全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022274205
航天搭载的怀地黄种子无菌萌发及试管苗快繁
李明军1 ,2 　王凤娟1 　张晓丽1 ,2 　张　楠1 　李　翔1 　邓　丽1 　孙瑞斌3
(11 河南师范大学生命科学学院 ,河南 新乡　453007 ;21 河南省高校道地中药材保育及利用工程技术
研究中心 ,河南 新乡　453007 ;31 武陟县百疗怀药绿色保健品有限公司 ,河南 焦作　454900)
摘 　要 :为培育高产优质怀地黄新品种 ,本文对航天搭载的怀地黄种子的无菌萌发和试管苗的快繁技术
进行了研究。结果表明 : (1) 0105 % HgCl2 灭菌时间为 5s 时 ,种子的发芽率和发芽势最高 ,分别为
68133 % 和 53133 % ; (2) 种子萌发的最适培养基为 1Π4MS ,其发芽率和发芽势分别为 76167 % 和
65108 % ; (3) MS + 62BA 1mgΠL + NAA 01002mgΠL 为试管苗快繁的最适培养基 ,28d 时试管苗株高增加
7185cm ,繁殖系数达 6156。
关键词 :怀地黄 ;种子 ;无菌萌发 ;试管苗 ;繁殖系数
ASEPTIC GERMINATION AND RAPID PROPAGATION BY TISSUE CULTURE FROM
SPACE RETURNED SEEDS OF Rehmannia glutinosa f . hueichingensis ( Chan et Sehih) Hsiao
LI Ming2jun1 ,2 　WANG Feng2juan1 　ZHANG Xiao2li1 ,2 　ZHANG Nan1
LI Xiang1 　DENGLi1 　SUN Rui2bin3
(11 College of Life Sciences , Henan Normal University , Xinxiang , Henan 453007 ; 2 Engineering Technology Research Center
of Nursing and Utilization of Genuine Chinese Crude Drugs , University of Henan Province , Xinxiang , Henan 　453007 ;
31Limited Company of Wuzhi Bailiao Huaiyao Green Health Products , Jiaozuo , Henan 　454900)
Abstract :Aseptic germination of Rehmannia glutinosa f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao seeds space returned and
rapid propagation of plantlets were studied. The results were as follows : (1) When the sterilization time of 0105 %HgCl2 was
5 s , both the germination rate and the germination energy of the seeds reached the maximum , which were 68133 % and
53133 % respectively ; (2) The best aseptic germination medium of the seeds was 1Π4MS , the germination rate and the
germination energy of the seeds were 76167 % and 65108 % ; (3) The optimum rapid propagation medium of the plantlets was
MS + 62BA 1 mgΠL + NAA 01002 mgΠL , after grew in the medium for 28 d , height of the plantlets increased 7185 cm , the
propagation coefficient could achieve 61561
Key words : Rehmannia glutinosa f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao ; seed ; aseptic germination ; plantlets ; propagation
coefficient
收稿日期 :2008206230 　接受日期 :2008209223
基金项目 :河南省基础与前沿技术研究 (082300430180)和河南省重点科技攻关项目 (0623030700)
作者简介 :李明军 (19622) ,男 ,河南温县人 ,博士 ,教授 ,主要从事药用植物生物技术方面的研究。Tel :037323328189 ; E2mail :limingjun2002 @2631net
