全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052353205
52氮胞苷对籼稻成熟胚愈伤组织生长和
再分化的影响及诱变效应
刘传光　涂从勇　江奕君　高　云　刘　军　林青山
(广东省农业科学院水稻研究所 ,广东 广州　510640)
摘 　要 :用 52氮胞苷 (52azaC)处理籼型三系杂交水稻恢复系“明恢 63”、“密阳 46”和“特青 2 号”成熟胚诱
导产生的愈伤组织 ,当 52azaC 浓度为 011mmolΠL 时 ,愈伤组织的增殖明显受抑 ; 当 52azaC 浓度达
110mmolΠL 时 ,愈伤组织增殖率下降 50 %以上 ;52azaC浓度提高到 1. 5mmolΠL 时 ,愈伤组织增殖率仅及对
照的 20 %。分化阶段愈伤组织对 52azaC更敏感 ,当 52azaC 的浓度为 0102mmolΠL 时 ,愈伤组织的再分化
率明显下降 ,且随 52azaC浓度的增加 ,再分化率也显著下降 ,当 52azaC的浓度为 012mmolΠL 时 ,各试验品
种的愈伤组织的再分化力完全受抑 ,不能分化出幼苗。经 52azaC处理的愈伤组织再分化力也下降 ,但经
预分化培养后分化力可恢复到较高水平。经 52azaC处理的愈伤组织再生植株产生了性状变异 ,出现了
白化苗、矮秆、迟熟和早熟等变异体 ,当代的突变率为 3103 %～5131 %。突变性状表现为单基因隐性突
变 ,可稳定遗传。
关键词 :52氮胞苷 ;籼稻 ;愈伤组织 ;再分化 ;诱变
收稿日期 :2005212202
基金项目 :国家农业科技跨越计划“中国超级稻育种技术及生产技术集成”(99201202)
作者简介 :刘传光 (19682) ,男 ,湖南永兴人 ,硕士 ,副研究员 ,主要从事水稻遗传育种和生物技术工作 ,Email :guyliu @tom. com
EFFECTS OF 52AZACYTIDINE ON THE PROLIFERATION, REGENERATION AND MUTATION2
INDUEING TO THE CALLUS FROM INDICA RICE MATURE EMBRYO
LIU Chuan2guang 　TU Cong2yong 　J IANG Yi2jun 　GAO Yun 　LIU Jun 　LIN Qing2shan
( Rice Research Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou , Guangdong 　510640)
Abstract :The callus , which were induced from the mature embryo of three2line indica hybrid rice restorer lines ,Minghui 63 ,
Milyang 46 , and Teqing 2 ,were treated by 52azacytidine ( 52azaC) . The callus was inhibited obviously on the medium
containing 011mmolΠL 52azaC , and more obviously on the higher concentration of 52azaC. The proliferation rate of the callus
fall down over 50 % when 52azaC concentration was up to 110mmolΠL. When the callus was exposed on the medium containing
115 mmolΠL 52azacytidine , its proliferation rate fall down over 80 %. The callus was more susceptible to 52azaC in the stage of
regeneration. Compared with no 52azacytidine in the medium , the regeneration rate of the callus fall down obviously when the
callus were on the medium containing 0102mmolΠL 52azaC. With higher concentration of 52azaC , the regeneration rate of the
callus was lower. The regeneration capability of the callus from three varieties tested was inhibited completely when the 52azaC
concentration was up to 012mmolΠL and no plantlet was produced. The regeneration capability of the callus also fall down after
the 52azaC treatment , however , it could be restored through pre2regeneration stage. In this research system , several
characteristics such as albino , dwarfism , late2heading and early2heading in the regeneration plants were mutated , the general
mutation rate in MR1 were 3103 %～5131 %. The mutant characteristics appeared just single locus mutation and inheritable
stably.
