全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032233204
重金属对水稻过氧化物酶同功酶的影响
朱红霞1 　杨小勇2 　葛才林1 　龚　峥1 　王泽港1 　罗时石1 　马　飞1
(11 杨州大学农学院 ,江苏 扬州　225009 ; 21 江苏省疾病防治与控制中心 ,江苏 南京　210009)
摘　要 :对重金属胁迫条件下扬稻 6 号体内 POD 活性测定和 POD 同功酶的聚丙烯酰胺浓度梯
度凝胶电泳分析表明 ,0105mmolΠL 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 诱导扬稻 6 号叶片和根系 POD 同功酶
活性较对照提高 ,但 ≥015mmolΠL 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 抑制叶片分子量较小的 POD 同功酶的
表达。015～110mmolΠL 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 强烈抑制根系 POD 同功酶的表达。0105～
110mmolΠL 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 显著诱导穗中 POS 同功酶的表达。
关键词 :重金属 ;水稻 ;过氧化物酶
EFFECT OF HEAVY METALS ON THE PEROXIDASE ISOENZYMES IN RICE
ZHU Hong2xia1 　YANG Xiao2yong2 　GE Cai2ling1 　GONG Zheng1 　WANG Ze2gang1
LUO Shi2shi1 　MA Fei1
(1. Agricultural College , Yangzhou University , Jiangsu , Yangzhou , 225009 ; 2. Jiangsu Disease Control Center , Nanjing , Jiangsu , 210009)
Abstract :The effect of heavy metals on the peroxidase ( POD) activity and isoenzyme expression in rice ( Yangdao
No. 6) was analyzed by using polyacrylamide concentration gradient gel electrophoresis technique. The results showed
as follows :0105mmolΠL Cu2 + ,Cd2 + and Hg2 + induced the POD isoenzyme activity in the leaves and roots of rice to
be higher than control ,but ≥015mmolΠL Cu2 + ,Cd2 + and Hg2 + inhibited the expression of small modecule POD
isoenzymes in the leaves ,and significantly inhibited the expression of all POD isoenzymes in the roots of rice. 0105
～110mmolΠL Cu2 + ,Cd2 + and Hg2 + induced the expression of POD isoenzymes in the ear of Yangdo No. 6.
Key words : heavy metals ; rice ; peroxidase
收稿日期 :2003212220
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30300026)
作者简介 :朱红霞 (1978～) ,女 ,硕士研究生 ,从事生物物理研究。
过氧化物酶 (POD)的主要作用是清除氧代谢中产生的 H2O2 以及由此产生的有机过氧化物 ROOH。
因此 ,POD 在生物体内的抗氧化代谢中起重要作用[1 ] 。植物体内的 POD 能对各种逆境胁迫作出应
答[2～4 ] 。和其它环境胁迫类似 ,重金属胁迫也能导致植物体内活性自由基的大量产生。因而植物体内
的 POD 也对这种重金属胁迫作出应答。
尽管有关重金属对植物体内 POD 活性影响的报道较多[5～7] ,但有关重金属对主要农作物水稻不同器
官 POD 活性影响的研究相当缺乏 ,并且有关重金属对水稻不同器官 POD 同功酶表达的影响未见报道。因
此 ,本试验主要研究不同浓度的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 对水稻各器官中 POD 活性及同功酶表达的影响。
1 　材料和方法
111 　材料
332　核 农 学 报　2004 ,18 (3) :233～236Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
水稻 ( Oryza sativa ) : 扬稻 6 号 (籼稻 ) 。重金属离子 : Cu2 + ( CuSO4 ) 、Cd2 + ( CdCl2 ) 、Hg2 + [ Hg
(CH3 COO) 2 ] ,均为化学纯。
112 　方法
