全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 062577204
EMS 对丽格海棠离体诱变的生物学效应
徐美隆1 　张怀渝1 ,2 　唐宗祥2 　任正隆2
(1. 四川农业大学原子能农业应用研究室 ,四川 雅安　625014 ; 2. 四川农业大学植物遗传和育种省级重点实验室 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :将不同浓度 EMS 处理的丽格海棠叶片作为外植体进行离体再生 ,以期获得性状优异的变异材
料。结果表明 :随 EMS 浓度的增加 ,其诱导率和增殖倍数降低 ,而变异率增加 ,014 % (20 ℃,8h) EMS 为
丽格海棠叶片外植体再生的半抑制剂量 ,该浓度为诱变处理的适合浓度。对 21 株表型变异植株进行
RAPD - PCR 分析表明 ,有 12 株的电泳条带表现出多态性 ,进一步证明这些变异是由于基因组 DNA 的
变异而引起的。
关键词 : EMS ;丽格海棠 ;离体诱变 ;生物学效应 ;RAPD2PCR
BIOLOGICAL EFFECT OF EMS MUTAGENSIS IN VITRO ON BEGONIA×RIEGER
XU Mei2long1 　ZHANG Huai2yu1 ,2 　TANG Zong2xiang2 　REN Zheng2long2
(11 Isotope Research Laboratory , Sichuan Agriculture University , Ya’an , Sichuan 　625014 ;
(21State Key Laboratory of Plant Breeding and Genetics , Sichuan Agriculture University , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract :Leaf explants of Begonia ×Rieger were regenerated and treated in vitro with chemical mutagen EMS at different
concentration to get variation. The results showed that induction frequency and proliferation rate were reduced with the increase
of EMS concentration , but the variation rate were increased. 014 % EMS ( 8h , 20 ℃) was the half2lethal dose of the
regeneration for leaf explants , and was the optimum concentration for variation occurrence of Begonia ×Rieger in vitro. The 21
variant plants of Rieger ×Begonia were detected by RAPD2PCR analysis , which showed that DNA polymorphism segments
occurred in 12 variant plants , proving that came from genome.
Key words : EMS ;Begonia ×Rieger ; in vitro mutation ;biological effect ;RAPD2PCR
收稿日期 :2007203214
作者简介 :徐美隆 (19792) ,男 ,四川大竹人 ,在读硕士 ,主要从事花卉转基因及诱变育种研究。Tel :013882431050 ,E2mail :xml1106007 @1631com
通讯作者 :张怀渝 (19642) ,女 ,北京顺义人 ,教授 ,博士 ,研究方向为植物遗传育种及诱变技术在生物科学中的应用。Tel : 083522885081 ; E2mail :
zhyu @sicau. edu. cn
　　丽格海棠 (Begonia ×Rieger) , 又称玫瑰海棠 ,属秋