第一作者同时也为通讯作者。
　　怀地黄[ Rehmannia glutinosa f . hueichingensis (Chan
et Sehih) Hsiao ]为玄参科多年生药用草本植物 ,是我国
著名的“四大怀药”之一 ,主产于河南温县、武陟等地。
它含有梓醇、地黄素、多糖等多种有效成分 ,具有降血
糖、抗肿瘤、滋阴生津等功效[1 ] 。但由于长期无性繁
殖 ,导致品种退化、产量下降 ,且易受多种病害的侵
袭[2 ] ,因此 ,培育高产、优质、抗病的怀地黄新品种是生
产实践中亟待解决的一个重要问题。
航天诱变育种作为产生新基因源和创造新种质的
一种重要手段 ,能产生自然界稀有的或用一般常规方
472　 核 农 学 报　2009 ,23 (2) :274～278Journal of Nuclear Agricultural Sciences
法较难获得的新类型、新性状 ,为种质创新提供了一条
有效途径[3 ,4 ] ,目前在药用植物上的应用有桔梗和凤仙
花等[5 ,6 ] ,并选育出了产量高、质量优的新品种。为了
培育高产优质的怀地黄新品种 ,本试验对经航天搭载
的怀地黄种子在无菌条件下的萌发和试管苗的离体繁
殖进行了研究 ,以期获得航天搭载后的种子苗 ,并使选
育出的优良品种迅速扩大繁殖和推广应用。
1 　材料与方法
111 　材料
试验材料为 2006 年 9 月 9 - 24 日“实践八号”育
种卫星搭载后的怀地黄种子。
112 　种子无菌萌发
11211 　最佳消毒时间的筛选 　在超净工作台上用
0105 % HgCl2 对种子进行灭菌 ,时间分别设置为 3、5、
30、60 和 300s ,用无菌水冲洗 5 次后 ,接种在 MS 培养
基上 ,每处理设 3 个重复 ,每重复 50 粒种子 ,干培养室
培养。培养室温度为 25 ℃±2 ℃,光强为 2000lx ,光照
时间为 14hΠd。每日记录发芽数 ,统计发芽率和发芽
势。发芽率 ( %) = (15d 时种子发芽数Π供试种子数) ×
100 % ;发芽势 ( %) = (7d 时种子发芽数Π供试种子数)
×100 %。
11212 　最佳培养基的筛选 　用筛选出的最佳消毒时
间在 0105 % HgCl2 中对种子进行消毒并用无菌水冲洗
5 次后 ,分别接种在 MS、1Π2MS、1Π4MS、1Π8MS、MS +
NAA 0102mgΠL、MS + NAA 0102mgΠL + 62BA 0102mgΠL、
MS + NAA 0102mgΠL + 62BA 012mgΠL 和 MS + NAA
0102mgΠL + 62BA 2mgΠL 8 种培养基上 ,试验重复及观
察记录同上。
113 　试管苗快繁培养基的筛选
待种子萌发成苗并生长至株高为 8cm 时 ,将其切
成 2～215cm 的带芽茎段 ,接种在以 MS 为基本培养基
的快繁培养基中 ,设计 62BA 和 NAA 两因素五水平随
机区组试验 ,共 25 种培养基 (表 1) ,每种 4 瓶 ,每瓶 4
株 ,重复 3 次 ,置于培养室培养 ,培养条件同 11211。每
7d 观察统计株高、叶片数、根长和生长情况等 ,28d 时
计算株高增加值和叶片增加数 ,株高增加值 (cm) = 28d
时株高 - 接种时的株高 ;叶片增加数 (个) = 28d 时的
叶片数 - 接种时的叶片数。
所有培养基的蔗糖浓度均为 3 % ,冷凝脂浓度为
6 ‰,pH 值为 518～612 ,并在 121 ℃、111kgΠcm2 的压力
下灭菌 20min。
114 　统计分析方法
试验数据应用 SPSS 软件进行方差分析 ,平均数据
以“平均数 ±标准误 ( S. E. )”表示 ,多重比较采用
Duncan 法进行检验。
表 1 　快繁培养基中 62BA 和 NAA 的浓度
Table 1 　Concentration of 62BA and NAA in the rapid
propagation medium
培养基编号
No. of
medium
植物生长调节剂
plant growth
regulator (mgΠL)
62BA NAA 培养基编号No. ofmedium 植物生长调节剂plant growthregulator (mgΠL)62BA NAA
1 0 0 14 012 012
2 0 01002 15 012 110
3 0 0102 16 110 0
4 0 012 17 110 01002
5 0 110 18 110 0102
6 011 0 19 110 012
7 011 01002 20 110
8 011 0102 21 210 0
9 011 012 22 210 01002
10 011 110 23 210 0102
11 012 0 24 210 012
12 012 01002 25 210 110
13 012 0102
2 　结果与分析
211 　灭菌时间对怀地黄种子无菌萌发的影响
观察发现 ,灭菌时间对种子萌发有一定影响 ,时间
过短 (3s) ,灭菌不彻底 ,污染率达 70 %以上 ,不利于种
子的无菌萌发 ;灭菌时间 ≥5s 时 ,无污染发生 ;但时间
过长 ( ≥30s) ,种子易受伤害 ,萌发率较低。
