全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032370204
用核素示踪研究小麦根系 Na + 外排速率的两种方法
王春梅1 　李　湛2 　伍国强1 　张金林1 　王锁民1
(11 兰州大学草地农业科技学院 ,甘肃 兰州　730000 ; 21 兰州大学核科学与技术学院 ,甘肃 兰州　730000)
摘 　要 :采用22Na + 同位素示踪法研究小麦在 NaCl 胁迫下根系的 Na + 外排能力 ,并对植株法与外排液法 2
种测定方法进行了比较。结果表明 ,小麦根系在 NaCl 胁迫下具有明显的 Na + 外排能力 ,且随着 NaCl 浓
度增加而增强 ,以阻止过多的盐分在体内积累。使用外排液法在 3 个盐浓度下所测得 Na+ 外排速率均
略高于植株法 ,但 2 种测定方法差异不显著 ,结果基本一致。综合比较表明 ,在植物根系 Na+ 外排速率
的测定中 ,拟推荐采用外排液法 ,使操作简便并能减少系统误差。
关键词 :放射性同位素 ;22Na + 示踪技术 ;Na + 外排速率测定方法
METHODS OF Na + EFFLUX RATE OF WHEAT ROOT MEASURED BY NUCLIDE TRACER
WANG Chun2mei1 　LI Zhan2 　WU Guo2qiang1 　ZHANGJin2lin1 　WANG Suo2min1
(1. School of Pastoral Agriculture Science and Technology , Lanzhou University , Lanzhou , Gansu 　730000 ;
2. School of Nuclear Science and Technology , Lanzhou University , Lanzhou , Gansu 　730000)
Abstract :Two methods of nuclide isotope (22Na + ) tracer methods : plant analyzing and efflux solution analyzing , were used
and compared for measuring Na + efflux rate of wheat root . The results showed that roots of wheat had evident ability to pump
the Na + out and enhanced along with the increase of NaCl stress concentration to prevent excessive Na+ accumulated in plant .
Na + efflux rates were no significant difference between the two methods , though the rates were little higher from efflux solution
analyzing method. The efflux solution analyzing method was recommended due to its facility and low system error.
Key words :radioactive isotope ; 22Na + tracing technique ; Na + efflux rate analyzing method
收稿日期 :2007209217 　接受日期 :2007212226
基金项目 :国家自然科学基金 (30770347 , 30671488 , J0630962) ,863 计划 (2006AA10Z126)
作者简介 :王春梅 (19812) ,女 ,四川乐至人 ,硕士研究生 ,主要从事植物逆境生理生态与分子生物学研究。E2mail : wang
-
chm05 @lzu. cn
通讯作者 :王锁民 (19652) ,男 ,甘肃宁县人 ,博士 ,教授 ,主要从事植物逆境生理生态与分子生物学研究。E2mail : smwang @lzu. edu. cn。　　土壤盐渍化严重影响农业的持续生产[1 ] 。全球15 亿 hm2 可耕地中 ,约 5 %受盐渍影响[2 ] 。在盐分胁迫下 ,植物进化出了多种抗盐机制 ,如盐腺分泌、液泡膜区隔化、离子选择性吸收以及根系质膜上的 Na + 外排等[1 ,3 ] 。动物与微生物质膜上的 Na + 外排已经很清楚 ,但植物质膜上的 Na + 外排还存在争议[4 ] 。目前发现拟南芥与水稻上可以通过质膜 Na + ΠH+ 逆向转运蛋白[5～7 ] 进行 Na + 外排 ,但在小麦上还没有充分证据。根系质膜上的 Na + 外排是否也是小麦的主要耐盐机制之一 ?植物根系离子外排速率的核素示踪测定方法主要有两种 :一种是通过测定植株体内示踪核素的减少来 计算离子的外排速率[8 ] , 即植株法 ;另一种是通过测定介质中示踪核素的增加量来计算离子的外排速率[9～16 ] ,即外排液法。两种方法尚缺乏比对试验。本试验研究了盐分胁迫下小麦的耐盐策略及根系的 Na +外排情况 ,并比较了植株法与外排液法对根系 Na + 外排速率的测定结果。1 　材料与方法111 　材料培养及盐处理将小麦种子 ( Triticum aestivum ,陇春 23) 置白瓷盘中铺有吸水纸的筛网架上 ,于 25 ℃暗培养 ,浇蒸馏水
