全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120075205
凤丹种胚组培苗的自毒作用研究
覃逸明　黄雨清　聂刘旺　王　千　刘　欣　周　科
(安徽师范大学生命科学院Π安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室 ,安徽 芜湖　241000)
摘 　要 :利用组织培养技术研究了不同生长时期的凤丹种胚组培苗根系分泌物抑制二茬培养苗生长的自
毒作用。结果表明 ,组培苗根系分泌物对二茬组培苗具有一定的自毒作用。接种于生根培养基和继代
生长培养基上的二茬苗具有最明显的自毒抑制现象 ,其次是接种于初代培养基上的二茬苗 ,在培养基中
添加活性碳可降低二茬苗受到的抑制。二茬苗的根系活力和叶绿素含量明显低于加有活性碳的试验组
和对照组 ,二茬苗的游离脯氨酸含量、SOD 和 POD 酶活性的变化基本与活性碳组和对照组相似 ,都表现
为先升后降的趋势。组培苗根系分泌物可以通过影响二茬苗的抗氧化酶活性变化、根系活力和叶绿素
含量来影响其生长 ,同时 ,加入的活性碳可以吸附培养基中的有毒物质 ,从而缓解二茬苗的自毒作用。
关键词 :凤丹 ( Paeonia ostii T. Hong et J . X. Zhang) ;种胚 ;组织培养 ;根系分泌物 ;自毒作用
AUTOTOXIC EFFECT OF CULTURED SEEDLINGS OF Paeonia ostii T. EMBRYO
QIN Yi2ming 　HUANG Yu2qing 　NIE Liu2wang 　WANG Qian 　LIU Xin 　ZHOU Ke
( College of Life Sciences , Anhui Normal UniversityΠThe Provincial Key Lab , Conservation and Exploitation
Research of Biological Resources , Wuhu , Anhui 　241000)
Abstract :Tissue culture methods were used to study the autotoxic effects of root exudation on the growth of second2batch
seedlings of Paeonia ostii embryo seedlings. The results showed that the extremely significant inhibitory effects on the growth of
seedlings inoculated in the reused rooting medium and subculture medium were observed. Adding activated carbon into culture
medium could reduce the autotoxic effects on the second2batch seedlings. The root activities and chlorophyll contents of the
second2batch seedlings inoculated in activate carbon medium and control treatment were higher than those cultured in reused
medium , but the changes of free proline content and activities of SOD and POD were similar for all of them , rise up first and
fall down later. The results confirmed that the exudation of root system of tissue culture seedlings of Paeonia ostii seed embryo
could affect its second2batch seedlings growth by the changes of antioxidant enzyme activity , root activity and chlorophyll
content . The activate carbon added in culture medium could adsorb the phytotoxins released from the first culture seedlings , so
it could relieve the toxic effects on the second2batch seedlings growth.
Key words : Paeonia ostii T. Hong et J . X. Zhang ; seed embryo ; tissue culture ; root exudation ; autotoxicity
收稿日期 :2008204219 　接受日期 :2008206217
基金项目 :安徽省重点实验室、安徽省教育厅自然科学基金项目 (2006KJ219B) ,安徽省教育厅自然科学基金重点项目 (2006KJ016ZD)
作者简介 :覃逸明 (19682) ,男 ,广西柳州人 ,博士研究生 ,主要从事植物生态学研究。Tel :055323822885 ; E2mail :qym68 @1631 com
通讯作者 :聂刘旺 (19622) 男 ,安徽安庆人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事生物遗传学和生物化感作用的分子机制等研究。E2mail :lwnie @mail . ahnu.
