全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052375204
同步辐射软 X射线 N k 对产L2乳酸米根霉的诱变效应
罗水忠1 　姜绍通1 　郑　志1 　蒋诗平2 　胡锦艳1
(11 合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009 ; 21 中国科学技术大学国家同步辐射实验室 ,安徽 合肥　230029)
摘 　要 :采用同步辐射软 X射线 N k 对米根霉 AS 313461 菌株进行辐射诱变 ,研究其对米根霉致死、菌落
形态、种子培养以及发酵培养等特性方面的影响。结果表明 ,致死率曲线呈现为典型的马鞍型曲线 ,辐
射剂量为 0172 kGy 时菌株致死率最低 ;软 X射线 N k 辐照对米根霉菌落形态有一定影响 ;种子培养特性
和发酵培养特性的诱变前后对比表明 ,种子延滞期缩短了 3h ,突变株 N215 的 L2乳酸产量提高了
2516 % ,LDH活性提高了 9518 % ,ADH的活性降低了 7717 %。
关键词 :同步辐射 ;软 X射线 ;米根霉 ;L2乳酸 ;诱变效应
MUTAGENIC EFFECTS OF SYNCHROTRON SOFT X2RAY WITH RESONANCE ENERGY
OF Nk IRRADIATION ON Rhizopus oryzae
LUO Shui2zhong1 　J IANG Shao2tong1 　ZHENG Zhi1 　J IANG Shi2ping2 　HU Jing2yan1
(11School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei , University of Technology , Hefei Anhui ,230009 ;
21National Synchronous Radiation Lab , University of Science and Technology of China , Hefei , Anhui ,230029)
Abstract :Mutagenic effects , such as mortality , colony morphology , culture characteristic of Rhizopus oryzae irradiated by
synchrotron soft X2ray , were studied preliminarily. The results show that the mutagenic effects of synchronous radiation soft2X
ray on Rhizopus oryzae AS 313461 strain were obvious. Mortality curve appeared“saddle”shape and the lowest lethal rate was
shown with dose of 0172 kGy. Difference of colony morphology from original strain was observed. Lag phase of inocula
shortened by 3h. Quantity of L2lactic acid and LDH specific activity increased by 2516 % and 9518 % , respectively , whereas
ADH specific activity reduced 7717 %.
Key words :synchronous radiation ; soft X2ray ; Rhizopus oryzae ; L2lactic acid ; mutagenic effects
收稿日期 :2005211223
基金项目 :教育部博士点基金项目 (20040359008) 、教育部研究生创新基金资助 (20041216S)
作者简介 :罗水忠 (19752) ,男 ,江西瑞昌人 ,讲师 ,研究方向为工业微生物遗传育种. Email : luoshuizhong @1631com。姜绍通为通讯作者。　　同步辐射是电子在高能加速器中以接近光速作圆周运动时发出的电磁辐射 ,它可提供 210～ 514nm 波长的单色软 X射线 ,其波长范围覆盖 C、N、O 这 3 种重要生命元素的 K层电子吸收边 ,是研究辐射生物学效应的良好光源[1 ] 。已有众多国内外专家学者对软 X射线辐射生物效应及其机制进行了初步探究 ,发现软X射线可使 DNA 发生碱基损伤和单、双链断裂及分子内、分子间交联等损伤 ,诱导细胞发生失活、恶性转化、染色体畸变、基因突变等[2～4 ] 。但这些生物学效应的研究大多数是以植物、动物细胞为对象[5 ] ,而对微生物进行同步辐射处理并研究其生物学效应的报道不多。 微生物作为辐照诱变对象 ,具有均一性好、易培养、周期短、性状表达简单且明显等特点。因此 ,开展同步辐射软 X射线辐照微生物的诱变效应及其相关机理研究 ,可开发新的高效辐射诱变源 ,有助于性状优良的工业菌株的选育。乳酸为重要的工业有机酸 ,米根霉是发酵生产L2乳酸的主要菌种[6 ] 。本文报道了利用国家同步辐射实验室软 X射线对米根霉 As 313461 孢子的致死效应及对菌株其他特性影响的研究结果。