11211 　材料的培养与重金属处理 　采用稍加改进的木村 B 培养液对供试水稻进行水培 ,培养液 pH 调
为 510 ,每 7d 换培养液 1 次。灌浆期水稻植株分别转移到含有浓度为 0、01025、0105、011、015、110、
210mmolΠL 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 的培养液中进行重金属处理 ,处理时间为 7d。设 3 组重复。
11212 　酶液提取 　待重金属处理 7d 后 ,取叶片、穗部籽粒和根系 ,称重后置于预冷的研钵中 ,按 1∶3 的
比例加入预冷的提取介质 (蔗糖 11198g ,Tris 0160g ,抗坏血酸钠 01088g ,半胱氨酸 01030g ,氯化镁 01020g ,
定容至 100ml ,pH 值调为 714) ,冰浴上研磨成匀浆 ,15000rpm、0 ℃离心 30min ,上清液为酶提取液 ,0 ℃保
存备用。
11213 　POD 活性测定 　采用比色法 ,以单位鲜重每分钟吸光度的变化值表示酶活性大小 (ΔA470ΠgFWΠ
min) 。
11214 　POD 同功酶电泳分离和染色 　吸取上述酶液 20μl ,采用聚丙烯酰胺浓度梯度凝胶电泳技术进行
POD 同功酶电泳分离。聚丙烯酰胺浓度范围为 4 %～30 % ,4 ℃条件下 ,220V 稳压电泳 ,电泳时间为 10h。
将电泳后的凝胶置于染色液 (60ml 蒸馏水中加入 7014mg 抗坏血酸 ,20ml 联苯胺贮存液 ,20ml 016 %的
H2O2 )中室温下显色 1～15min ,酶活性区逐渐出现蓝色。显色后漂洗凝胶 ,置于保存液 (5 份水、5 份甲醇
和 1 份冰醋酸的混合液)保存。
图 1 　重金属对水稻各器官 POD 活性的影响
Fig. 1 　Effects of heavy metals on the POD
activity in different rice organs
2 　结果与分析
211 　重金属对水稻各器官 POD 活性的影响
图 1 为 01025、0105、011、015、110mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和
Hg2 + 对扬稻 6 号叶片、穗和根系中 POD 活性的影响。
图 1 显示 , (1) 随 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 浓度的增高 ,扬稻 6
号叶片 POD 活性呈先上升后下降的规律 , 表明 01025 ～
011mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 及 01025～015mmol/ L 的 Hg2 + 促使扬
稻 6 号叶中的 POD 活性较对照显著提高 ,而 ≥015mmoI/ L 的
Cu2 + 、Cd2 + 及 110mmol/ L 的 Hg2 + 则导致扬稻 6 号叶中的 POD
活性显著低于对照。(2)随 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 浓度的增高 ,扬
稻 6 号根系 POD 活性也呈先上升后下降的规律 ,表明 01025～
011mmol/ L 的 Cd2 + 和 0125 ～ 0105mmol/ L 的 Cu2 + 及 01025
mmol/ L的 Hg2 + 均能促使扬稻 6 号根系中 POD 活性较对照明
显提高 ,而 ≥015mmol/ L 的 Cd2 + 和 ≥011mmol/ L 的 Cu2 + 及 ≥
0105mmol/ L 的 Hg2 + 均显著抑制扬稻 6 号根系 POD 活性。(3)
在 01025～110mmol/ L 的范围内 ,随 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 浓度的
增高 ,扬稻 6 号穗中的 POD 活性表现为稳定上升的趋势 ,表明
01025～110mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 能促进扬稻 6 号穗中
的 POD 活性较对照增高。
212 　重金属对灌浆期水稻各器官 POD 同功酶的影响
21211 　重金属对灌浆期水稻叶片 POD 同功酶的影响 　图 2
所示 ,正常情况下 (即对照中) 扬稻 6 号叶中主要表达 3 组
POD 同功酶 ,第 1 组 (至少由 3 个条带组成) POD 同功酶的分
子量约在 130～160kD 之间 ,第 Ⅱ组 (由 3 个条带组成) POD 同
功酶的分子量约在 43～65kD 之间 ,第 Ⅲ组 (至少由 6 个条带
432 核　农　学　报 18 卷
组成) POD 同功酶的分子量约在 20～30kD 之间。0105～110mmol/L 的 Cu2 + 、Cd2 + 及 0105mmol/ L 的 Hg2 +
显著诱导扬稻 6 号叶中第 Ⅰ组 POD 同功酶活性较对照提高 ,0105mmol/ L 的 Cd2 + 也明显诱导第 Ⅱ、Ⅲ组
POD 同功酶的活性 ,并且 0105～015mmol/ L 的 Cu2 + 诱导叶中 1 条新的 POD 同功酶 P1 的表达。≥0105
mmol/ L 的 Cu2 + 、Hg2 + 及 ≥015mmoI/ L 的 Cd2 + 显著抑制第 Ⅱ、Ⅲ组 POD 同功酶的表达 ,且抑制程度随
Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 浓度的提高而显著增强。