edu. cn
　　凤丹 ( Paeonia ostii T. Hong et J . X. Zhang) 是芍药
科多年生药用牡丹 ,原植物为杨山牡丹 ,主要分布于安
徽省铜陵凤凰山和南陵西山一带 ,故称凤丹[1 ] 。凤丹
根皮俗称凤丹皮 ,为我国传统道地药材 ,每年有较大数
量的出口。凤丹皮富含丹皮酚等多种生物活性物质 ,
具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖和抑制癌细胞增殖等
作用[2 ] 。在药用牡丹的 GAP 种植标准中 ,明确提到连
种或重茬会导致严重的自毒障碍[3 ] 。自毒作用是植物
57　核 农 学 报　2009 ,23 (1) :75～79Journal of Nuclear Agricultural Sciences
在生长过程中受到自身产生毒素的抑制 ,从而在产量
和质量上发生显著改变的现象[4 ] 。自毒作用是导致植
物连作障碍的最主要因子之一[5 ] 。连作自毒障碍在中
药材生产上普遍存在 ,因此多数药用植物均不能连作 ,
特别是占栽培药材 60 %的根类药材的连作障碍问题
尤为突出[6 ] 。有研究认为 ,植物根系分泌物和残体分
解的毒素是导致连作自毒的主要因子之一[7～9 ] 。
目前 ,我国药用牡丹种植中的自毒作用尚无研究
报道。运用组织培养技术在实验室条件下培养凤丹离
体种胚 ,并诱导芽和根的生长得到组培苗 ,由于凤丹组
培苗在生长过程中根系产生的分泌物会积累在培养基
中 ,通过重茬种胚苗 ,就可模拟自然状况下凤丹连作产
生的自毒现象 ,是研究凤丹自毒作用的快速方法[10 ,11 ] 。
本文采用这种快速方法研究了凤丹重茬种植中的自毒
现象 ,以期为凤丹连作障碍中的自毒作用研究提供证
据。
1 　材料和方法
111 　材料及处理
试验所用凤丹采自安徽省南陵县丫山 ,于 2007 年
10 月采收 4 年生植株的成熟种子。取凤丹种子 , 水选
法挑选 ,洗净 ,无菌水冲洗 ,剥去种子外种皮 ,用 70 %
酒精消毒 20s , 再用 011 % HgCl2 溶液消毒 6min , 无菌
水冲洗 6 次 ,在 20 ℃条件下用无菌水浸泡 6h ,取出种
胚备用。
112 　培养基
11211 　初代和继代培养基配制 　按张子学等[12 ] 方法
配制初代培养基 (MS + BA 0125mgΠL + NAA 0105mgΠL +
BR 010001mgΠL) , 生根培养基 (1Π2MS + IBA 110mgΠL)
和继代生长培养基 (1Π2 MS 培养基) 。
11212 　二茬种胚苗培养基配制 　凤丹种胚接种于初代
培养基 ,每瓶接 5 枚 ,接 15 瓶 ,置于 25 ℃±1 ℃、10hΠd 光
照 ,光强为 2000 lx 培养箱中培养 25d ,得到 1 期培养苗 ,
所用培养基无菌低温保存 ;将 1 期苗分别转接到生根培
养基和继代生长培养基上 ,同样培养条件 ,分别得到 2
期和 3 期培养苗 ,所用培养基均低温无菌保存备用。
1、2、3 期培养苗生长过的培养基分别编号为 1、2、
3 号 ;取 1 号培养基 ,按 200 mgΠL 加入活性碳 (编号 4) ;
对照组为新配初代培养基 (编号 5) 。1、2、3、4 号培养
基 ,每瓶加入 15ml 等量新配初代培养基 ,以补充前一
茬幼苗所消耗的养分[10 ] 。
113 　培养苗根系分泌物对二茬苗生长的影响
11311 　培养苗根系分泌物对二茬苗生长的影响　按
方法 111 取出的种胚 ,分别接种到 1、2、3、4、5 号培养
基中 ,每瓶接 5 枚种胚 ,重复 5 次 ,培养条件同上 ,观察
记录胚苗生长情况 ,25d 测量种胚萌发率、叶片数量、
叶片长度、根长度和茎长度等指标。
11312 　根系分泌物对二茬组培苗的生理生化影响 　
取 3 号培养基 ,每瓶分别加入 15ml 等量新配继代培养
基 ,以补充前一代幼苗所消耗的养分 ,编号 T1 ;另取 3
号培养基 ,同 T1 ,并按 200mgΠL 加入活性碳 ,编号 T2 ;
对照组 (CK)用新配继代培养基。
取 1 期长势良好、一致的种胚组培苗 ,分别转接到
T1、T2 和 CK培养基中培养 ,每瓶接 5 枚培养苗 ,重复 5
次 ,培养条件同上 ,培养苗生长到 3、6、10、15 和 25d 时