Key words :52azacytidine ; indica rice ; callus ; regeneration ; induced mutation
353　核 农 学 报　2006 ,20 (5) :353～357Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　52azaC 是一种 DNA 甲基化抑制剂 ,可以降低基因
组甲基化水平[1 ] 。作为植物生长调节剂 ,52azaC 可以
诱导植物开花[2 ,3 ] 。低浓度的 52azaC 可以诱导植物离
体组织形成愈伤组织 ,高浓度的 52azaC 则会抑制愈伤
组织的增殖和再分化[4 ] 。52azaC 是一种弱诱变剂 ,对
基因组 DNA 的去甲基化作用使基因组发生改变 ,导致
生物发生变异。Sano 等[5 ] 用 52azaC 处理水稻秧苗 ,发
现很多秧苗的株高变矮 ,且这种变异是可以遗传的。
Fieldes[6 ]用 52azaC 处理亚麻萌动种子 ,获得了早熟突
变体。Amado 等[7 ] 用 52azaC 处理小黑麦 F1 种子获得
rDNA 去甲基化变异体 ,并使 rRNA 表达发生改变。另
外 ,在大豆[8 ] 、白菜[9 ] 、拟南芥[2 ,10 ] 等植物中也有相关
报道。在 52azaC 诱导植物愈伤组织变异方面 ,刘丕
庆[11 ]用 52azaC处理水稻愈伤组织 ,开展耐盐突变体的
筛选 ,但未能获得抗盐细胞频率高的细胞系。本试验
用 52azaC处理籼型三系杂交水稻恢复系“明恢 63”、
“密阳 46”和“特青 2 号”,研究了 52azaC 对水稻愈伤组
织增殖和再分化的影响及诱变效应。
1 　材料与方法
111 　材料
试验品种“明恢 63”和“密阳 46”的种子由广东省
金稻种业公司提供 ,“特青 2 号”的种子从本课题组试
验田亲本圃收取。种子去壳后以 1 % HgCl2 消毒
30min ,再用清水冲洗 3～4 次 ,然后接种于诱导培养
基 ,诱导产生的愈伤组织转移到继代培养基继代 3～4
次 ,当愈伤组织转变成淡黄色、干爽而结构致密的颗粒
状胚性愈伤组织时 ,进行 52azaC 处理。本试验使用的
52azaC为 SIGMA 公司生产 ,由华南农业大学生命科学
学院植物细胞工程实验室提供。
基本培养基为 M8 培养基[12 ] 。愈伤组织诱导和继
代培养基添加 2 ,42D 2mgΠL、KT 1 mgΠL、NAA 1 mgΠL、水
解酪蛋白 100 mgΠL、肌醇 100 mgΠL。预分化培养基不
加 2 ,42D ,添加 ABA 6 mgΠL、62BA 3 mgΠL。分化培养基
不加 2 ,42D ,添加 62BA 1 mgΠL。生根培养基只添加
NAA 012 mgΠL。所有培养基灭菌前 pH 值调至 518 ,高
压灭菌。
112 　方法
11211 　52azaC诱变处理 　从继代培养基上挑选的胚性
愈伤组织接种到添加一定浓度 52azaC的继代培养基上 ,
每瓶接种愈伤组织 012g ,每处理接种 5 瓶 ,26 ℃条件下
暗培养 14d 后调查愈伤生长情况。
11212 　愈伤组织处理后再分化培养 　将存活的愈伤
组织分为 2 份 ,1 份转入再生培养基 ,26 ℃、12hΠd 光照
条件下进行再生培养 ,30d 后统计再分化率以及白化
苗和畸形苗率。另 1 份转入预分化培养基 ,26 ℃下暗
培养 20d ,然后将愈伤组织转入再分化培养基 ,26 ℃、
12hΠd 光照条件下进行再生培养 ,30d 后统计再分化率
以及白化苗和畸形苗率。待小苗分化后转入生根培养
基培养。待根系比较发达后 ,将小苗取出小心洗去琼
脂 ,转入含 1Π2MS 矿质元素的液体培养基水培 4～6d ,
然后移入大田生长 ,大田管理按常规进行。
11213 　MR1 代突变植株调查与统计 　再生植株大田
生长期间 ,每 7d 调查 1 次 ,主要观察植株生长变异情
况。成熟期选择变异株单株收获备用。
11214 　突变性状的遗传分析 　单株收获的 MR1 突变
植株种子种成MR2 株系 ,每个株系种植 100 株 ,田间观
察植株性状表现 ,检验变异性状是否可以遗传。MR2
分单株收获备用。MR3 ～MR5 种植 50 株观察变异性
状是否可以稳定遗传。
