全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 022120204
小麦抗秆锈突变系龙辐 03D51 的筛选及其抗
病性的遗传分析与 RAPD 标记
孙　岩　尹　静　王广金　张宏纪　黄景华　郭　强　刁艳玲　刘东君
(黑龙江省农业科学院作物育种研究所 ,黑龙江 哈尔滨　150086)
摘 　要 :以龙 6239 幼胚为外植体 ,利用辐射诱变和组织培养相结合的方法 ,选育出突变系龙辐 03D51 ,经
秆锈接种鉴定 ,发现其对优势小种 21C3 CPH免疫 ,而亲本龙 6239 对 21C3 CPH高度感染。遗传分析表明 ,
抗病性由显性单基因控制。该突变系还具有其亲本的优质、高产特点 ,已成为优异的后备品系。在
RAPD 检测中 ,所用的 60 个随机引物中有 3 个引物在龙辐 03D51 和其亲本龙 6239 中具有多态性 ,引物
E07、E11、E17 在龙辐 03D51 中分别扩增出 380bp、700bp 和 600bp 的特异带 ,初步认为这些谱带可能与秆
锈抗性有关。
关键词 :小麦 ;秆锈抗性 ;体细胞无性系变异 ;遗传分析 ;RAPD
BREEDING WHEAT MUTANT LONGFU 03D51 WITH RESISTING STEM RUST AND
GENETIC ANALYZATION OF RESISTING DISEASE AND RAPD MAKER
SUN Yan 　YIN Jing 　WANG Guang2jin 　ZHANG Hong2ji 　HUANGJing2hua
GUO Qiang 　DIAO Yan2ling 　LIU Dong2jun
( Crop Breeding Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences , Harbin , Heilongjiang 　150086)
Abstract :Longfu 03D51 was bred using Long 6239 immature embryo as explants through radiation mutagenesis breeding
coupled with tissue culture technique. By artificial inoculation and field breeding identified Longfu 03D51 was identified with
high resistance to dominant strain 21C3 CPH , good quality and high yield. Genetic analysis suggested that stem rust was
controlled by a single gene. The DNA polymorphism on Longfu 03D51 and its parents were studied by random amplified
polymorphic DNA (RAPD) ,3 primers out of 60 RAPD primers were found polymorphism between the Longfu 03D51 and its
parent Long 6239 , and 3 stable polyphymorphic bands amplified in Longfu 03D51 with the size of 380bp ,700bp ,600bp by
random primer E07 ,E11 ,E17 , respectively. Genetic and RAPD analysis indicated that 3 RAPD primers E07 ,E11 ,E17 might
be linked to the gene of stem rust resistance.
Key words :wheat ; resistibility to stem rust ; somaclonal variation ; genetic analysis ; RAPD
收稿日期 :2006206209
基金项目 :黑龙江省农业科学院青年基金 (0427)