进行生理指标测定[13 ] 。
113 　测定
根系活力用 TTC 法测定 , 组培苗根系样品用
014 % TTC 溶液和 pH7 磷酸缓冲液处理 ,以四氮唑还
原量表示根系活力 ;用比色法测定叶绿素含量 ;用茚三
酮比色法测定叶游离脯氨酸 ,样品用 3 %的磺基水杨
酸溶液[14 ] ;取新鲜叶于预冷的研钵中 ,1ml 预冷的磷酸
缓冲液 (0105molΠL , pH718)在冰浴上快速研磨成浆 ,加
缓冲液使终体积为 5ml ,4 ℃于 10000rpm 下离心 20min ,
取上清液测定 SOD(NBT法)和 POD(愈创木酚法) 。
114 　数据处理
所有数据用 SPSS(1310)进行ANOVA 方差分析 ,用
Excel 进行作图。
2 　结果与分析
211 　不同生长期组培苗分泌物对离体种胚培养苗生
长的自毒影响
试验结果表明 ,1、2、3 期培养苗均正常生长 ,1 期
培养基主要诱导胚萌发和芽生长 ;2 期培养基主要诱
导根的生长 ;3 期培养基诱导小苗生长。
接种于不同培养基上的种胚苗 ,在其生长过程中
受到不同的影响 :种胚接种 2d 后 ,所有种胚均开始萌
动 ,子叶张开 ,1～4 号培养基中的种胚子叶张开角度
较小 ,5 号培养基 (对照) 的种胚萌动最好 ;5d 时 ,对照
培养基中的种胚苗根尖出现淡黄色 ,子叶长为 013～
014cm ,1～4 号培养基上的种胚苗根尖颜色稍黄 ,胚体
较小 ,子叶长度约为 011～012cm ;以后胚苗逐渐变大 ,
子叶不断长大长厚 ,颜色发生变化 ,1～4 号培养基中
的种胚苗较小 ,子叶黄色稍深 ;10d 时 ,对照组的种胚
苗子叶变为黄绿色 ,长为 015～017cm ,1 号和 4 号比较
接近 (014～015cm) ,2 号和 3 号最短 (011～012cm) 。同
67 核　农　学　报 23 卷
时 ,开始出现肉质根 ,1～4 号的根约在 011～012cm ,对
照根约在 014cm 左右。第 10 天 ,1～5 号种胚苗茎均未
长出 , 25d , 4～ 5 号种胚苗的茎已明显长出 ( 111～ 113cm) , 而 1 ～ 3 号种胚苗的茎明显较短 ( 014 ～016cm) ,其中 3 号苗的茎最短 (见表 1) 。
表 1 　不同二茬培养基对凤丹离体种胚培养苗生长的自毒影响
Table 1 　The autotoxic effects of different second2batch culture mediums on embryo seedlings growth of Paeonia ostii
培养基编号
No. of culture medium
萌发率
germination rate ( %)
叶片数量
leaf number
叶片长度
leaflength (cm)
根长度
root length (cm)
茎长度
stem length (cm)
1 65 2 0184 ±0123ab 0153 ±0112a 0161 ±0124ab
2 46 1 0157 ±0125a 0172 ±0114ab 0154 ±0120ab
3 35 1 0142 ±0119a 0156 ±0126a 0138 ±0112a
4 85 3 1108 ±0108b 0175 ±0108ab 1113 ±0118b
5 90 4 1141 ±0121c 1124 ±0116b 1132 ±0121b
注 :表中叶片长度、根长度和茎长度的数值为平均值±标准差 ,小写字母代表本列各组数据显著差异的相关性 ,相同字母表示差异不显著。
Note : The data of lamina length , root length and culm length in the table are mean ±standard deviations. The lowercase letters behind data denote correlation of
significant differences in a column ,respectively , and data with the same letter within the same column are not significantly different .