由表 2 可以看出 ,灭菌时间对发芽率和发芽势有
极显著影响 ,灭菌时间为 5s 时 ,发芽率和发芽势最高 ,
分别为 68133 %和 53133 % ;随着灭菌时间的增加 ,发
芽率和发芽势呈极显著下降趋势。
212 　培养基对怀地黄种子无菌萌发的影响
种子在无植物生长调节剂的培养基上 3d 即可出
现萌动现象 ,而在添加植物生长调节剂的培养基上 5d
后才出现萌动现象。不同培养基对种子无菌萌发的影
响见表 3。
由表 3 可知 ,培养基为 1Π4MS 时 ,发芽率最高 ;
1Π2MS次之 ,二者无显著性差异 ;无植物生长调节剂和
添加植物生长调节剂的培养基之间呈现显著性差异 ,
以无植物生长调节剂的发芽率为佳。从发芽势来看 ,
也以 1Π4MS 为最高 ,且与其他处理均达到极显著性差
异。可见 ,怀地黄种子无菌萌发的最适培养基为 1Π
4MS。
572　2 期 航天搭载的怀地黄种子无菌萌发及试管苗快繁
表 2 　灭菌时间对怀地黄种子无菌萌发的影响
Table 2 　Effect of sterilization time on the aseptic germination
of Rehmannia glutinosa f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao seeds
灭菌时间
sterilization time (s) 5 30 60 300
发芽率 germination percentage ( %) 68133 ±1111 Aa 27178 ±1123 Bb 18189 ±1108 Cc 8106 ±0192 Dd
发芽势 germination energy( %) 53133 ±1136 Aa 20100 ±1103 Bb 14154 ±1114 Cc 6148 ±1107 Dd
注 :表中数据后带有相同小写Π大写字母表示在 0105Π0101 水平不显著。其他表同。
Note : The data followed by common small and capital letters indicated no significant at 0105 and 0101 levels , respectively. The same as other tables.
表 3 　培养基对怀地黄种子无菌萌发的影响
Table 3 　Effect of cultuced medium on the aseptic germination of Rehmanni
a glutinosa f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao seeds
培养基
medium
发芽率
germination percentage ( %)
发芽势
germination energy( %)
MS 68133 ±1111 Bc 53133 ±1136 Cc
1Π2MS 75100 ±1123 Aab 58133 ±1108 Bb
1Π4MS 76167 ±2104 Aa 65108 ±2100 Aa
1Π8MS 73133 ±2103 Ab 50114 ±2114 Cd
MS + NAA 0102mgΠL 65102 ±1125 BCd 40101 ±1108 De
MS + NAA 0102mgΠL + 62BA 0102mgΠL 63133 ±1143 Cd 41167 ±1115 De
MS + NAA 0102mgΠL + 62BA 012mgΠL 52178 ±1107 De 27178 ±1124 Ef
MS + NAA 0102mgΠL + 62BA 2mgΠL 38189 ±1134 Ef 19144 ±1132 Fg
213 　植物生长调节剂对怀地黄试管苗快繁的影响
将带芽茎段在不同 62BA 和 NAA 含量的培养基上
培养 28d 时 ,统计试管苗的株高、根长、叶片数和繁殖
系数 ,并进行方差分析 ,结果见表 4。
表 4 　62BA、NAA 对怀地黄试管苗各指标影响的
方差分析( F值) (培养 28d)
Table 4 　Variance analysis (F value) of 62BA and
NAA on Rehmannia glutinosa f . hueichingensis
(Chan et Sehih) Hsiao plantlets (cultured 28d)
因素
factor
株高增加值
plant height
increased(cm)
叶片增加数
(个)
leave No.
increased
根长
root length
(cm)
繁殖系数
propagation
coefficient
62BA 49137033 24145033 21106 6117273
NAA 216147733 58175933 10101133 120111633
62BA·NAA 36140833 20148433 3141833 69157633
注 :33表示在 0101 水平上差异显著。
Note : 33 means significant difference at 0101 level .