作者简介 :孙岩 (19722) ,女 ,甘肃武威人 ,助理研究员 ,主要从事小麦生物技术研究。Tel :0451286668741 ; E2mail :sunyan720722 @sohu. com　　黑龙江省是我国重要的春小麦产区。小麦生产对满足人们的膳食需求、保证国家粮食安全和建立合理的轮作体系中都具有重要意义。近几年来我国在小麦新品种选育上取得了很大成绩 ,但由于种质资源匮乏 ,育种技术相对滞后 ,小麦育种尚未取得突破性进展。因此 ,改进育种方法和创造丰富的种质资源 ,尽快选育推广高产、优质、抗病和抗逆的新品种已成为当今育种 者的重要课题。辐射诱变和组织培养相结合 ,除能选育出综合性状优异的品种外 ,还能诱发单基因或少数基因的突变 ,在品种改良上具有独特作用 ,并在育种实践上得到广泛应用[1～4 ] 。本研究利用组织培养和辐射处理相结合的技术 ,对优质、高产品系龙 6239 进行改造 ,在保持品质和优
021　 核 农 学 报　2007 ,21 (2) :120～123Journal of Nuclear Agricultural Sciences
良农艺性状的基础上 ,获得了抗秆锈病的突变系龙辐
03D51。
1 　材料与方法
111 　材料
以龙 6239 纯系幼胚为外植体材料。4 个秆锈生
理小种 21C3 CKH ,21C3 CPH ,34MKG 和 34C2MKK 由沈
阳农业大学植物免疫研究所提供。
112 　方法
11211 　组织培养和辐射处理 　取龙 6239 的幼胚接
种 ,以常规方法进行组织培养。诱导培养基为 MS + 2 ,
42D 2mgΠL + 蔗糖 30gΠL + 琼脂 8gΠL ,pH518 ,暗培养 10d
左右 ,取胚性愈伤组织用 800Rad 软 X 射线照射 ,继代
1 次 ,转分化。分化培养基为 MS + KT 015mgΠL + 蔗糖
30gΠL + 琼脂 8gΠL ,pH518。幼苗移入温室培养 ,直至成
熟 ,按株收获脱粒。
11212 　秆锈病接种鉴定 　田间种植第 2 代 35 个株
行 ,每隔 5 行种 1 行原亲本龙 6239 ,正常管理。抽穗前
用秆锈小种 21C3 CKH、21C3 CPH、34MKG 和 34C2MKK
的混合菌液接种 ,保湿。经调查 ,发现 1 株高抗秆锈病
突变株 ,命名为龙辐 03D51。2004 年田间对龙辐 03D51
分别接种不同秆锈小种进行鉴定。成熟前按 Luig[4 ] 提
出的标准调查发病情况。
11213 　遗传群体的建立及遗传分析 　以突变系龙辐
03D51 为母本 (P1 ) ,亲本龙 6239 为父本 ( P2 ) 配制组合 ,
当年温室加代。翌年在田间种植遗传分析群体龙辐
03D51 (P1 ) 、龙 6269 (P2 )以及龙辐 03D51 ×龙 6239 的 F1
和 F2 群体。苗期用涂抹法接 21C3 CPH新鲜菌液 ,接种
后保湿 16h。接种 16d 左右 ,待完全发病后调查群体的
发病情况 ,统计分离群体内抗病株和感病株的株数与
比例 ,实测值与期望值的比率 ,用χ2 (卡方)进行测验。
11214 　生育特性、农艺性状考查 　小区面积 5m2 ,行
距 15cm ,保苗数 600 万Πhm2 ,3 次重复 ,随机排列 ,正常
管理。用常规方法对突变系进行生育特性、形态特征
和产量性状考察。
11215 　高分子量麦谷蛋白亚基 ( HMW2GS) 分析 　用
SDS2PAGE电泳分析高分子量麦谷蛋白亚基组成 ,对其
命名参照 Payne 等[6 ]提出的标准。
11216 　品质鉴定 　蛋白质、湿面筋、沉降值等按 NYΠ
T321982 , GBΠT1450821989 ,AACC56261A 的检测方法进
行。
11217 　RAPD 标记 　DNA 提取采用 CTAB 法。扩增中
共用 RAPD 随机引物 60 个 ,由上海生物工程公司合
成。60 个引物分别为 OPE1220、OPY1220、OPF1220。反
应体系为 15μl ,其中包括模板 DNA (30～40ng) 1μl ;
1125mmolΠL MgCl2 115μl ,10 ×PCR buffer115μl ,215mmolΠ
L dNTP 1μl ;5UΠμl Tag DNA 酶 01025μl ;10mmolΠL RAPD
引物 1μl ;补足水到 15μl ,最后加一小滴矿物油。PCR