从性状变异 MR2 株系中各选 1 个株系与未经 52
azaC处理的野生型杂交 ,考察 F1 和 F2 性状表现与分
离情况 ,以了解变异性状的遗传效应。
2 　结果与分析
211 　不同浓度 52azaC对愈伤组织生长的抑制作用
将“明恢 63”、“密阳 46”和“特青 2 号”3 个试验品
种继代多次的胚性愈伤组织 ,接种到添加不同浓度 52
azaC的培养基上培养。经 14d 处理后 ,调查愈伤组织
生长情况 ,发现各品种对 52azaC 都比较敏感 (表 1) ,当
52azaC浓度为 011mmolΠL 时 ,愈伤组织的生长就明显
受抑 ,“明恢 63”的愈伤组织增重率仅为对照的 6815 %
(相对增重率) ,“密阳 46”为 7315 % ,“特青 2 号”为
7412 % ;当 52azaC浓度增加到 110mmolΠL 时 ,各品种的
愈伤组织增重率均低于 50 % ,受抑最为严重的是“明
恢 63”,其愈伤组织相对增重率仅 4016 %。当 52azaC
浓度达到 115mmolΠL 时 ,各品种的愈伤组织增重率只
有 20 %左右 ,“明恢 63”的相对增重率仅 1617 % ,受抑
最为明显。
212 　不同浓度 52azaC对愈伤组织再分化率的影响
将未经 52azaC处理的试验品种愈伤组织转入含不
同浓度 52azaC的再分化培养基 ,结果发现 (表 2) ,再分
化培养基上的愈伤组织对 52azaC更敏感 ,当 52azaC浓度
为 0101mmolΠL 时 ,试验品种“明恢 63”、“密阳 46”和“特
青 2 号”的愈伤组织再分化率分别由对照的 1017 %、
453 核　农　学　报 20 卷
　　　　 表 1 　52azaC对愈伤组织生长的影响
Table 1 　Effects of 52azacytidine on callus growth
( %)
品种 variety
52azaC浓度 52azacytidine concentration (mmolΠL)
010 (CK) 011 015 110 115
明恢 63
Minghui 63 100 6815 5916 4016 1617
密阳 46
Milyang 46 100 7315 6412 4712 2214
特青 2 号
Teqing 2
100 7412 6115 4916 2017
1415 %和 2912 % ,下降到 615 %、1018 %和 1514 %。随
着 52azaC浓度的增加 ,愈伤组织的再分化率显著下降。
当 52azaC浓度增加到 0110mmolΠL 时 ,“明恢 63”和“密
阳 46”的再分化率下降为 0 ,所有接种的愈伤组织变
黑 ,未见幼苗分化 ,“特青 2 号”的再分化率也下降至
312 % ,当 52azaC 浓度增加到 0120mmolΠL 时 ,3 个试验
品种的愈伤组织再分化率都为 0。品种间对 52azaC 的
反应有一定差异 ,但总体趋势是一致的。
表 2 　52azaC对愈伤组织再分化率的影响
Table 2 　Effect of 52azacytidine on callus regeneration rate
( %)
品种
variety
52azaC浓度 52azacytidine concentration (mmolΠL)
010 (CK) 0101 0102 0105 0110 0120
明恢 63
Minghui 63 1017 615 511 311 0 0
密阳 46
Milyang 46 1415 1018 712 411 0 0
特青 2 号
Teqing 2
2912 1514 1113 819 312 0
213 　经 52azaC处理的愈伤组织的再分化率
将经 52azaC处理的愈伤组织分成两部分 ,其中一
部分直接转移到分化培养基上进行再分化培养 ,30d
后调查各处理的再分化率。结果表明 ,经 011mmolΠL
的 52azaC处理后 ,各品种的愈伤组织再分化能力大大
下降 (表 3) ,受影响最明显的是“特青 2 号”,其再分化
率由原来的 2912 %下降至 1412 % ,降幅达 5114 % ,“明
恢 63”和“密阳 46”分别下降了 4210 %和 4010 %。随 52
azaC浓度的升高 ,愈伤组织的再分化率也不断降低 ,当