21311 　62BA 对怀地黄试管苗快繁的影响　由表 4 可
以看出 ,62BA 对怀地黄试管苗株高增加值、叶片增加
数和繁殖系数均有极显著性影响。运用 Duncan 法对
62BA 的不同浓度进行多重比较 ,结果如表 5。
表 5 显示 ,培养基中加入浓度为 011mgΠL 62BA 时 ,
试管苗的株高增加值最大 ,1mgΠL 次之 ,两者之间无显 著差异 ,但与其他处理均达到显著差异 ;62BA 为 1mgΠL时 ,叶片增加数最大 ,2mgΠL 次之 ,两者之间有显著差异 ,但未达到极显著 ;62BA 为 1mgΠL 时的繁殖系数也最高 ,011mgΠL 次之 ,两者之间差异显著 ,且与其他处理的差异均达到极显著水平 ;62BA 对根长无极显著影响。综合比较 ,62BA 为 1mgΠL 时 ,试管苗的繁殖系数最高 ,最有利于怀地黄试管苗的快速繁殖。21312 　NAA 对怀地黄试管苗快繁的影响 　由表 4 可以看出 ,NAA 对怀地黄试管苗的株高增加值、叶片增加数、根长和繁殖系数都有极显著性影响 , 运用Duncan 法对 NAA 的不同浓度进行多重比较 ,结果见表6。 由表 6 可知 ,培养基中加入浓度为 01002mgΠLNAA 时 ,株高的增加值达到最大 ,0102mgΠL 次之 ,两者之间无显著性差异 ,但与其他处理均达到极显著差异 ;NAA 012mgΠL 时 ,叶片增加值最大 ,与 NAA 0mgΠL 无显著差异 ,但两者与 NAA 01002mgΠL 差异显著 ,这三者与其他处理均达到极显著差异 ;NAA 01002mgΠL 时根最长 ,0 和 0102mgΠL 其次 ,三者之间无显著性差异 ,但与其他处理均达到极显著差异 ;NAA 为 01002mgΠL 时 ,试管苗的繁殖系数最高 ,012mgΠL 次之 ,两者间无显著差异 ,但与其他处理的差异均达到显著水平。试验中发现 ,试管苗在含有较高浓度 ( ≥012mgΠL) NAA 的培养基
672 核　农　学　报 23 卷
中培养时 ,切口处形成大量的愈伤组织 ,不利于快速繁
殖。综合比较 ,NAA 浓度为 01002mgΠL 时 ,有利于怀地 黄试管苗的快速繁殖。
表 5 　62BA 对怀地黄试管苗快繁的影响(培养 28d)
Table 5 　Effect of 62BA on the rapid propagation of Rehmannia glutinosa
f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao plantlets (cultured 28d)
62BA 浓度
concentration of 62BA
(mgΠL) 株高增加值plant heightincreased(cm) 叶片增加数 (个)leave No.increased 根长root length (cm) 繁殖系数propagation coefficient
0 7199 ±1154 Bb 5197 ±0113 Dc 4120 ±0123 Aa 3199 ±0156 De
011 8164 ±1102 Aa 7102 ±0154 BCb 3173 ±0124 Aab 4191 ±0172 Ab
012 7196 ±0195Bb 6192 ±0195 Cb 3192 ±0125 Aab 4165 ±0149 Bc
1 8145 ±1152 ABa 7169 ±1125 Aa 3174 ±0120 Aab 5111 ±0195 Aa
2 6107 ±0183 Cc 7150 ±1154 ABb 3127 ±0128 Ab 4142 ±0181 Cd
表 6 　NAA 对怀地黄试管苗快繁的影响(培养 28d)
Table 6 　Effect of NAA on the rapid propagation of Rehmannia glutinosa
f . hueichingensis (Chan et Sehih) Hsiao plantlets (cultured 28d)
NAA 浓度
concentration