573　核 农 学 报　2006 ,20 (5) :375～378Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
米根霉 ( Rhizopus oryzae) As 313461 购于中国科学
院菌种保藏中心 ;米根霉 N215 为同步软 X 射线 N k 辐
照米根霉 313461 后获得的突变株。
斜面培养基为 PDA 培养基 ; YPD 平板培养基含
2 %葡萄糖、015 %蛋白胨、013 %酵母浸膏及 2 %琼脂 ;
种子培养基含 10 %葡萄糖、014 % (NH4 ) 2 SO4 、0102 %
KH2 PO4 、01025 % MgSO4 ·7H2O、01044 % ZnSO4 ·7H2O、
01001 % FeSO4 ; 发酵培养基含 12 %葡萄糖、014 %
( NH4 ) 2 SO4 、0103 % KH2 PO4 、01025 % MgSO4 17H2O、
01044 % ZnSO4 17H2O、6 % CaCO3 ,碳酸钙单独灭菌后 ,
在发酵前加入。
112 　方法
11211 　培养条件 　(a) 斜面培养和 YPD 平板培养 :
32 ℃±1 ℃,培养 1～2d ; (b) 米根霉种子培养 :100ml 三
角瓶装入 10ml 种子培养基 ,115 ℃灭菌 20min ,按 105～
106 个孢子Πml 的量接种 , 32 ℃±1 ℃, 200rΠmin 培养
24h ; (c) 发酵培养 :500ml 三角瓶装入一定量发酵培养
基 ,115 ℃灭菌 20min ,接种一定量的对数期种子培养
液 ,32 ℃±1 ℃,200rΠmin 培养 72h。
11212 　同步辐射软 X 射线 Nk 辐射诱变 　无菌制备
106 个Πml 孢子悬液 ,分别取 5μl 均匀涂于直径为 5mm
的纤维素膜片上 ,再将膜片装于样品架 ,然后放入同步
辐射软 X射线线路的真空舱。在真空中 ,孢子样品对
311nm 软 X射线的吸收剂量率约为 411Gy/ (mA·s) (辐
射剂量计算方法由中国科技大学国家同步辐射实验室
提供) 。分别对样品进行 0 (真空对照) 、0124、0148、
0172、0196 和 1120 kGy 共 6 个剂量的辐照 ,每剂量两个
重复。辐照时 ,束流衰减速率为 01002 mA/ s ,靶室真空
度为 116 ×10 - 3 Pa。
将辐照后的样品载体放入装有定量生理盐水的密
闭塑料管中充分浸泡、振动 ,以将干燥后附于载体上的
孢子振下 ,稀释后混平板计数 ,每个稀释度 4 次重复。
11213 　AYPD 平板突变株筛选
在添加 016 %丙烯醇的 AYPD 培养基中 ,乙醇脱氢
酶 (ADH)能将丙烯醇转化为有细胞毒性的丙烯醛 ,因
此 ,AYPD 平板上生长的菌株的 ADH 活性必然很低。
由丙酮酸的代谢途径可知 ,若在 ADH作用下生成乙醇
受阻 ,则在乳酸脱氢酶 (LDH) 作用下生成乳酸的转化
率将增加。取适量的辐照样品收集液 ,涂布于 AYPD
平板上 ,32 ℃培养 60h 后 ,筛选米根霉产乙醇的主要分
支酶 ADH 活性较低的突变株 ,挑取长出的单菌落于
PDA 斜面保藏备用。
113 　分析方法
11311 　生物量的测定 　米根霉种子液离心后弃上清
液 ,将菌丝沉淀烘干至衡重 ,称菌丝干重。发酵液过滤
后 ,蒸馏水冲洗干净 ,除去多余的碳酸钙 ,挤干水分 ,称
菌丝湿重。
11312 　乳酸含量和 pH测定
乳酸用反相 HPLC法测定[7 ] 。pH 用精密 pH 计测
定。
11313 　还原糖、LDH、ADH活力及氨基氮的测定
还原糖测定用 DNS 法 ,氨基氮测定按参考文献
[8 ]进行 ,LDH、ADH活力测定按参考文献[9 ]进行。测
定 ADH活力时稍做修饰 ,即将丙酮酸钠溶液换成乙醛
溶液作为反应底物。
2 　结果与分析
211 　同步软 X 射线 N k 辐射对米根霉孢子的致死效
应
本试验将射线的流强控制在大致相同的范围内 ,
以相对剂量为横坐标 ,致死率为纵坐标作图 1。从图 1
可以看出 :致死曲线呈现“马鞍型”;于 0172 kGy 时处
于“马鞍”的底部 ,表现出一定的刺激效应 ,此后 ,致死
率随着辐射剂量的增加而增大。
图 1 　同步软 X射线 N k 辐射对米根霉孢子的致死效应
Fig. 1 　Dose2effect curve of SR soft X2ray N k on the
lethal rate of Hizopus oryzae spores
212 　同步软 X 射线 N k 辐射后的米根霉菌落形态特
征
与出发菌株As 313461 相比 ,米根霉孢子经同步软
X射线 N k 照射后 ,在 AYPD 平板培养基上 ,表现为乳
白色菌落大小不均匀 (图 2) ,初期表现细胞生长发育
673 核　农　学　报 20 卷
极为缓慢 ,处于修复阶段 ;在 PDA 平板培养基上生长
较快 ,菌丝非常茂盛 ,较早萌发孢子 ,且成熟得较快 ,大
部分为黑孢子 ,菌落疏松如棉絮状 ,颜色为暗灰色。挑
取 AYPD 平板上透明圈最大的菌落 ,反复纯化后得米