海棠科秋海棠属的多年生草本花卉。因其花色美、花
型多、花朵大、花期长 ,尤其是在春节开花而深受欢迎。
为了满足消费者对花卉求新求异的特点 ,需不断地推
出花卉新品种 ,而诱变育种是培育花卉新品种的一条
捷径 ,甲基磺酸乙酯 (ethyl methane sulfonate , EMS) 则是
目前应用最广泛也是公认最为有效的诱变剂之一[1 ] ,
已在大豆[2 ] 、花生[3 ] 、大麦[4 ] 、水稻[5 ] 、海甘蓝[6 ] 、葡
萄[7 ] 、蝴蝶兰[8 ]等植物育种中得到了应用 ,在丽格海棠
的育种中应用还未见报道。本研究用不同浓度的 EMS
处理丽格海棠叶片 ,以组织培养获得再生植株 ,以期获
得变异植株 ,筛选出突变品种或材料。
1 　材料与方法
111 　材料
丽格海棠由成都星瑞园艺公司提供。EMS 购自成
都博瑞克公司。RAPD 随机扩增引物 (A 组、B 组、E
组、F 组 ,每组 20 条引物)由赛百盛公司合成。
112 　方法
11211 　诱变处理 　用 0101molΠL ,pH 710 的磷酸缓冲
液配置不同浓度 (0105 %、011 %、012 %、013 %、014 %、
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015 %)的 EMS 溶液 ,过滤灭菌 ,以不含 EMS 的磷酸缓
冲液为对照。取生长 4 个月的丽格海棠健康无菌苗 ,
剪取其倒三叶 ,将叶片切割成 1cm ×1cm 左右的切块 ,
置于盛有不同浓度 EMS 溶液的无菌的三角瓶中 ,用棉
塞塞住三角瓶口 ,于 20 ℃、100rpm 的摇床上处理 8h ,在
超净工作台上倒掉 EMS 溶液 ,用无菌磷酸缓冲液冲洗
1 次 ,无菌水冲洗 2 次 ,用无菌滤纸吸干多余水分 ,将
其接种于生芽培养基 ( MS + 62BA 015mgΠL + NAA
0105mgΠL + KT 011mgΠL + 017 % 琼 脂 + 3 % 遮 糖
pH610) ,每 28d 更换 1 次培养基 ;当叶片诱导出的不定
芽长至 2～3cm 时 ,将其转移至生根培养基 (1Π2MS +
IBA 012mgΠL + NAA 0. 15mgΠL + 017 %琼脂 + 3 %蔗糖
pH610)中 ,每 20d 更换 1 次培养基 ;当长至 5～6cm 左
右健壮的小苗时 ,将其移栽出培养瓶在温室里炼苗
10d 后 ,再移栽至外界环境中。
11212 　数据收集及处理 　每个培养瓶中接种 4 个外
植体 ,对照 6 瓶 ,低浓度 (0105 %、011 %、012 %、013 %)
12 瓶 ,高浓度 (014 %、015 %) 24 瓶。诱导不定芽时 ,统
计不同处理最早出现芽斑的时间、诱导率、增殖倍数 ;
成苗后 ,对突变株数、突变率、突变谱、嵌合体数以及嵌
合率进行了统计。采用 DPS 统计分析软件包对所观
察的数据分别进行差异显著性比较。
诱导率 = (分化出芽的外植体总数Π该浓度下外植
体总数) ×100 %
增殖倍数 = (成苗总数Π该浓度下分化出芽的外植
体总数) ×100 %
突变率 = (突变苗总数Π该浓度下成苗总数) ×100 %
嵌合率 = (总变异中嵌合体株数Π总变异株数) ×
100 %
11213 　RAPD 检测
从经 EMS 处理的再生植株中选取形态变异的植
株 ,参照Dellaporta[9 ]的方法并略加改动提取其总DNA ,
利用赛百盛公司合成的 RAPD 引物 A、B、E、F 进行
RAPD2PCR 反应 ,反应在扩增仪 PTC2200 中进行。扩增
反应体系 20μl ,其中含 10 ×PCR Buffer 2μl ,25mmolΠL
Mg2 + 112μl ,10mmolΠL dNTPs 015μl、5UΠμl 的 TaqDNA 聚
合酶 012μl、随机引物 1μl , 40ngΠμl 的模板 DNA 1μl。
RAPD2PCR 反应程序为 : 94 ℃预变性 ,3min ; 94 ℃变性
1min ,37 ℃退火 1min ;72 ℃延伸 2min ,共 40 个循环 ,最
后 72 ℃维持 10min。每个反应 2 次重复。扩增产物在
1 %琼脂糖凝胶中电泳 ,EB 染色 ,BIO2RAD 凝胶扫描仪
分析结果。
2 　结果与分析
211 　不同浓度 EMS 对外植体诱导和成苗的影响