图 2 　重金属对灌浆期扬稻 6 号叶片 POD 同功酶的影响
Fig. 2 　Effect of heavy metal on POD isozymes in
Yangdao No. 6 leaves at milking stage
0 为对照 ;1 ,2 ,3 为 Cu 处理 ;4 ,5 ,6 为 Cd 处理 ;7 ,8 ,9 为 Hg 处理。
Cu ,Cd ,Hg 浓度从左到右均为 0105 ,015 ,110mmolΠL。下图同。
0 :control ; 1 , 2 , 3 : Cu treatments ; 4 , 5 , 6 : Cd treatments ; 7 , 8 , 9 : Hg
treatments ;The concentration of Cu ,Cd ,Hg from left to right were 0105 ,
015 ,110mmolΠL respectively. The same as the following figures. 　　从上述结果可知 , ≥0105mmol/ L 的 Cu2 + 显著抑制扬稻 6 号叶片中的各 POD 同功酶的表达。随Cd2 + 和 Hg2 + 浓度的埴高 ,扬稻 6 号叶片中的各 POD同功酶活性呈现低浓度诱导高浓度抑制的规律。21212 　重金属对灌浆期水稻穗中 POD 同功酶的影响　从图 3 中可看出 , 0105～110mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 对扬稻 6 号穗中 POD 同功酶 Ⅰ～ Ⅲ的活性均有显著的诱导作用 ,诱导程度随 Cu2 + 、Cd2 +和 Hg2 + 浓度的增高而增强 ,且 0105～110mmol/ L 的Hg2 + 还诱导对照穗中未表达的第 Ⅳ组 POD 同功酶的表达。21213 　重金属对水稻根系 POD 同功酶的影响 　图4 为 0105、015、110mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 对灌浆期扬稻 6 号根系中 POD 同功酶的影响。从图 4中可 知 , 0105mmolΠL 的 Cu2 + 、Hg2 + 及 0105 ～015mmol/ L 的 Ca2 + 诱导灌浆期扬稻 6 号根系中第 Ⅰ
图 3 　重金属对灌浆期扬稻 6 号穗 POD 同功酶的影响
Fig. 3 　Effect of heavy metal on the POD isozymes
in Yangdao No. 6 ears at milking stage
图 4 　重金属对灌浆期扬粳 6 号幼苗根系
POD 同功酶的影响
Fig. 4 　Effect of heavy metal on the POD isozymes
in Yangdao No. 6 seedling roots
～ Ⅲ组 POD 同功酶活性明显高于对照 ,0105mmolΠL 的 Cu2 + 和 0105～015mmol/ L 的 Cd2 + 也能诱导对照中
未出现的分子量最小的第 Ⅳ组 POD 同功酶的表达。≥015mmol/ L 的 Cu2 + ,Hg2 + 及 110mmol/ L 的 Cd2 + 强
烈抑制扬稻 6 号根系中各组 POD 同功酶表达。当 Cu2 + 、Ca2 + 和 Hg2 + 浓度 ≥015 mmol/ L 时 ,同浓度的重
金属离子对扬稻 6 号根系中各组 POD 同功酶表达的抑制程度为 Cu2 + > Hg2 + > Cd2 + 。
3 　小结与讨论
作物不同器官中的 POD 对重金属胁迫的敏感性存在显著差异。根系由于直接和重金属接触 ,根细
胞内必定积累最高的重金属含量[8 ] ,因此高浓度的 Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 胁迫强烈抑制水稻根系 POD 活性及
532　3 期 重金属对水稻过氧化物酶同功酶的影响
同功酶表达。而对水稻叶片 POD 活性及同功酶表达则表现为低浓度诱导高浓度抑制的规律。对水稻
穗中 POD 活性及同功酶表达一般表现为诱导作用 ,且诱导程度随 Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 浓度的增高而逐步上
升 ,表明作物根系 POD 对重金属胁迫最为敏感 ,其次为叶片。因此重金属对根系及高浓度重金属对叶
片 POD 的抑制可能是重金属胁迫影响作物生长发育及产量形成的关键。
就不同重金属而言 ,以 Hg2 + 对水稻叶片中各 POD 同功酶活性的抑制作用最强 ,其次为 Cu2 + ,Cd2 +
的抑制作用最低 (图 2) 。Hg2 + 对水稻根系中 POD 同功酶表达的抑制程度也最高 ,其次为 Cu2 + ,Cd2 + 对
根系 POD 同功酶的抑制作用最低 (图 4) 。关于不同重金属对水稻体内 POD 抑制程度差异的机理有待
于进一步研究。
就不同的抗氧化酶而言 ,植物体内的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 和
过氧化物酶 ,它们联合作用以清除体内产生的过量自由基。将 POD 和 CAT及 SOD 相比 ,CAT受重金属
胁迫抑制的敏感性最高 ,0105mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 强烈抑制水稻叶内 CAT活性和 CAT同功酶的