52azaC浓度为 115mmolΠL 时 ,“特青 2 号”的愈伤组织再
分化率仅为对照的 1815 % ,“明恢 63”仅为对照的
2919 % ,“密阳 46”仅为对照的 3110 %。
将另一部分经 52azaC处理的愈伤组织转入预分化
培养基培养 20d ,再转入分化培养基培养 30d ,然后统
计各处理分化率。结果发现 ,经 52azaC处理后 ,先进入
预分化培养基作预分化培养、再进行再分化培养的 ,其
　　　　表 3 　52azaC处理后的愈伤组织的再分化率
Table 3 　Regeneration rate of the callus treated
with 52azacytidine ( %)
品种
varieties
52azaC浓度 52azacytidine concentration (mmolΠL)
010 (CK) 011 015 110 115
明恢 63
Minghui 63 1017 612 615 510 312
密阳 46
Milyang 46 1415 817 619 518 419
特青 2 号
Teqing 2
2912 1412 717 615 512
再分化率可以保持较高的水平。对照因预分化培养使
愈伤组织再分化率大大提高。试验品种“明恢 63”、
“密阳 46‘和”特青 2 号“的再分化率分别从 1017 %、
1415 %和 2912 %提高至 7416 %、8112 %和 7713 % (表
4) 。011mmolΠL 52azaC 处理愈伤组织经预分化培养后
其再分化率也可达 70 %左右 ,与对照无显著差异 ;当
52azaC处理浓度增加至 115mmolΠL 时 ,存活愈伤组织
经预分化培养 ,“明恢 63”的再分化率可达 5015 % ,“密
阳 46”为 6111 % ,“特青 2 号”则为 5915 % ,尽管再分化
率仍比对照低不少 ,但可获得较多的再生苗 ,这比 52
azaC处理后愈伤组织直接进入再分化更易获得足够大
的 MR1 群体。该结果说明 ,52azaC 对愈伤组织的生长
和再分化的作用主要为抑制作用 ,其对愈伤组织的损
伤较小 ,一旦 52azaC的抑制作用解除 ,愈伤组织的再分
化潜力仍可恢复至较高水平。
表 4 　预分化处理对经 52azaC处理愈伤组织再分化率的影响
Table 4 　Effects of pre2regeneration on callus regeneration
capability after treated with 52azacytidine ( %)
品种
varieties
52azaC浓度 52azacytidine concentration (mmolΠL)
010 (CK) 011 015 110 115
明恢 63
Minghui 63 7416 6516 6214 6112 5015
密阳 46
Milyang 46 8112 7015 6410 6517 6111
特青 2 号
Teqing 2
7713 6814 7014 6112 5915
214 　52azaC对 MR1 植株当代的诱变效应
根据不同浓度 52azaC对试验品种愈伤组织生长的
抑制效应以及对存活愈伤组织再分化率的影响 ,综合
比较 011、015、110 和 115mmolΠL 4 个浓度的处理效果 ,
110mmolΠL 处理下 ,愈伤组织的相对生长量接近 50 % ,
即半抑制水平 ,存活愈伤组织再分化率也保持较高的
水平 ,3 个试验品种的愈伤组织经 110mmolΠL 的 52azaC
处理后再分化率仍在 5 %以上 ,基本能保证诱变再生
植株群体足够大 ,因此在以后的诱变处理中 ,都采用
553　5 期 52氮胞苷对籼稻成熟胚愈伤组织生长和再分化的影响及诱变效应
110mmolΠL 的 52azaC浓度处理各品种的愈伤组织。
试验中 ,经 110 mmolΠL 的 52azaC 处理“明恢 63”、
“密阳 46”和“特青 2 号”愈伤组织经再分化培养 ,分别
获得 245、198 和 227 丛再生苗 (表 5) 。再生苗中仅“明
恢 63”有 5 株白化苗分化 ,占再生苗总数的 2104 % ,白
化苗的出现是否由于 52azaC 的诱变作用所致 ,有待于