由表 1 可知 ,当 EMS 浓度大于 011 %时 ,则对丽格
海棠叶片诱导成苗的抑制作用随浓度的增加而上升 ,
与张书标[10 ]用 NaN3 处理花生丛生芽的效果一致 ,其
影响主要表现在诱导率、增殖倍数和出现芽斑的时间
上。EMS 浓度大于等于 011 %时 ,增殖倍数表现出显
著差异 ,EMS 浓度大于或等于 012 %时 ,出现芽斑的时
间明显迟于对照 ,而当浓度大于或等于 013 %时 ,诱导
率与对照差异显著。从表 1 还可看出 ,用 EMS 以丽格
海棠叶片为外植体进行不定芽诱导时 ,其半致死剂量
为 014 %。
表 1 　不同浓度 EMS对丽格海棠诱导成苗的影响
Table1 Effect of EMS at different concentrations on shooting induction of Begonia ×Rieger
EMS浓度
EMS conce2
ntration
( %)
外植体数
No. of
explant
感菌数
No. of
contami2
nation
出芽外植体数
No. of explant
forming bud
诱导率
induction
frequency( %)
成苗数
No. of
seedling
增殖倍数
proliferation
rate ( %)
出现芽斑时间
buding
time (d)
0 32 0 29 90163 a 399 13177 a 31
0105 64 1 58 92106 a 803 13184 a 30
011 64 2 52 83187ab 401 7171 b 31
012 64 0 46 71188ab 243 5128 c 37
013 64 3 42 68185 b 155 3169 d 40
014 128 8 58 49114 c 160 218 e 46
015 128 5 48 39102 c 92 1192 f 43
　　注 :同列中不同小写字母表示在 0105 水平上显著。
Note : The different small letter in the same column means significant difference at P < 0105.
　　由于该试验还在进行中 ,所记录的只是苗期观察
结果。由表 2 可知 :丽格海棠组织培养本身存在变异 ,
但变异率较低 ( ≤1121 %) ,而 EMS 能够提高丽格海棠 的变异率 ,且随浓度的增加变异率增加。但其变异谱却不是随浓度的增加而增加 , EMS 浓度为 014 %时变异谱最大 ,达 12 种之多 ,且在这种浓度下 ,突变株成活
875 核　农　学　报 21 卷
率也是最大 ,为 21173 %。
表 2 　不同浓度 EMS对丽格海棠的诱变效果
Table 2 　The effect of EMS at different concentrations on variation of Begonia ×Rieger
EMS浓度
EMS concen2
tration ( %)
总株数
No. of
plant
变异株
variant
plant
变异率
No. of rate of
mutation ( %)
变异谱
variation
range
变异成活数
No. of survival
plant with
mutation
变异株成活率
rate of
survival plant
withmutation
( %)
嵌合体
No. of
chimaera
嵌合率
chimerism
rate ( %)
0 413 5 1121 % 3 1 20100 0 0
0105 420 18 4129 % 6 3 16167 7 38139
011 401 33 8123 % 8 4 12112 12 36136
012 243 23 9147 % 7 3 13104 8 34178
013 155 18 11161 % 7 2 11111 8 44144
014 160 23 14138 % 12 5 21173 9 39113
015 92 21 22182 % 6 3 14129 7 33133
　　在 EMS 诱导的丽格海棠诸多变异株中 ,以白化苗
和黄化苗居多 ,两者之和达总变异的 76. 60 % ,变异株
的成活率普遍很低 ,最高的不超过 21. 73 % ,特别是黄