反应程序 :95 ℃预变性 3min ;95 ℃变性 1min ,37 ℃退火
1min ,72 ℃延伸 115min ,38 个循环 ;72 ℃延伸 10min ,4 ℃
保存。取 PCR 产物 15μl 加 3μl 上样缓冲液 (6X) 于
215 %的琼脂糖电泳 ,稳压 70V ,2h。电泳结束 ,在凝胶
成像分析系统观察拍照。
2 　结果与分析
211 　突变系的抗秆锈鉴定
2003 年 田 间 抽 穗 前 用 秆 锈 小 种 21C3 CKH ,
21C3 CPH ,34MKG和 34C2MKK的混合菌液接种。调查
发现 ,在 35 个体细胞无性系变异株系中龙辐 03D51 高
抗秆锈病 ,其余株行与原亲本龙 6239 均为高感。2004
年田间对龙辐 03D51 及其亲本龙 6239 分别以不同秆
锈小种进行接种鉴定。调查发现 ,龙辐 03D51 对优势
小种 21C3 CPH免疫 ,龙 6239 则高感 ,并据此确定龙辐
03D51 为抗秆锈突变系。
212 　突变系的遗传分析
田间苗期用涂抹法对龙辐 03D51 ( P1 ) 、龙 6239
(P2 ) 及其龙辐 03D51 ×龙 6239 的 F1 和 F2 植株接
21C3 CPH小种菌液 ,发病调查表明 ,龙辐 03D51 和 F1
植株对小种 21C3 CPH 免疫 ,龙 6239 高感 ,F2 群体中对
小种 21C3 CPH 免疫的 139 株 ,高感的 46 株 ,经χ2 测
验 ,抗感比为 3∶1 (χ2 = 010018 < 3184 , P > 0105) 。据此
确定龙辐 03D51 对小种 21C3 CPH 的抗性属单基因突
变 ,显性遗传。
213 　突变系的生育特性和农艺性状
龙辐 03D51 生育期 83d 左右。幼苗半直立 ,叶色
深绿 ,分蘖力强 ,繁茂性强 ,株型较收敛。生育前期发
育较慢 ,后期发育较快。株高 95cm 左右 ,有芒 ,长方型
穗 ,黄壳 ,颖方肩 ,红粒 ,千粒重 40g 左右 ,粒角质 ,容重
810～820gΠL ,秆强抗倒伏。与原亲本龙 6239 相比 ,除
株高矮 5～6cm ,生育期短 2～3d 外 ,龙辐 03D51 的植
株长势和长相基本与原亲本相似 ,而主穗小穗数、株粒
数和千粒重等产量性状较原亲本有不同程度的改善。
在产量对比试验中 ,龙辐 03D51 平均单产 642510kgΠ
hm2 ,较原亲本增产 416 %(表 1) 。
121　2 期 小麦抗秆锈突变系龙辐 03D51 的筛选及其抗病性的遗传分析与 RAPD 标记
表 1 　龙辐 03D51 及其亲本龙 6239 的主要农艺性状与产量
Table 1 　Main agronomic characters and yield of mutant Longfu 03D51 and parent Long 6239
材料
material
株高
plant height
(cm)
穗长
head length
(cm)
主穗小穗数 (个)
spikelets
per spike
单株粒数 (个)
grains per
plant
千粒重
1000 grains
weight (g)
产量
grain yield
(kgΠhm2) ±%
龙辐 3D51 Longfu03D51 8916 ±512 712 ±017 1810 ±110 2710 ±517 3915 642216 + 416
龙 6239 Long6239 9513 ±511 711 ±018 1710 ±114 2510 ±417 3812 614210 -
214 　突变系的高分子量麦谷蛋白亚基( HMW2GS) 的
组成及品质
经 SDS2PAGE 电泳法分析 ,龙辐 03D51 的高分子
量麦谷蛋白亚基组成 ( HMW2GS) 为 1 ,7 + 8 ,5 + 10 ,与
亲本龙 6239 相同。
品质分析结果列于表 2。由表 2 看出 ,龙辐 03D51
的主要品质性状与原亲本龙 6239 相比 ,蛋白质含量、
湿面筋含量、沉降值、吸水率有不同程度的下降 ,但稳
定时间和评价值都高于原亲本。其的综合品质指标达
到了强筋小麦标准。
表 2 　龙辐 03D51 与其亲本龙 6239 的主要品质性状
Table 2 　Main quality character of mutant Longfu 03D51 and parent Long 6239
