity of Bs7 and Bm101
测定
determination
纯培养
pure cuture
Bs7 Bm101
共培养
co2cuture
Bs7 + Bm101 3 3 Bs7 + Bm101 上清 Bm101 + Bs7 上清
固氮活性 3
N22fixing activity 17416 0182 33716 38616 119
　　3 活性单位 :nmol C2H4/ h·瓶 ;3 3 Bs7 与 Bm101 两菌共培养 ;上清 :菌体培养后提取的无菌上清液3 activity units :nmolC2H4 produced/ h·vial ;3 3 co2culture of Bs7 and Bm101 ;supernatant :cell2free supernatant .
212 　混合培养液中 Bs7 和 Bm101 菌体比例的确定
在固氮条件下 ,分别对 Bs7、Bm101 进行单独及混合培养 ,在混合培养的初始阶段 ,Bs7 与
Bm101 的活菌比例约为 1∶1152 ,培养 54h 后 ,Bs7 成为混合体系中的优势菌种 ,Bs7 与 Bm101
的活菌比例上升为 10∶1 ,与单菌纯培养的菌体相比 ,Bs7 菌体数目变化不大 ,Bm101 的数量下
降幅度较大 ,明显少于纯培养 (表 3) 。这一结果表明 ,Bs7 与 Bm101 混合培养时 ,固氮活性的
增效作用不是由于混合体系中 Bs7 数目的增加 ,可能是由于 Bs7 单菌固氮能力提高所致。
213 　混合培养过程中异源 nif A2lacZ在球形芽孢杆菌中的表达
利用两亲接合方式 ,将巴西固氮螺菌的异源 nifA2lacZ 融合基因转入球形芽孢杆菌中 ,在
固氮条件下对异源 nifA2lacZ的表达进行测定 ,结果表明 ,Bs7 (pAB576) 在进行纯培养时 ,nifA
的表达活性为 684915 miller 单位 ,而与巨大芽孢杆菌上清培养液进行混合培养时的表达活性
为 750014 miller 单位 ,明显高于接合子 Bs7 (pAB576) 在纯培养时的表达活性。这说明混合体
833 核　农　学　报 14 卷
系中固氮酶活性的提高可能是由于巨大芽孢杆菌在代谢过程中产生一些信号因子 ,使球形芽
孢杆菌 nifA 的正调节功能增强所致。
表 3 　混合培养液中 Bs7 和 Bm101 的菌体数目
Table 3 　Bacterial number of Bs7 and Bm101 in co2culture or pure culture
菌株
strains
接种量
initial inoculant
(cells/ ml)
混合培养 54h
co2culture for 54h
(cells/ ml)
纯培养 54h
pure culture for 54h
(cells/ ml)
Bs7 1113 ×105 3143 ×107 (9019 % 3 ) 4121 ×107
Bm101 1172 ×105 3140 ×106 (911 %) 3185 ×107
　　3 百分数 ( %)指混合培养体系中 Bs7 或 Bm101 的菌体数目分别占总菌数的百分比。3 percentage of the number of Bs7 or Bm101 (cells/ ml) to the total number of bacteria in co2culture.
表 4 　共培养条件下异源 nif A2lacZ在球形芽孢杆菌 Bs7 中的表达
Table 4 　The expression of nifA2lacZ gene fusion in co2cuture of Bs7 and Bm101
菌株
strains
培养条件 culture condition (miller units)
纯培养 pure culture 混合培养 co2culture
Bs7 (wild type) 118 213
Bs17 (pAB576) 684915 750014
　　注 :测定数据为 5 次重复的平均值
Note :average of five duplication
214 　球形芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌在水稻根表的定殖
本研究采用单接种与混合接种两种方式 ,对球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌在水稻根表的
定殖状况进行了研究 ,结果表明 ,经 14d 培养后 ,球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌在水稻根表均
有较强的定殖能力 ,分别为 3133 ×108/ g 鲜根重和 5168 ×108/ g 鲜根重 ;混合接种后 ,球形芽
孢杆菌在水稻根表达到 8134 ×108/ g 鲜根重 ,巨大芽孢杆菌的定殖能力下降了约 10 倍 ,仅为
3182 ×107/ g 鲜根重。
表 5 　不同条件下球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌在水稻根表的定殖
Table 5 　The colonization of Bs7 and Bm101 on the rice root surface under different conditions
菌株
strains
接种量
initial inoculant
(cells/ ml)
混合培养 14d
co2culture for 14days
(cells/ ml)
纯培养 14d
pure culture for 14 days
(cells/ ml)
Bs7 1113 ×105 8134 ×108 3133 ×10 \ + 8
Bm101 1172 ×105 3182 ×107 5168 ×108
215 　接种联合固氮菌对水稻根毛的刺激效应
由扫描电镜结果可以看出 ,未接种联合固氮菌时 ,水稻根尖端的根毛粗而短 ,单位面积内
的根毛数量相对较少 ,将球形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别进行单接种及混合接种后 ,根毛变