深入研究 ,但这里依然当作突变株统计。再生苗中未
见无根苗、黄化苗等其他畸形苗。
再生苗移植到大田后 ,经各个生育时期的观察 ,发
现 MR1 植株中主要表现出矮秆、早熟、迟熟等性状的
变异 (表 5) 。从“明恢 63”的 MR1 植株中发现了 3 株矮
秆变异株 ,占再生苗数的 112 % ,从“特青 2 号”的 MR1
植株中筛选 1 株矮秆变异体。在“密阳 46”和“特青 2
号”MR1 植株中分别发现 5 株和 1 株迟熟变异株。在
“明恢 63”、“密阳 46”和“特青 2 号”的 MR1 植株分别发
现 5、1 和 6 株早熟变异株。MR1 植株中未见不育、半
不育株。“明恢 63”、“密阳 46”和“特青 2 号”的当代总
变异频率分别为 5131 %、3103 %和 3152 %。
表 5 　110mmolΠL 52azaC对 MR1 的诱变效应
Table 5 　The mutation2inducing effects of 110mmolΠL 52azacytidine on MR1
供试品种
varieties
再生苗丛数
cluster number of
regeneration plant
白化苗丛数
cluster number
of albino
矮秆变异株
number of dwarf2
mutating plant
迟抽穗
number of late2
heading plant
早抽穗
number of early2
heading plant
明恢 63 Minghui 63 245 5 3 0 5
密阳 46 Milyang 46 198 0 0 5 1
特青 2 号 Teqing 2 227 0 1 1 6
215 　变异性状的遗传效应
将MR1 变异株单株收获 ,下一季种植MR2 ,对MR2
植株的相应性状进行田间调查 ,发现矮秆变异株、迟熟
变异株和早熟变异株的性状均未出现分离 ,表明这些
突变体的变异性状能稳定遗传给后代。MR3～MR5 株
系未出现异常现象 ,变异性状能逐代稳定地遗传给后
代 ,不易出现回复突变。每个突变性状选 1 个 MR2 株
系与未经 52azaC处理的野生型杂交 ,F1 植株表现为亲
本型性状 , F2 群体分离比经卡方测验符合 3 : 1 的比
例。本试验结果表明 ,经 52azaC 诱导的性状变异为单
位点隐性突变 ,性状变异可稳定遗传。
表 6 　各突变体 MR2 ×野生型 F2 的性状分离比例
Table 6 　The segregation ratio of the mutated traits to the
normal in F2 population derived from mutants crossing
to the wild types
组合
cross
诱变性状
mutated
traits
分离比例
segregation
ratio
期望值
the expected
segregation ratio
卡方测验
χ2 test
Minghui 632ag - 1 ×
Minghui 63
矮秆
dwarf 426∶167 3∶1 21995 3
Teqing 22chs - 1 ×
Teqing 2
迟抽穗
late2heading 305∶128 3∶1 51564
Teqing 22zs - 1 ×
Teqing 2
早抽穗
early2heading 375∶145 3∶1 21156 3
注 : 3 表示卡平方测验达 5 %显著水平 (χ20105 ,1 = 3184) 。3 Minghui 632
ag21 :明恢 63 矮秆突变体 ;Teqing 22chs21 :特青 2 号迟抽穗突变体 ; Teqing
22zs21 :特青 2 号早抽穗突变体。
Notes : 3 means significant at 5 % level inχ2 test (χ01052 = 3184) . Minghui 632
ag21 : dwarf mutant of Minghui 63 ; Teqing 22chs21 : late2heading mutant of
Teqing 2 ; Teqing 22zs21 : early2heading mutant of Teqing 2.