正常表达[9 ] 。Schutzendubel 等也报道 ,0105mmolΠL 的 Cd 处理柠檬 6h 后 ,柠檬体内 POD 和 SOD 活性增
高 ,而 CAT和抗坏血酸过氧化物酶活性下降 ,进而导致 H2O2 的积累[10 ] 。因而由于重金属造成水稻 CAT
活性优先受到抑制 ,而导致 H2O2 清除受阻 ,此时 H2O2 只能由 POD 负责清除。
就不同类型 POD 同功酶而言 ,植物体内 POD 同功酶的组成很复杂 , Ito 等从水稻绿色叶片中分离出
4 个分子量分别是 48、48、40、39kD 的 POD 同功酶[11 ] 。Hiraga 等报道 ,水稻体内的过氧化物酶由多基因
编码 ,从水稻中分辩出 42 个独立表达的DNA 序列负责 POD 的表达 ,并且有 21 个 POD 基因在发育阶段、
组织特异性及对外部刺激的应答上进行特异性表达[12 ] 。这显示编码 POD 同功酶基因的表达受到各种
生理过程及外界因素的调节。本试验对水稻 POD 同功酶的电泳分析表明 :高浓度的 Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 优
先抑制分子量较小的 POD 同功酶表达 ,而对高分子量的 POD 同功酶的抑制程度相对较低。很显然 ,分
子量较小的 POD 同功酶为组成 POD 的亚基。这表明重金属胁迫主要抑制 POD 亚基的合成 ,而对作物
体内已经存在的 POD 活性的抑制程度较小。
就重金属对 POD 影响机理而言 ,有关重金属通过何种机制影响作物抗氧化酶的活性和同功酶表达
目前还不清楚 ,相关的研究报道也较少。有报道认为在高强度的逆境胁迫条件下 ,高水平的自由基能导
致抗氧化酶断裂 ,从而抑制作物抗氧化酶活性[13 ] 。也有报道指出 ,适量活性氧自由基的产生能触发对
抗氧化酶表达的诱导作用[14 ] 。另一些研究结果显示 ,逆境胁迫主要通过影响植物激素及信号分子来调
节氧化酶的表达[15 ] 。Fang 等认为 Fe2 + 、Cu2 + 和 Zn2 + 对 POD 活性的诱导作用发生在酶蛋白的合成阶段 ,
并进一步认为 Fe2 + 、Cu2 + 和 Zn2 + 胁迫对 POD 活性的诱导作用不是通过自由基的产生来介导[16 ] 。作者
的研究结果表明 ,0105mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 并未导致水稻各器官MDA 含量的明显增高 (葛才林 ,
浙江大学博士论文 ,2002) ,即说明 0105mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 胁迫未导致水稻和小麦各器官中自
由基的明显积累 ,但 0105mmol/ L 的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 却能明显诱导水稻各器官中 POD 活性的增高并
(图 1) 。这表明较低浓度重金属胁迫对水稻各器官中 POD 活性的诱导作用可能不是通过自由基的产生
来介导。对不同浓度重金属胁迫条件下水稻和小麦各器官 POD 同功酶的电泳分析表明 ,低浓度的
Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 主要诱导分子量较低 POD 同功酶 (即亚基) 的表达 ,高浓度的 Cu2 + 、Cd2 + 和 Hg2 + 也主
要抑制分子量较低 POD 同功酶 (即亚基)的表达 ,这暗示重金属胁迫对作物抗氧化酶的影响主要发生在
酶蛋白的合成阶段。
参考文献 :
[ 1 ] 　王夔主编. 生命科学中的微量元素 (上卷) . 北京 :中国计量出版社 ,1991 ,140～141
[ 2 ] 　Srivastave A ,Tel2Or E. Effect of some environmental pollutants on the superoxide dismutase activity in Lemna. Free Radic Res Commun ,1991 ,12～
13 (2) :601～607
[ 3 ] 　Barcelo A R. The generation of H2O2 In the xylem of zinnia elegans is mediated by an NADPH2oxidase2like enzyme. Planta ,1998 ,207 :207～216
[ 4 ] 　Beligni M V ,lamattina L. Nitric oxide counteracts cytotoxic processes mediated by reactive oxygen species in plant tissues. Planta ,1999 ,208 :337～
344
(下转第 169 页)
632 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (3) :233～236
416 　核技术与动物生产和健康
利用核技术和现代生物技术相结合 ,研究提高动物的营养水平 ,改进家畜的受精作用 ,开发新型的
动物饲料 ,提高动物生产力。利用放射性免疫分析技术和相关技术研究口蹄疫、禽流感等重大疫病的早
期诊断及防治措施 ,预防和控制重要畜禽疾病的发生 ,促进畜牧业持续发展 ,提高农牧民的收入。
参考文献 :
[ 1 ] 　陈子元. 核农学. 北京 :中国农业出版社 ,1997 年
[ 2 ] 　黄彬 ,等. 核农业工程技术. 河南 :河南科学技术出版社 ,2000 年