化苗和白化苗 ,成活率为 0。这些变异株有 33. 33 %～
44. 44 %的是嵌合体 ,其存在类型主要表现为 3 种 (图
1) :1、植株上的某叶片、叶柄或茎变异 ;2、植株的叶片
或茎的某部分为变异 ;3、整株植株变异。变异类型主
要包括 :黄化、白化、叶片、小而厚、叶片形状不规则、叶
片向里凹、一柄双叶、叶柄扁平、植株矮化、植株红化
等。
213 　变异株系的 RAPD 检测
选用 80 条 RAPD 引物对丽格海棠基因组总 DNA
进行随机扩增 ,筛选得到清晰扩增产物、重复性好的
36 种随机引物 (表 3) 。观察所有的扩增电泳条带 ,36
种引物扩增出 224 条带 ,平均每条引物扩增 6122 条
带 ,扩增产物分子量在 012～117kb 之间。 图 1 　部分突变株Some of variant plants1 :叶片小而厚 ; 　2 :边缘黄化 ;3 :叶柄扁平 ; 　4 :白化嵌合体1 : variant plant of small and thick leaves ;2 : variant plant of chlorosis on edge of leaves ;3 : variant plant of flat petiole ;4 : variant plant of albino chimera
表 3 　RAPD 扩增时采用的 36 种随机引物
Table 3 　Thirty2six random primers which were used in RAPD
A1 CAGGCCCTTC A5 AGGGGTCTTG A7 GAAACGGGTG A9 GGGTAACGCC
A10 GTGATCGCAG A11 CAATCGCCGT A17 GACCGCTTGT A19 CAAACGTCGG
B1 GTTTCGCTCC B3 CATCCCCCTG B6 TGCTCTGCCC B7 GGTGACGCAG
B8 GTCCACACGG B10 CTGCTGGGAC B18 CCACAGCAGT B19 ACCCCCGAAG
B20 GGACCCTTAC E1 CCCAAGGTCC E2 GGTGCGGGAA E3 CCAGATGCAC
E6 AAGACCCCTC E7 AGATGCAGCC E9 CTTCACCCGA E13 CCCGATTCGG
E15 ACGCACAACC E16 GGTGACTGTG E18 GGACTGCAGA E20 AACGGTGACC
F2 GAGGATCCCT F3 CCTGATCACC F5 CCGAATTCCC F9 CCAAGCTTCC
F12 ACGGTACCAG F13 GGCTGCAGAA F14 TGCTGCAGGT F15 CCAGTACTCC
　　将筛选出来的 36 种引物分别对 21 株形态变异的
植株进行随机扩增 ,将其扩增电泳条带分别与对照 (20
株未经 EMS 处理的丽格海棠混合总基因组 DNA) 的扩
增电泳条带进行比较 ,有 12 株变异植株 (编号分别为
B01、B02、B03、1061、3、1015、859、905、1291、1492、80、
1238) 、12 个引物 (编号分别为 A2、A5、A7、A10、A11、
A17、A18、B3、B20、E6、F2、F19) 的电泳条带表现出多态
性。其中 ,引物 A10 分别对变异植株 859、905、1238 扩
增出多态性条带 ,而变异植株 1061 分别由引物 A2、
A18 扩增出多态性条带 ,859 分别由引物 A10、B3 扩增
975　6 期 EMS对丽格海棠离体诱变的生物学效应
　　　　
图 2 　不同引物对不同突变株的扩增结果
Fig. 2 　The amplification result of different primers for different mutant plants
M:marker ;1 :植株 1061 ; 3 :植株 3 ; 5 :植株 905 ; 7 :植株 859 ; 9 :植株 1238 ;
11 :植株 1238 ; 13 :植株 1015。箭头所指为多态性片段。
M:marker ;1 : plant 1061 ;3 : plant 3 ;5 : plant 905 ;7 : plant 859 ;9 : plant 1238 ;