073　 核 农 学 报　2008 ,22 (3) :370～373Journal of Nuclear Agricultural Sciences
萌发。3d 后改光照培养 16h (昼)Π8h (夜) ,光强度约为
600μmolΠm2 ,并改浇 Hoagland 营养液。光照 2d 后移至
盛有 Hoagland 营养液的培养盒中 ,每 2 棵为一组 ,每个
培养盒内设置 8 组 ,继续用通气泵加气培养 2d 后 ,以
含有 0、25、100、200mmolΠL NaCl 的营养液作为盐处理
液进行胁迫处理 ,处理时间为 7d。
112 　22Na + 示踪核素标记
22Na + 100μCi 购自中国同位素公司 ,用去离子水
稀释至 1ml 备用。配制标记液时从中取出 10μl ,分别
加入到 5ml 25、100、200mmolΠL NaCl 的盐处理液中混匀
(22Na + 的量对 NaCl 浓度的影响可以忽略) 。再从三个
浓度的标记液中各取出 10μl 计数 ,3 次重复 ,以计算示
踪核素22Na + 的比活度 Sa (cpm Πμmol Na + ) 。然后将盐
胁迫处理 7d 后的小麦转移到相应盐浓度的标记液中
进行标记 ,12h 后进行下面的试验。
113 　分析测定
11311 　外排液测定法 　参考 Davenport (2005) [15 ] 的方
法 ,经过适当修改 ,步骤如下 :为消除地上部蒸腾对
22Na + 外排的影响 ,外排前对标记 12h 后的麦苗进行去
头留茬处理 (留茬 115cm) 。去头 15min 后从标记液中
取出麦苗 ,用吸水纸轻轻吸干根表面水分 ,放入含 20
mmolΠL CaCl2 的对应浓度盐处理液中润洗 3 次 ,分别为
2min ,2min ,3min ,以去掉质外体空间的22Na + 。轻轻吸
干根表面水分 ,放入 5ml 对应外排液 (对应浓度的盐处
理液)中外排 ,外排 2min 后取出 ,吸干表面水分。从根
茎结合处分开茬与根 ,测定根鲜重。吸取 1ml 外排液
与 2ml 闪烁液在计数管中混匀成均相 ,静置 12h 后在
液体闪烁计数器 (Beckman LS6500) 中计数 ,测定并计
算外排液中22Na + 每分钟的计数 (cpm) ,设 8 个重复 ,每
个重复 2 棵苗。
11312 　植株测定法 　参考Matsushita 与Matoh (1991) [8 ]
的方法 ,经过适当修改 ,步骤如下 :前 4 个步骤同外排
液法 (包括 7d 盐处理 ,12h 标记 ,15min 去头处理 ,洗掉
质外体空间的22Na + 后吸干表面水分) ,然后分两批进
行试验。一批小麦用于测定外排前植株体内的 cpm :
分开茬与根 ,测定鲜重后将根放入计数管 ,加入 2ml 闪
烁液 ,静置 12h 后计数。另一批小麦用于测定外排后
植株体内剩下的 cpm :将根浸入 5ml 对应外排液中外
排 ,2min 后取出 , 轻轻吸干根表面水分 , 放入含
20mmolΠL CaCl2 的对应浓度盐处理液中润洗 3 次 (同
上) ,以去掉质外体空间的22Na + 。取出并再次轻轻吸
干根表面水分 ,分开茬与根 ,测定鲜重后将根放入计数
管 ,加入 2ml 闪烁液 ,静置 12h 后计数。设 8 个重复 ,
每个重复 2 棵苗。外排试验结束后对所有样品计数并
测定本底值。
11313 　根系 MDA 含量测定 　按照 111 的材料培养方
法将培养好的小麦以 0、25、100、200mmolΠL NaCl 的营
养液处理 7d 后 ,取小麦根系 ,吸干根表面水分 ,测定根
鲜重。根中丙二醛 (MDA)含量测定步骤参见赵世杰等
(1994) [17 ] 。设 8 个重复 ,每个重复 2 棵苗。
11314 　数据处理及计算 　22Na + 的比活度 Sa = 103 ×
(标记液计数 - 本底值)Π(标记液体积 ×标记液中 NaCl
浓度) ; (式中 :22Na + 的比活度单位 cpmΠμmolNa + ,标记
液计数为 10μl 的计数 ,NaCl 浓度单位 mmolΠL)
外排速率 (外排液法) = 外排液计数Π(22Na + 的比
活度 ×根鲜重 ×外排时间)