根霉变异株 N215 (图 2) 。
图 2 　诱变后的米根霉在 AYPD 平板上的菌落
Fig. 2 　A mutant colony of As313461 on AYPD plate
213 　米根霉 N215 种子培养特性
米根霉N215 种子培养特性见图 3。与出发菌株种
子培养特性 (数据未显示)相比 ,突变株 N215 在培养期
内的各项指标还原糖量、pH值、生物量、氨基氮量及L2
乳酸的产量随时间化的趋势基本相当 ,但其延滞期缩
短 3h ,且L2乳酸产量、葡萄糖的利用率都有明显提高。
214 　米根霉 N215 的发酵特性
与出发菌株的发酵特性相比 ,突变菌株 N215 在整
个发酵过程中各项参数的变化趋势和出发菌株大体相
当 (图 4) ;L2乳酸产量随发酵时间的延长而显著增加 ,
并在 72h 达到最大值 (9211 gΠL) ,比出发菌株发酵终点 图 3 　米根霉变异株 N215 的种子培养特性Fig. 3 　Culture characteristic of mutant N215的L2乳酸产量 (73135 gΠL) 提高了 2516 % ;生物量亦随发酵时间的延长而增加 (图 4a) ;发酵液中还原糖的含量在 48～54h 内急剧减少 (图 42a) ;LDH 活性随发酵时间延长而逐渐增强 ,发酵至 48h 时达到最大值 (4117UΠml 酶液) ,而出发菌株 LDH 活性发酵至 54h 才达到最大值 2113 UΠml 酶液) ,米根霉 N215 的 LDH 活性比出发菌的提高了近 9518 % ,以后逐渐下降 ,在发酵终点时降到最低 (图 42b) ;而 ADH 活性随发酵时间延长而缓慢降低 ,发酵至 48h 时达到最小值 01069 UΠml 酶液 ,而出发菌株 ADH活性发酵至 54h 时达到最低 0131 UΠml 酶液 ,米根霉 N215 的 ADH 活性比出发菌的降低了约 7717 % ,以后缓慢增强直至发酵终点 (图 42b) 。米根霉 N215 发酵特性的改变表明了 X 射线 Nk 辐射在其代谢途径中的诱变效应。出发菌株和突变株 N215的发酵特性比较见表 1。
图 4 　出发菌株和突变株 N215 的发酵特性
Fig. 4 　Fermentation characteristics of As313461 and mutant N215
773　5 期 同步辐射软 X射线 Nk 对产L2乳酸米根霉的诱变效应
表 1 　出发菌株和突变株 N215 的发酵特性比较
Table 1 　Comparison of fermentation characteristics between As313461 and mutant N215
菌株
strains
生物量
biomass(gΠL) L2乳酸L2lactic acid (gΠL) 还原糖reducing sugar (gΠL) 乳酸脱氢酶LDH(UΠml) 乙醇脱氢酶ADH(UΠml)
米根霉 AS313461
Rhizopus oryzae
AS 313461 1315 (72) 73135 (72) 4100 (72) 2113 (54) 01310 (54)
突变株 N215
mutant N215 1511 (72) 92110 (72) 2189 (72) 4117 (48) 01069 (48)
　　注 :括号内的阿拉伯数字表示培养时间 (h) 。
Note : data in brackets mean the culture time (h) .
3 　讨论
目前 ,同步辐射软 X 射线在辐射生物学方面的研
究日益受到重视。国内利用同步辐射软 X 射线辐照
农作物种子[10 ] 、细菌[11 ] 和质粒[12 ] 时 ,都发现其具有较
高的诱变效应。本研究发现 ,同步辐射软 X 射线对米
根霉孢子萌发、菌落形态以及菌株发酵特性等方面亦
具有显著的诱变效应。
辐射对生物体的作用方式 ,分直接作用和间接作
用两种。在辐照靶室真空度 10 - 3 Pa 下 ,孢子所含水分
很快蒸发 ,软 X 射线对孢子的损伤以直接作用为主。
X射线与物质相互作用时 ,主要产生 3 种效应 :光电效
应、康 - 吴效应和电子对的产生。究竟发生哪种效应 ,
主要与射线的能量 E和介质的原子序数 Z有关[13 ] 。N
原子的 K层电子吸收边 ,能够强烈地吸收软 X 射线。
因此 ,N k 辐照孢子 (重要组成元素多为低 Z值的元素)
时光电效应是最主要的 ,能够导致孢子在 DNA 等分子
水平上的原初损伤。分子水平的损伤是微观而基本的
损伤 ,在它们发展成宏观的生物学效应之前有一个生
物学放大过程 ,代谢过程对原初损伤的发展有重要的
修饰作用。孢子在萌发前 ,基本上不存在任何代谢活
力 ,其 DNA 受损后并不立即表现某种生物学效应 ,只
有在萌发后培养代谢过程中才表现出来。如果 DNA
损伤严重 ,将导致致死效应 ;相反 ,若 DNA 损伤较轻 ,
则孢子在萌发过程中能将其修复而存活下来 ,产生突
变菌株 ,表现出间接的诱变效应。但是 ,对于突变产生
过程中的关键问题 ———软 X 射线对孢子 DNA 损伤的
修复机理有待于进一步深入研究。
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