11 : plant 1238 ;13 : plant 1015. Arrows show polymorphic DNA segments
出多态性条带 ,1238 分别由引物 A10、B20 扩增出多态
性条带。
3 　讨论
311 　诱变剂 EMS 的有效性
EMS 是一种化学诱变剂 ,因其诱变频率高、诱变范
围广而在植物诱变育种中得到广泛应用 ,并已获得很
多有益突变体。如安学丽等[11 ] 通过 EMS 对玉米自交
系进行诱变 ,在 M1 代获得了 11173 %的总突变率 ,比
辐射诱变的突变率 (平均诱变率仅有千分之几) 高 10
～100 倍。本试验通过 EMS 对丽格海棠叶片的离体诱
变 ,获得了较高频率的突变 ,且变异谱较广 ,有利于丽
格海棠品种的改良 ,同时也证明 EMS 对丽格海棠是一
种有效的诱变剂。
随处理浓度、处理温度及处理时间的增加 ,EMS 对
丽格海棠叶片丛生芽诱导的抑制加强 ,表现在丛生芽
的诱导和丛生芽数目的下降。一般是根据半致死剂量
来确定适宜的诱变浓度 ,本研究表明 :014 %的 EMS 在
20 ℃条件下处理 8h 对于丽格海棠叶片诱变处理是最
适的。
312 　离体诱变再生途径的选择
将 EMS 处理过的丽格海棠叶片通过直接诱导成
芽 (器官发生途径)所得到的变异植株有将近一半以嵌
合体的形式存在 ,这一现象在转基因中尤为常见 ,特别
是葡萄转基因 ,许多学者通过器官发生途径获得了较
高频率的不定芽 ,但迄今为止通过此种途径获得的葡
萄转基因植株全为嵌合体。Colby[12 ] 等对与农杆菌共
培养的葡萄叶片进行解剖学和组织化学分析 ,发现直
接的器官发生会产生嵌合的转基因植株 ,认为这是不
定芽起源于多个细胞的原因。因此 ,要克服嵌合现象 ,
获得均一的变异植株 ,可从改变再生体系的发生途径
着手。一般认为 :胚状体起源于单个细胞 ,将诱变剂处
理的外植体通过胚状体发生途径进行再生 ,可能降低
变异植株的嵌合率。
313 　变异植株的 RAPD 反应谱带分析
RAPD 技术的应用[13、14 ]为更深入地研究 DNA 的内
在规律提供了有效的技术手段。利用 RAPD 可以在一
次反应中用不同引物检测出基因组的多个位点 ,进而
快速找到两组 DNA 样品间的多态性差异。特别是在
诱变育种中 ,RAPD 为变异株的筛选提供了可靠而快
速的检测手段。
本研究利用 RAPD 技术对 21 株丽格海棠变异株
进行随机引物多态性扩增 ,有 12 条随机引物在变异植
株和对照植株之间共扩增出 17 条差异片段 ;有 3 条随
机引物扩增出的条带虽然与对照出现相同的谱带 ,但
有的条带的荧光强度有深浅之分。差异性条带表明
EMS对丽格海棠的基因组 DNA 产生了 突变 ,从而导
致其表型上的差异。差异性条带即为突变位点 ,这为
选择有益突变株提供了分子依据。
参考文献 :
(下转第 596 页)
085 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (6) :577～580
酸) 、Ser (丝氨酸) 、Glu (谷氨酸) 、Gly(甘氨酸) 、Cys (半
胱氨酸) 、NH3 (氨)的含量有明显的影响 ,除 Cys 和 Pro
外 ,第 5 天各种氨基酸的含量明显降低。
3 　结论
11 冷食菜受污染的程度严重 ,细菌总数和大肠菌
群是主要的污染菌。利用辐照技术可以降低冷食菜的
微生物含量 ,确保冷食菜的微生物的卫生安全[7 ,11 ] 。
21 接种到以花生和芹菜为原料的冷食菜中沙门
氏菌和李斯特菌的 D10 值分别约为 01284kGy 和
01296kGy。接种于同一介质中的不同致病菌对辐照的
敏感程度不同 ,接种于冷食菜中的李斯特菌对辐照的
耐受性略高于沙门氏菌[10 ] 。
31 用低于 210kGy 辐照处理冷食菜对其感官品
质、粗蛋白和氨基酸没有明显的影响 ,这和 Xuetong Fan
的研究结果一致[12 ] ,210kGy 可以降低冷食菜中的细菌
总数 2～3 个数量级 ,降低接种于冷食菜中的沙门氏菌
和李斯特菌两种致病菌 6 个数量级以上。可见 ,
210kGy的辐照剂量能有效控制贮藏期间芹菜花生冷
食菜微生物的生长 ,降低致病菌的危害 ,且对该冷食菜
的营养和感官品质无不良影响。
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