　　表 1 结果表明 ,凤丹离体种胚苗重茬时会发生明
显的毒害现象 ,表现为种胚萌发率降低及根、茎、叶生
长明显受到抑制。2 号和 3 号培养基中有能够诱导根
生长的成分 ,在头茬时根的长势明显好于初代培养基
中的种胚苗 ,但在二茬时受到的抑制最大 ,达到显著差
异。这说明除了一定的营养元素发生改变外 ,二茬培
养基内含有凤丹种胚苗生长过程中产生的分泌物 ,这
些分泌物能对接种于该培养基上的种胚苗产生毒害作
用。进一步对加有活性碳的 4 号培养基的二茬苗进行
分析发现 ,由于活性碳对分泌物具有吸附作用 ,因而可
以减少分泌物对种胚苗生长的影响。在本试验中 ,由
于各组所加入的 15ml 培养基并不能完全补充培养基
的激素水平和营养水平 ,因此可能会由于营养水平不
平衡造成结果的误差 ,但加有活性碳试验组的抑制作
用较差则能够在一定程度上说明二茬培养基中积累了
根系分泌物 ,并对二茬苗的生长产生影响。
212 　二茬培养苗对凤丹组培苗根系分泌物的生理响
应
21211 　二茬培养苗的游离脯氨酸含量变化 　正常情
况下 ,植物的游离脯氨酸含量很低 ,但遇到逆境或环境
胁迫时 ,游离脯氨酸便会大量积累 ,而游离脯氨酸积累
的量与逆境强度及植物抵抗能力有关[15 ] 。植物体内
的游离脯氨酸含量可作为鉴定植物相对抗性的指
标[16 ] 。
3 种不同培养基对二茬种胚苗游离脯氨酸含量的
影响 (见图 1) 。接种早期 ,种胚苗的游离脯氨酸含量
比较接近 ,随着时间的增长 ,各组培养苗的脯氨酸有所
上升 ,上升最快的是 T1 组 ,其含量在培养 10d 时达到
最高 ;在 T2 组中 ,由于加有活性碳 ,其含量变化不稳
定 ,但总体含量不如 T1 组高 ;对照组的脯氨酸含量在
图 1 　不同处理培养基对凤丹种胚培养苗游离
脯氨酸含量的影响。
Fig. 1 　Effects of different culture medium on
free proline content of tissue cultured
seedlings of Paeonia ostii
T1 : 含有头茬苗根系分泌物培养基 ;T2 :含有头茬苗根系分泌物 + 活
性碳培养基 ;CK:不含有根系分泌物和活性碳的对照组。下图同
T1 : culture medium containing root exudates released by first crop seedlings ;
T2 : culture medium containing root exudates and activate carbon added ; CK:
fresh culture medium. The same as following figuer.
整个培养过程中相对平缓 ,只是略有上升。
21212 　二茬培养苗的根系活力变化 　植物根系是活
跃的吸收器官和合成器官 ,根的生长情况和活力水平
直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平 ,试验
条件下 ,通常以 TTC 还原量表示脱氢酶活性并作为根
系活力的指标。
本试验中二茬种胚苗根系活力的变化见图 2。从
图 2 可以看出 ,3 组培养苗根的活性总体上趋于上升 ,
对照组上升最快 ,说明培养苗的根活性最大 ;最小是
T1 组 ,由于培养基中根系分泌物质的存在限制了根的
77　1 期 凤丹种胚组培苗的自毒作用研究
生长 ;而在 T2 组中 ,前期上升较慢 ,后期 (培养 25d) 时
上升较快 ,说明活性碳对分泌物有吸附作用。
图 2 　不同处理培养基对凤丹种胚培养苗根系活力的影响
Fig. 2 　Effect of different culture medium on root
activity of tissue cultured seedlings of Paeonia ostii