[ 3 ] 　卢良恕. 21 世纪中国农业科技展望. 济南 :山东科学技术出版社 ,1993 年
[ 4 ] 　温贤芳. 中国核农学. 河南 :河南科学技术出版社 ,1999 年
[ 5 ] 　徐冠仁. 核农学导论. 北京 :原子能出版社 ,1997 年
[ 6 ] 　汪勋清 ,温贤芳. 核农学.《中国农业科学技术 50 年》. 北京 :中国农业出版社 ,1999
[ 7 ] 　汪勋清 ,华珞. 中国核农学的成就与展望. 中国核科技报告 ,2001 ,1～19
[ 8 ] 　温贤芳. 中国核农学现状与 21 世纪初的发展. 核科学与工程 ,2000 ,20 (3) :332～338
[ 9 ] 　张和琴. 昆虫辐射不育的研究和应用. 包建中. 中国生物防治. 太原 :山西科学技术出版社. 1998 : 629～637
[10 ] 　International Atomic Energy Agency. IAEA Annual Report for 2001. Vienna : IAEA Press , 2000
(上接第 236 页)
[ 5 ] 　Vitoria AP ,Lea PL ,Azevedo RA. Antioxidant enzymes responses to cadmium in radish tissues. Phytochemistry ,2001 ,57 (5) :701～710
[ 6 ] 　Dixit V ,Pandey V ,Shyam R. Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea ( Pisum sativum L. cv. Azad) . J Exp Bot ,
2001 ,52 (358) :1101～1109
[ 7 ] 　Gupta M ,Cuypers A ,Vangronsveld J . Copper affects the enzymes of the related metabolites in the roots of ascorbate2glutathione Phaseolus vttlgaris .
Physiologia Plantarum ,1999 ,106 :262～267
[ 8 ] 　董克虞 ,陈家梅. 镉对农作物生长发育的影响与吸收积累的关系. 环境科学 ,1982 ,3 (4) :31～34
[ 9 ] 　葛才林 ,杨小勇 ,朱红霞 ,孙锦荷 ,王泽港 ,罗时石 ,马飞. 重金属胁迫对水稻叶片过氧化氢酶活性和同功酶表达的影响. 核农学报 ,
2002 ,16 (4) :197～202
[10 ] 　Schutzendubel A ,Schwanz P ,Teichmann T ,et al . Cadmium2induced changes in antioxidative systems ,hydrogen peroxide content ,and differentiation
in scots pine roots. Plant Physiol ,2001 ,127 (3) :887～898
[11 ] 　Ito H ,Hiraoka N ,Ohbayashi A ,Ohashi Y. Purification and characterizaqtion of rice peroxidases. Agric Biol Chem ,1991 ,55 (10) :2445～2454
[12 ] 　Hiraga S ,Yamamoto K,et al . Diverse expression profiles of 21 rice peroxidase genes. FEBS Lett ,2000 ,471 (223) :245～250
[13 ] 　Casano LM ,Gomez LD ,et al . Inactivationand and degradation of CuΠZn2SOD by active oxygen species in wheat chlorophasts exposed to photooxida2
tive stress. Plant Cell Physiol ,1997 ,38 (4) :433～440
[14 ] 　Higa A ,Hidaka T ,et al . Active oxygen radicals induce peroxidase activity in rice blade tissues. Biosci Biotechnol Biochem ,2001 ,65 (8) :1852～
1855
[15 ] 　Lin CC ,Kao CH. Abscisic acid induced changes in cell wall peroxidase activity and hydrogen peroxide level in roots of rice seedlings. Plant Sci ,
2001 ,160 (2) :323～329
[16 ] 　Fang W ,Kao CH. Enhanced peroxidase activity in rice leaves in response to excessiron ,copper and zinc. Plant Sci ,2000 ,158 (122) :71～76
961Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (3) :164～169