3 　结论与讨论
外施低浓度的 52azaC 可诱导植物开花 ,其作用机
制就在于它的去甲基化作用。在植物组织离体培养研
究中 ,52azaC可以提高大麦花药诱导率[13 ] ,提高玉米和
烟草等植物原生质体的分裂频率和叶片愈伤组织的诱
导率[4 ] 。但是 ,较高浓度的 52azaC 会抑制愈伤组织的
增殖和再分化阶段芽的分化 ,大大限制了其在植物组
织培养中的应用[4 ,14 ] 。在水稻中 ,刘丕庆[11 ] 用 52azaC
处理水稻愈伤组织 ,发现当培养基中添加 52azaC 的浓
度低到 0102mmolΠL ,愈伤组织的增殖率就大大降低。
本研究用不同浓度的 52azaC 处理籼稻成熟胚愈伤组
织 ,即浓度低至 011mmolΠL 也能明显抑制愈伤组织的
增殖 ,与刘丕庆的研究结果相一致。本研究的结果还
表明 ,52azaC对愈伤组织的生长和再分化的作用为抑
制作用 ,而对愈伤组织的损伤较小 ,一旦 52azaC的抑制
作用解除 ,愈伤组织的再分化潜力可恢复至较高水平 ,
这一点与 Parakash 和 Kumar[14 ]对矮牵牛的研究结果相
近。
52azaC是一种弱诱变剂 ,其作用机制在于它的去
甲基化作用。它可以使植物产生矮秆、早熟突变体 ,且
表现为外遗传的。Fieldes[6 ] 用 52azaC 处理亚麻萌动种
子 ,获得了 6 个早熟突变体 ,其突变率比采用传统诱变
剂的诱变率要高得多。经分子生物学分析 ,这些早熟
突变体的早熟性状是由 3 个独立位点的突变并互作形
653 核　农　学　报 20 卷
成的。Sano 等[5 ]用 52azaC处理水稻幼苗获得了矮秆植
株突变体 ,经过对基因组 DNA 的去甲基化分析 ,发现
突变体的基因组甲基化水平显著低于野生型。对 M2
分离群体表型分析 ,发现正常株高与矮秆植株的分离
比为 65∶35 ,符合 3∶1 的分离模式 ,表现为单位点隐性
突变。对于基因表达与甲基化无关的性状 ,52azaC 的
诱变作用则是无效的。刘丕庆[11 ] 用 52azaC 处理水稻
愈伤组织 ,研究其对耐盐细胞频率的影响 ,结果未能提
高耐盐细胞频率 ,表明细胞水平的耐盐变异很可能与
基因组的甲基化水平无关。根据以上报道推断 ,很可
能 52azaC对质量性状诱变效应明显 ,对涉及基因数量
众多的数量性状则作用有限。本研究用 52azaC对水稻
成熟胚愈伤组织进行处理 ,亦获得了一批突变体 ,涉及
的变异性状为白化苗、矮秆、迟抽穗和早抽穗等性状 ,
这些变异性状都表现为单基因隐性突变。通过 DNA
去甲基化诱导突变体 ,获得矮秆和早熟性状 ,前人已在
拟南芥[2 ,10 ] 、亚麻[5 ] 和水稻[6 ] 中有较多报道。对于
DNA 去甲基化诱导迟熟突变体在拟南芥中也有报道。
Kakutani[15 ]诱导拟南芥 DNA 去基化 ,将早熟野生型株
系 fwa 诱变处理 ,获得迟熟的 FWA 突变体 ,证明去
DNA甲基化作用同样可以获得丰富的变异类型。白
化苗的出现是由于组织培养诱导产生的 ,还是 52azaC
作用的结果则难以界定。在同一试验中获得早熟和迟
熟两种不同的突变体 ,本研究是首次报道。
组织培养可以诱导体细胞无性系变异 ,水稻组织
培养获得了大量的体细胞无性系变异体 ,如抗白叶枯
病[16 ] 、抗稻瘟病[17 ] 和黑米突变体[18 ] 等。组织培养结
合理化因素人工诱变可以大大提高诱变频率[19 ] 。迄
今为止 ,采用诱变技术和组织培养技术相结合 ,已育成
多个水稻新品种和杂交稻恢复系[19 ] 。以往的研究中 ,
诱变剂多为60 Coγ射线、EMS 和叠氮化钠等 ,本研究尝
试用 52azaC作为诱变剂结合组织培养获得了一批突变
体 ,证明了 52azaC对植物愈伤组织的诱变作用。
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