21213 　二茬培养苗的叶绿素含量变化 　叶绿素是植
物光合作用的重要媒介 ,在很大程度上可以通过叶绿
素的含量来表征植物光合作用。二茬培养苗叶绿素含
量变化与根活性变化基本一致 (图 3) ,在培养 3d 时 ,
叶绿素含量较低 ,以后随着时间的增长叶绿素含量不
断增加 ,25d 时达到最高。在种植过组培苗的培养基
T1 中 ,种胚苗的叶绿素始终低于对照组和加有活性碳
的 T2 组。结果表明 ,组培苗根系分泌物能够影响二茬
种胚苗叶绿素的合成 ,添加活性碳可以减少这种影响
作用。
图 3 　不同处理培养基对凤丹种胚培养苗
叶绿素含量的影响
Fig. 3 　Effect of different culture medium on chlorophyll
content in tissue cultured seedlings of Paeonia ostii
21214 　二茬培养苗的超氧化物歧化酶 (SOD)活性变化
　氧自由基属于活性氧的一种 ,具有很强的氧化能力 ,
可以引发膜脂过氧化 ,破坏膜的完整性。SOD 能催化
超氧自由基 ,产生歧化反应 ,生成分子氧和过氧化氢 ,
影响保护膜的完整性。SOD 酶活性高 ,说明植物对逆
境存在一定的抵御能力。
从图 4 可以看出 ,在 3 个不同培养基处理组中 ,二
茬凤丹种胚培养苗超氧化物歧化酶活性都有先升后降
的趋势。在 T1 中 ,第 6 天测定的量最大 ,而在 T2 和
CK组则是在第 10 天含量最高 , 培养 15d 和 25d 时 ,T1
和 T2 的 SOD 依然维持在比对照高的水平上 ,说明其
所处的环境依然存在毒害效应。
图 4 　不同处理培养基对凤丹种胚培养苗超
氧化物歧化酶 (SOD)活性的影响
Fig. 4 　Effect of different culture medium on SOD
activity of tissue cultured seedlings
of Paeonia ostii
图 5 　不同处理培养基对凤丹种胚培养苗
过氧化物酶活性的影响
Fig. 5 　Effect of different culture medium on
POD activity in tissue cultured
seedlings of Paeonia ostii
21215 　二茬培养苗的过氧化物酶 ( POD) 活性变化 　
POD(过氧化物酶)的作用一方面可以催化过氧化氢及
某些酚类物质的分解 ,使活性氧的产生和消除处于平
衡状态 ,从而保护细胞免受伤害 ;另一方面 ,它参与叶
绿素的降解。活性氧的产生能引起膜脂过氧化 ,使质
膜透性增强 ,POD 酶活性增强说明膜脂过氧化、膜透性
87 核　农　学　报 23 卷
增加 ,植物生长受到胁迫 ,从而抑制生长。
图 5 反映二茬培养苗过氧化物酶活性的变化。其
变化与超氧化物歧化酶 (SOD) 活性变化相似。在培养
3d 时 T1 和 T2 组明显高于对照 ,然后先上升后下降 ,
对照组在培养 6 d 时最高 ,T1 和 T2 在培养 10d 最高 ,
说明在相应时期的种胚苗受到的环境胁迫最大。
3 　讨论与结论
自毒是一种通过化感作用表现出来的种内竞
争[17 ] 。目前农作物种植过程中的自毒作用是一个热
门的研究课题 ,在水稻、小麦、大麦、葫芦、芦笋等作物
都有报道[18～22 ] 。自毒的生态学意义主要表现在 :一方
面植物可以通过自毒作用抑制同种或近种植物的过快
生长 ,调节植株密度 ,以减少对水、肥、光等资源的竞
争 ,使物种得以延续 ;另一方面 ,植物自毒抑制还表现
出通过对种子萌发的暂时抑制 ,使其避过干旱、寒冷或
是有毒物质的毒害等环境条件 ,在这些条件好转时恢
复萌发[23 ] 。
有报道认为[24 ] ,植物自毒作用主要来源于其自身
产生的酚类化合物和生物萜类等次生代谢物的影响。