外排速率 (植株法) = (外排前根中计数 - 外排后
根中计数)Π(22Na + 的比活度 ×根鲜重 ×外排时间)
式中 ,外排速率单位μmolNa + Π(g·root FW·min) ,外
排液计数 = 1ml 外排液 cpm ×5 ,根鲜重单位 g ,外排时
间 2min。
所有数据用平均值 ±标准误差表示 ,用 SPSS 程序
对所有数据进行差异显著性分析。
2 　结果与分析
211 　NaCl 处理对小麦根鲜重的影响
从表 1 可以看到 ,小麦根系鲜重随着盐浓度的升
高差异不显著 ,说明 7d 的盐分递增处理并没有显著影
响到小麦根系的生长 ,以此为基础的试验是具有可行
性和可比性的。
表 1 　不同浓度 NaCl 处理对小麦根系鲜重的影响
Table 1 　Effects of NaCl concentrations
on fresh weight of wheat root
NaCl 浓度
NaCl concentration (mmolΠL) 根鲜重fresh weight of root (g)
0 0111 ±01008a
25 0111 ±01005a
100 0110 ±01007a
200 0110 ±01008a
注 :鲜重值以平均值±标准误差表示 ;相同列上数据后的不同字母表示
差异显著 , P < 0105 (Duncan test) 。下图同.
Note: Values are means ± SD ; Different letters after data within the same
column indicate significant difference at P < 0105 (Duncan test) .
212 　NaCl 处理对丙二醛( MDA)含量的影响
为判断高 NaCl 浓度下小麦根系细胞质膜膜脂的
过氧化程度 ,测定了不同 NaCl 浓度下根系的 MDA 含
量。结果表明 ,小麦根系的 MDA 含量随 NaCl 浓度的
升高而有所上升 ,对照 (0) 、25 与 100mmolΠL NaCl 处理
173　3 期 用核素示踪研究小麦根系 Na + 外排速率的两种方法
之间的差异不显著 ,但 200mmolΠL 处理显著高于对照。
说明 NaCl 浓度为 100mmolΠL 以下的胁迫处理 ,小麦根
系质膜的透性没有显著变化 ,而 200mmolΠL NaCl 浓度
下根细胞膜脂过氧化程度显著 ( P < 0105)增大。
图 1 　不同 NaCl 浓度处理下小麦根系的 MDA 含量
Fig. 1 　MDA content of wheat root under
different NaCl concentrations
213 　外排速率
从图 2 可以看出 ,随着外界 Na + 浓度的上升 ,小麦
根系的 Na + 外排速率显著升高 ;对于外排液法 ,100 与
200mmolΠL NaCl 处理较 25mmolΠL NaCl 处理的外排速
率分别上升了 316 和 810 倍 ,对于植株法 ,相应值分别
上升了 413 和 916 倍。说明在盐胁迫环境下 ,小麦根
系具有明显的 Na + 外排能力 ,且随着胁迫程度的加剧
而增强。在 25、100、200mmolΠL NaCl 下 ,外排液法所得
的 Na + 外排速率均略高于植株法的值 ,但差异并不显
著 ;说明两种同位素示踪法测定得到的外排速率之间
具有可比性 ,在以后的试验中所得的结果相互之间可
以进行量化比较。
图 2 　两种示踪测定方法的小麦根系外排速率
Fig. 2 　Na + efflux rate of wheat root by two
different methods of nuclide tracer
3 　讨论
本试验采用外排时用 0～2min 的平均速率来表示
小麦根系外排速率 ,而未进行动力学特征曲线分析 ,原
因有如下两方面 :
第一 ,传统的外排速率测定虽然可以通过动力学
特征回归分析 (Q 3 = A1 3 exp - k1 + A2 3 exp - k2 ) [18 ] 来计
算瞬时速率。但其缺点是 :1)需要测定多个时间点 ,对
于半衰期短的同位素难以测量 ,如42 K;2) 难以做到精
确的平行试验 ;3)对于高等植物来说 ,组织细胞的异质
性增加了分析的难度 ;4) 对于液泡库大于或远大于细
胞质的植物来说 ,难以用数学方法进行分析 ,对于液泡
较小的植物来说 ,这种方法更为适用[19 ] 。本试验目的
是为了比较两种试验在测定上的差别 ,多点测定与单
点测定在意义上是一样的 ,且单点测定可以减少试验
误差增强可比性。
第二 ,Davenport 等[15 ] 在小麦上 ( Triticum aestivum)
的研究表明 ,细胞质膜的相对外排速率要远大于液泡
膜 ,而细胞质内与液泡内的 Na + 含量相差很小。可以
认为 ,在前 2min 内 ,细胞质内的 Na + 含量因液泡膜外