得细长 ,根毛数量增多 ,说明接种联合固氮菌对水稻根毛的生长具有一定的促进作用。
933　6 期 固氮球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌的混合增效作用
3 　讨 　论
311 　球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌混合培养的固氮混合增效作用
巨大芽孢杆菌和球形芽孢杆菌分离自我国北方稻田分离的水稻根际联合固氮菌 ,具有较
高的固氮酶活性。我们在实验中发现这两种菌的混合培养能促进混合体系的固氮能力。测定
结果表明 :混合培养体系中 ,球形芽孢杆菌处于优势地位 ,并对混合体系中固氮酶活性的增加
起着主导作用。但是球形芽孢杆菌在混合培养过程中的优势地位 ,并不表明混合体系固氮酶
活性的增加是由其数目增加造成的 ,因为在相同培养条件下 ,并未发现混合培养体系中芽孢杆
菌的数目多于纯培养。
多菌株混合培养时各菌之间存在着代谢的协同作用[1 ,5 ] 。研究表明 :混合培养时各菌之
间可能进行直接或间接地相互作用 ,互相提供所需的营养 ,转移或消除抑制产物 ,或通过一些
物理或生化机制刺激彼此间的生理活动[9 ] 。将稀释 400 倍的 Bm101 无菌上清液与 Bs7 共培
养 ,同样能提高 Bs7 的固氮酶活性 ,这说明固氮混合增效作用不仅是营养代谢互补 ,还可能与
某些微量生理活性物质有关。由于实验条件的限制 ,我们未能就巨大芽孢杆菌上清液中存在
的这种生理活性物质作进一步定性和定量分析。通过对异源 nifA2lacZ 融合基因在 Bs7 中的
表达活性测定 ,说明固氮增效作用可能与菌体某些基因的表达有关。这也说明混合增效作用
不仅表现在酶活性水平上 ,而且还表现在基因表达的调控水平上。因而 ,今后从遗传控制角度
对混合培养的固氮增效作用进行更深入的研究是十分必要的。
312 　接种联合固氮菌的促生长效应
研究表明 ,根际联合固氮菌在植物根部的成功定殖是发挥期固氮功能的先决条件。对固
氮菌来说 ,不同联合固氮菌在根际的定殖能力不尽相同 ,球形芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌混合接
种后 ,菌体在水稻根表的定殖能力明显增加 ,这有可能与混合接种后 ,菌体对水稻根系分泌物
的利用能力提高或趋化能力增强等因素有关 ,这值得进行更深入的研究。
参考文献 :
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THE ENHANCED EFFECT OF CO2CULTURE ON NITROGEN2FIXING
ACTIVITY OF B . sphaerium AND B . megaterium
LON G Su1 ,2 　L I Fa2feng2 　CHEN Ming2 　L IN Min2
(11 Hunan Medical U niversity , Changsha Hunan prov . 410078 ;
21 Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , CSSA , Beiji ng 　100094)
ABSTRACT :The enhanced effect of B . sphaerium Bs7 co2cultured with B . megaterium Bm101
on nitrogen2f ixing activity was observed. The cell2free supernatant from pure cuture of Bm101 ,
which was diluted 400 times ,could enhance the nitrogen2f ixing activity of Bs7 . The expressional
activities of nif A2lacZ transcriptional gene in Bs7 was increased obviously during co2culture of
Bs7 and Bm101 . The enhanced effect on nitrogen2f ixing activity is not only associated with
metabol ism ,but also with some bioactive materials or some regulatory genes , which may play im2
portant roles in enhancing nitrogen2f ixing activity of co2culture. Co2inoculation of Bs7 and
Bm101 could stimulate colonization of both bacteria to rice roots.
KEY WORDS :B . sphaeri um Bs7 ; B . megateri um Bm101 ; co2culture ; nifA2lacZ gene fusion
·会讯·
中国原子能农学会第四届全国核农学青年科技工作者暨第十一届中南地区核农学学术交
流会于 2000 年 10 月 21～25 日在湖南省召开。来自全国的 53 位代表参加了会议。并提交论
文。
中国原子能农学会常务副理事长张保明致开幕词。20 名代表 (其中 16 人为青年科技工
作者)在大会上做了学术报告。会议不仅交流了近几年来核农学领域的科研、管理、开发等方
面所作的工作和取得的成绩 ,而且提出了设想 ,学术气氛活跃。
通过交流 ,代表们一致认为 ,要发扬传统 ,学习老一辈核农学专家的实干精神 ,求实创新、
珍惜时光 ,为 21 世纪的核农学发展做出贡献。经会议讨论初步决定 ,第五届全国核农学青年
科技工作者学术交流会由江西省原子能农学会承办。中南第十二届核农学学术交流会由湖北
省原子能利用研究所承办。
(中国原子能农学会 　董雅琪)
143Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (6) :337～341