全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 012049202
多年生黑麦草体细胞无性系变异分析
冯　霞　孙振元　韩　蕾　彭镇华
(中国林业科学研究院林业科学研究所Π国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘　要 :以多年生黑麦草成熟胚诱导获得的再生植株为材料 ,利用 RAPD 标记方法对其体细胞变异进行
了研究。结果表明多年生黑麦草体细胞无性系在分子水平发生了多态性变异。
关键词 :多年生黑麦草 ;RAPD 标记 ;体细胞变异
SOMACLONAL VARIATION OF REGENERATED PLANTS OF PERENNIAL RYEGRASS
FENG Xia 　SUN Zhen2yuan 　HAN Lei 　PENG Zhen2hua
( Research Institute of Forestry , Chinese Academy of ForestrΠKey Laboratory of
Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing , 100093)
Abstract :The somaclonal variation of regeneration plant derived from mature embryo of perennial ryegrass(Lolium perenne L. )
were analyzed with RAPD makers. The results indicated that polymorphic variation of the regeneration plant was existed in
molecular level .
Key words :perennial ryegrass ; RAPD maker ; somaclonal variation
收稿日期 :2005207211
基金项目 :国家“863”计划 :抗干旱、耐盐碱基因工程黑麦草、早熟禾等新品种选育 (J20022B2006) (2002AA241061)
作者简介 :冯霞 (19762) ,女 ,云南思茅人 ,博士 ,从事草坪植物遗传改良与分子育种研究。孙振元为通讯作者 ,Email :sunzy @caf . ac. cn
　　植物体细胞无性系变异是植物组织培养过程中普
遍存在的现象。禾谷类植物经过体细胞培养后 ,容易
引起后代的各种性状变异 ,而且经常出现一个或少数
基因的突变 ,有利于在不改变品种的基本特征情况下 ,
改进个别性状 ,如降低株高、提高抗病性等[1 ] ,弥补了
杂交育种等常规育种的不足[2 ,3 ] ,因此利用体细胞无性
系变异进行新品种培育已经成为育种的重要手段之
一。利用体细胞无性系异培育草坪草新品种国内外已
有报道[4～7 ] ,但通过体细胞无性系变异培育多年生黑
麦草新品种的相关研究未见报道。本研究从分子水平
探讨了多年生黑麦草再生植株变异的多态性 ,为利用
体细胞无性系变异进行遗传改良提供理论参考。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　实生苗 　将多年生黑麦草 ( Lolium perenne L. ) 栽培品种“德比 (Derby)”种子置于培养皿 ,27 ℃恒温条件下发芽 ,待种子萌动后置于 4 ℃冰箱中低温处理12h ,然后在室温下培养 24h。11112 　组织培养再生苗 　以多年生黑麦草 (品种同上)成熟胚为外植体 ,按冯霞等[8 ]组织培养方法两次继代后获得再生植株。112 　方法11211 　RAPD 变异分析 　以 30 株实生苗的混合样本为对照 ,对再生植株进行 RAPD 多态性分析。提取DNA 采用 CTAB 法。PCR 扩增体系如下 :重蒸水 116L ,PCR buffer (10 ×) 210 L ,Mg2 + (25mmolΠL) 116 L , dNTP(215mmolΠL) 116 L ,Primer (8pmolΠml) 110 L ,Taq 酶 (5UΠL) 012 L , DNA ( 50ngΠL ) 210 L。Taq 酶及 dNTP 为Promega 产品。11212 　PCR 扩增程序 　94 ℃4min , 37 ℃1min , 72 ℃115min ,72 ℃10min ,4 ℃保持。采用 1 %的琼脂糖凝胶检测 PCR 扩增产物 ,4VΠcm 电压下电泳 015h。随机引
94　核 农 学 报　2006 ,20 (1) :49～50Journal of Nuclear Agricultural Sciences
物采用Operon 公司引物序列的OPA 组和OPC组 (由北
京三博远志公司合成) 。从中筛选出扩增带强、重复性
好的 11 个引物进行扩增 ,其引物序列为 : S21 : CAG
GCC CTTC ,S22 : TGC CGA GCTG;S23 :AGT CAG CCAC ;
S24 : AAT CGG GCTG; S25 : AGG GGT CTTG; S26 : GGT
CCC TGAC ;S27 : GAA ACG GGTG;S28 : GTG ACG TAGG;
S34 : TCT GTG CTGG; S36 : AGC CAG CGAA ; S40 : GTT
GCGATCC。对 RAPD 谱带进行统计时只记录那些谱带
清晰、并在重复试验中稳定出现的谱带。
2 　结果与讨论
211 　RAPD 标记多态性分析 在 11 个能扩增出多态性带的随机引物中 ,有 4 个引物 (S21、S23、S24、S25) 能检测到再生植株的多态性差异 ,其中 S24 引物在各再生植株中都检测到了与对照不相同的位点 (见图 1) 。不同再生植株无性系扩增出不同数量的特异性多态带 ,与对照相比 ,既有缺失带 ,也有新增带。其多态率在 518 %至 1514 %之间 (表1) 。说明再生植株群体中在分子水平也广泛存在体细胞无性系变异。212 　讨论目前已有许多用分子标记检测到体细胞无性系变异的报道。Müller[9 ]用 RFLP 标记手段检测水稻胚性愈伤组织再生植株 ,结果发现从同一块愈伤组织诱导获得的再生植株间表现出 DNA 水平的多态性 ,且多态性
图 1 　多年生黑麦草再生植株的 RAPD 多态性
左图为引物 S23 扩增结果 ,右图为引物 S24 扩增结果 ,1214 为再生植株编号 ,M为 marker ,CK为实生苗。
表 1 　再生植株体细胞变异率比较
编号 缺失带 新增带 多态性带 多态率 ( %) 编号 缺失带 新增带 多态性带 多态率 ( %)
1 2 1 3 518
2 1 3 4 717
3 1 3 4 717
4 3 2 5 916
5 6 2 8 1514
6 5 2 7 1315
7 4 1 5 916 8 3 2 5 9169 3 1 4 71710 2 3 5 91611 2 1 3 51812 1 2 3 51813 4 2 6 111514 3 2 5 916
　　注 :多态率 ( %) = (多态性带Π对照扩增总带) ×100 %
水平会随培养时间的延长而提高。Godwin[10 ] 和
Hashmi [11 ]分别报道了水稻成熟胚诱导获得的再生植
株、桃树 ( Prunus persica L. ) 同一胚再生植株的 RAPD
多态性。本研究揭示多年生黑麦草组织培养再生植株
在分子水平存在变异 ,说明 RAPD 分子标记也适合用
于多年生黑麦草体细胞无性系变异的初步筛选。
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