排和细胞质膜外排引起的变化可以忽略不计 ,外排以
线性方式进行 ,可以通过平均值的方式进行计算。本
试验植株法与外排液法所测得 25mmolΠL NaCl 下的小
麦根系 Na + 外排速率分别为 01262 和 01368μmolΠ(g·
rootFw·min) 。Davenport 等[15 ] 用动力学特征分析得到
25mmolΠL NaCl 下 的 小 麦 根 系 Na + 外 排 速 率 为
01335μmolΠgrfw·min。3 种方法得到的值非常接近。
因此 ,本试验采用外排前 2min 的平均速率来表示
细胞质膜的外排速率是合理的 ,且简便易行。两种示
踪测定方法得到的小麦根系 Na + 外排速率 ,虽然外排
液法测得值均略高于植株法 ,但差异不显著。外排液
法测定为了避免水样品的化学荧光影响样品计数 ,制
备的样品放置 12h 后才进行计数 ,但仍然避免不了测
定过程中出现少许化学发光作用 ,致使外排液法测得
的值比植株法略高。从测定程序和计算方法来看 ,外
排液法是通过测定同一批根系样品的外排量来计算外
排速率 ,而植株法是通过比较外排前的根系样品与外
排后的根系样品之间22Na + 计数差值来计算的。从系
统误差角度来看 ,外排液法有助于减小系统误差 ,操作
流程也比植株法简单 ,因此拟推荐采用外排液法来测
定植物根系的外排速率。
MDA 是膜脂过氧化的产物 ,MDA 的多少能反映细
胞质膜的完整性[17 ] 。从试验结果来看 ,小麦根系在
273 核　农　学　报 22 卷
25、100mmolΠL NaCl 处理下 ,根细胞质膜结构未受到明
显破坏 ,因而 25、100mmolΠL NaCl 处理下测得的 Na + 外
排速率能客观反映该根系的外排速率 ;而 200mmolΠL
NaCl 时细胞质膜已遭受损坏 ,所得速率偏大。因此 ,
推荐此类的离子过膜试验都应检测膜的完整性 ,以获
得正确的试验结果。
参考文献 :
[ 1 ] 　Tester M , Davenport R. Na + tolerance and Na + transport in higher
plants. Annals of Botany , 2003 , 91 : 1～25
[ 2 ] 　Wang S M , Zheng W J , Ren J Z , Zhang C L. Selectivity of various
types of salt2resistant plants for K+ over Na + . Arid Environ ,2002 , 52 :
457～472
[ 3 ] 　Munns R , Cramer G R , Ball M C. Interactions between rising CO2 , soil
salinity and plant growth. In : Luo Y, Mooney HA , eds. Carbon dioxide
and environment stress. London : Academic Press , 1999 : 139～167
[ 4 ] 　Horie T , Schroeder J I. Sodium transporters in plants. Diverse genes and
physiological functions. Plant Physiol , 2004 , 136 : 2457～2462
[ 5 ] 　Shi H , Ishitani M , Kim C , Zhu J K. The Arabidopsis thaliana salt
tolerance gene SOS1 encodes a putative Na + ΠH + antiporter. PNAS ,
2000 , 97 : 6896～6901
[ 6 ] 　Martinez2Atienza J , Jiang X , Garciablades B , Mendoza I , Zhu J K,
Pardo J M , Quintero F J . Conservation of the salt overly sensitive
pathway in rice. Plant Physiol , 2007 , 143 : 1001～1012
[ 7 ] 　张宏飞 ,王锁民. 高等植物 Na + 吸收、转运及细胞内 Na + 稳态平
衡研究进展. 植物学通报 ,2007 , 24 (5) : 561～571
[ 8 ] 　Matsushita N , Matoh T. Characterization of Na + exclusion mechanisms
of salt2tolerant reed plants in comparison with salt2sentitive rice plants.