蛋白质
protein
( %)
湿面筋
wet gluten
( %)
沉降值
sedimentation
value (ml)
吸水率
water absorption
( %)
形成时间
building up time
(min)
稳定时间
stability time
(min)
评价值
opinion score
龙辐 03D51 Longfu 03D51 16189 3613 5912 5315 617 1415 69
龙 6239 Long 6239 17185 4012 6613 5719 615 918 67
差值 difference - 0196 - 319 - 711 - 414 + 012 + 417 + 2
215 　突变系的 RAPD 检测
在 RAPD 检测中共用了 60 个引物 ( Y1～Y20 、E1～
E20 、F1 ～ F20 ) 对龙辐 03D51 及其亲本龙 6239 的叶片
DNA 进行扩增 ,其中两者共有的谱带 124 条 ,引物
E07、E11、E17 在抗病系龙辐 03D51 和感病亲本龙 6239
中存在多态性的差异 ,在抗病系龙辐 03D51 分别扩增
出 380bp、700bp 和 600bp 的特异带 (见图 1) ,而在感病
材料中均未扩出此特异带 ,初步认为该谱带可能与秆
锈抗性有关。
图 1 　引物 E07、E11 和 E17 扩增龙辐 03D51 和龙 6239DNA 的多态性
Fig. 1 　Polymorphisms from DNA between mutant Longfu 03D51 and Long 6239 amplified with primer E07 , E11 and E17
单数为龙辐 03D51 ,双数为龙 6239 ;左图中 1 ,2 和 9 ,10 分别为引物 E07 和 E11 引物扩增结果 ,右图中 9 ,10 为 E17 引物扩增结果。
Electrophoresis of odd number is Longfu 03D51 , even number is Long 6239. No. 1 & 2 in left figure were amplified by primer E07 ,
and No. 9 & 10 in left figure were amplified by primer E11. No. 9 & 10 in right figure were amplified by primer E17.
3 　讨论
311 　小麦幼胚等外植体经组织培养后可产生丰富的
体细胞无性系变异。这些变异丰富了小麦的种质资
源 ,并取得了令人瞩目的育种成效[1～3 ,6 ] 。辐射处理与
组织培养结合 ,可以提高体细胞无性系变异频率 ,为作
物育种提供了广阔的选育空间[7～9 ] 。本研究中 ,以龙
6239 幼胚为外植体 ,利用组织培养与辐射相结合的方
法选出的体细胞无性系变异系龙辐 03D51 ,不仅对秆
221 核　农　学　报 21 卷
锈病优势小种 21C3 CPH免疫 ,而且与亲本龙 6239 相比
在熟期、株高等方面有较大改进 ,这表明幼胚培养中的
胚性愈伤组织经软 X 射线照射 ,可诱变多个基因突
变。龙辐 03D51 已成为高产、抗病、优质的后备品系。
312 　龙辐 03D51 对秆锈优势小种 21C3 CPH免疫 ,而亲
本龙 6239 对该小种高感 ,经遗传性质分析其抗病性为
单基因突变。目前已公布的抗秆锈基因中正式命名的
有 50 个 ,暂定名的有 28 个 ,并被分别定位于相应的染
色体上[10 ] 。本研究中获得的抗秆锈基因是否属于正
式命名和暂定名的 ,或新出现的 ,还需深入研究。
313 　从本研究看出 ,在 RAPD 检测中共用 60 个引物 ,
其中引物 E07、E11、E17 在抗病系龙辐 03D51 和感病亲
本龙 6239 中都存在多态性的差异 ,E07、E11、E17 在抗
病系龙辐 03D51 分别扩增出 380bp、700bp、和 600bp 的
特异带 ,而在感病材料中均未扩出此特异带 ,可初步认
为该谱带可能与秆锈抗性有关。由于 RAPD 标记有重
复性 ,稳定性差等缺点 ,现在在进行 SSR 标记筛选。
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