凤丹植物体内尤其是根部含有丰富的丹皮酚、没食子
酸、香豆素等次生代谢物 ,这些物质也是较为常见的化
感物质[25 ,26 ] ,特别是香豆素 ,它能够影响植物根和地上
部分的生长[27 ] 。
利用组培技术对重茬药用牡丹离体种胚苗的自毒
影响进行研究 ,可以排除土壤中复杂的环境因素 ,为更
好地探讨自毒作用的机理提供良好的途径。本试验结
果初步证实了凤丹二茬组培苗存在自毒抑制现象 ,形
态上表现为萌发率下降、叶颜色变淡、叶片数量、叶片
长度和茎长度都发生减少 ,与对照相比存在明显差异。
进一步对二茬培养苗的生理指标分析发现 ,二茬苗在
叶绿素含量、根系活力明显低于头茬苗 ,而游离脯氨酸
含量、SOD 和 POD 酶活性则高于头茬苗 ,同时出现先
升后降的变化趋势 ,对照组中 SOD 和 POD 的变化情况
与其他 2 个处理组有相似之处 ,这可能由试验中所使
用的培养基在 25d 时发生营养缺乏所致。头茬苗根系
分泌物和浸出液积累在其生长过的培养基中 ,对二茬
苗的生长产生自毒影响。随着培养时间的变化 ,这种
影响在不断减少 ,但依然维持在一个相对比较高的水
平。在有活性碳的二茬培养基中 ,由于活性碳具有吸
附作用 ,能够吸附培养基中的自毒活性物质 ,从而在一
定程度上减少了自毒作用的影响。
杜英君等发现 ,在组培大豆根系分泌物中鉴定出
来的自毒化感物质主要是香草酸、香草醛和对羟基苯
甲酸这 3 种已知酚酸类化感物质[10 ] 。值得注意的是 ,
在我们的其他试验中曾发现 ,凤丹根系分泌物的高效
液相测定中得到香豆素、香草醛、阿魏酸、肉桂酸和丹
皮酚等主要次生代谢物。由于凤丹喜旱忌湿 ,关于其
组织培养技术的运用一直存在很多问题[28 ] 。在实际
条件下 ,由于存在复杂的环境因素 ,凤丹的根系分泌物
究竟是通过什么样的途径和方式来发挥自毒影响还需
进一步研究。
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(下转第 89 页)
97Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (1) :75～79
臭菘胚性愈伤组织诱导阶段是必需的 ,但添加过高浓
度的 2 ,42D 会使外植体迅速黄化导致细胞死亡 ,不能
形成胚性愈伤组织。原因可能是高浓度 2 ,42D 会诱导
外植体生成乙烯等气体 ,加速外植体的衰老。添加 62
BA 有利于外植体保持较高的活性 ,同时还影响体胚的
发育进程 ,体胚发育培养基中添加适当浓度的 62BA ,
一方面消除胚性愈伤组织中 2 ,42D 的影响 ,另一方面
保持胚性愈伤组织的活性 , 促使体胚进一步发
育[11～13 ] 。体胚发生过程的扫描电镜观察表明 ,日本臭
菘体细胞胚胎发生过程具有和合子胚发生相似的阶
段 ,胚性愈伤组织及胚性细胞复合体形成后 ,继续发育
经历球形胚、盾形胚、子叶胚等发育阶段。研究中发现
球形胚形成后与其周围组织之间产生了结构上的隔
离 ,这正是体细胞胚胎发生的先决条件。球形胚形成
后 ,两极同时发育 ,呈现明显的两极性 ;且每个体细胞
胚最终都能萌发成完整的植株 ,具有相对的独立性。
这两个特征是区分器官发生和体胚发生的标志。植株
再生体系的建立可将胚性愈伤组织表面产生的小芽锥
剥离下来 ,再转接到体胚发生培养基上继续培养使体
胚发育成完整的植株 ,这可能是胚性愈伤组织表面产
生的具有两极性的小芽锥在此培养基上得到了进一步
发育。日本臭菘体胚发生的形态学和超微结构观察表
明 ,本研究初步建立了相对稳定的日本臭菘体细胞胚
胎发生体系 ,为进一步完善体胚发生调控体系和阐明
体胚发生发育机理提供了基础。
致谢 :在试验研究和数据处理过程中 ,得到通化师范学
院生物系顾地周老师的大力支持和帮助 ,谨此致谢。
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