Physiol Planta , 1991 , 83 : 170～176
[ 9 ] 　Kronzucker H J , Siddiqi M Y, Glass A D M. Analysis of 13NH4 + efflux
in spruce roots. Plant Physiol , 1995 , 109 : 481～490
[10 ] 　Britto D T , Kronzucker H J . Constancy of nitrogen turnover kinetics in
the plant cell : insights into the integration of subcelluar N fluxes.
Planta , 2001 , 213 : 175～181
[11 ] 　Kronzucker H J , Szczerba M W , Britto D T. Cytosolic potassium
homeostasis revisited : 42 K2tracer analysis in Hordeum vulgare L. reveals
set2point variations in [ K+ ] . Planta , 2003 , 217 : 540～546
[ 12 ] 　Touraine B , Glass A D M. NO3 - and ClO3 - fluxes in the chl125 mutant
of Arabidopsis thaliana , does the chl125 gene encode a low2affinity
NO3 - transporter ? Plant Physiol , 1997 , 114 : 137～144
[13 ] 　Shepherd U H , Bowling D J F. Sodium fluxes in roots of Eleocharis
uniglumis , a brackish water species. Plant , Cell Environ , 1979 , 2 :
123～130
[14 ] 　Jeschke W D , Jambor W. Determination of unidirectional sodium fluxes
in roots of intact sunflower seedlings. Experi Bot , 1986 , 32 (131) :
1257～1272
[15 ] 　Davenport R , James R A , Zakrisson2Plogander , Tester M , Munns R.
Control of Sodium Transport in Durum Wheat . Plant Physiol , 2005 ,
137 : 807～818
[16 ] 　Wang B , Davenport R J , Volkov V , Amtmann A. Low unidirectional
sodium influx into root cells restricts net sodium accumulation in
Thellungiella halophila , a salt2tolerant relative of Arabidopsis thaliana .
Experi Bot , 2006 , 57 (5) : 1161～1170
[17 ] 　赵世杰 ,许长成 ,邹　琦 ,孟庆伟. 植物组织中丙二醛测定方法的
改进. 植物生理学通讯 , 1994 ,30 (3) : 207～210
[18 ] 　Macrobbie E A C. Ion fluxes in‘isolated’guard cells of Commelina
communis L. Experi Bot , 1981 , 32 (128) : 545～562
[19 ] 　Essah P A , Davenport R , Tester M. Sodium influx and accumulation in
Arabidopsis . Plant Physiol , 2003 , 133 : 307～318
(上接第 318 页)
[ 4 ] 　Li Z Y, Kobayashi N , Hasatani M. Modeling of diffusion in ellipsoidal
solids : A comparative study. Drying Technology ,2004 ,22 :649～675
[ 5 ] 　Reddy B S ,Chakraverty A. Equilibrium moisture characteristics of raw
and parboiled paddy , brown rice , and bran. Drying Techanology ,2004 ,
22 :837～851
[ 6 ] 　Mohamed L A , Kouhila M , Lahsasni S , et al . Equilibrium moisture
content and heat of sorption of Gelidium sesquipedale. Journal of Stored
Products Research ,2005 ,41 :199～209
[ 7 ] 　于　勇 ,王　俊 ,王爱华 ,罗剑毅 ,傅俊杰. 60Coγ射线辐照处理对
晚粳稻低温干燥特性的影响. 核农学报 ,2005 ,19 (1) :41～45
[ 8 ] 　胡景川 ,沈锦林. 农产物料干燥技术. 杭州 :浙江大学出版社 ,
1990 ,99～109
[ 9 ] 　Brooker D B ,Bakker Arkema F W , Hall C W. Drying and Storage of
Grains and Oilseeds. New York , NY: Van Nostrand Reinhold Pub.
Inc. 1992
[10 ] 　Vandeputte G E ,Delcour J A. From sucrose to starch granule to starch
physical behavious : a focus on rice starch. Carbohydrate Polymers ,
2004 ,58 :245～266
373Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (3) :370～373