of NAA(mgΠL) 株高增加值plant height increased(cm) 叶片增加数 (个)leave No. increased 根长root length (cm) 繁殖系数propagation coefficient
0 8167 ±0114 Bb 7175 ±0184 Aa 4118 ±1125 Aa 4183 ±0125 Bb
01002 9152 ±1123 Aa 7134 ±0196 ABbc 4160 ±1154 Aa 5110 ±0172 Aa
0102 9116 ±0175 ABa 7106 ±1125 Bc 4109 ±1123 Aa 4156 ±0123 Cc
012 7157 ±0164 Cc 7171 ±1165 Aab 2196 ±0164 Bb 5100 ±0194 ABa
1 4123 ±0152 Dd 5123 ±0197 Cd 3102 ±0123 Bb 3158 ±0136 Dd
图 1 　不同培养基上怀地黄试管苗的繁殖系数 (培养 28d)
Fig. 1 　The propagation coefficient of Rehmannia glutinosa f . hueichingensis
(Chan et Sehih) Hsiao plantlets on different medium(cultured 28d)
1～25 培养基成分同表 1
The content of medium are as same as in table 1
21313 　62BA、NAA 组合对怀地黄试管苗快繁的影响　
由图 1 可以看出 ,第 17 组 (MS + 62BA 1mgΠL + NAA
01002mgΠL) 的繁殖系数达到了最高值 ,为 6156 ,第 19
组 (MS + 62BA 1mgΠL + NAA 012mgΠL) 次之 ,为 6137 ,第 25 组 (MS + 62BA 2mgΠL + NAA 1mgΠL)最差 ,仅为 2118。综合以上结果 ,MS + 62BA 1mgΠL + NAA 01002mgΠL为怀地黄试管苗快速繁殖的最佳培养基 ,在此培养基上培养 28d 时 ,试管苗的株高增加值达 7185cm ,叶片数
772　2 期 航天搭载的怀地黄种子无菌萌发及试管苗快繁
增加值为 10119 个 ,根长为 3161cm ,繁殖系数达 6156。
3 　讨论
不同的作物种子在进行无菌萌发时所需的灭菌条
件不同。春兰[7 ] 和红掌[8 ] 种子在进行无菌萌发时 ,先
用 70 %酒精进行表面消毒 ,再用 011 % HgCl2 灭菌 10
- 15min 效果最好。我们在前期的试验中发现 ,先用
70 %酒精进行表面消毒再用 011 % HgCl2 进行灭菌 ,虽
然除菌效果明显 ,但不利于怀地黄种子的萌发 ,故采用
0105 % HgCl2 进行灭菌 ,发现灭菌 5s 时效果最佳。
无机盐的含量对种子的无菌萌发具有重要的影
响。陈之林等[9 ] 、曾宋君等[10 ] 对不同品种的兜兰进行
研究时发现 ,1Π4MS 培养基比 MS 培养基更有利于硬叶
兜兰和杏黄兜兰种子的萌发 ,这与本研究结果相似 ,可
能是由于较高浓度的无机盐对种子的萌发有抑制作
用 ,而较低浓度的无机盐有利于种子的萌发。此外 ,本
研究还发现 ,62BA 和 NAA 可显著抑制怀地黄种子的
萌发 ,这可能与怀地黄种子在萌发过程中含有足够的
促进其萌发所需要的内源激素有关。
培养基中植物生长调节剂的种类和浓度配比是试
管苗快速繁殖的关键。本试验中 ,MS + 62BA 1mgΠL +
NAA 01002mgΠL 为太空怀地黄试管苗快速繁殖的最适
培养基。而温学森等[11 ] 研究认为怀地黄脱毒苗适宜
的快繁培养基为 MS + 62BA 015mgΠL + NAA 0102mgΠL ,
这与本研究结果不同 ,可能是由于怀地黄种子经航天
搭载后生理特性发生了变化 ,从而使其试管苗在生长
过程中内源激素的合成发生了改变 ,对外源植物生长
调节剂的需求发生了变化的缘故。
4 　结论
本试验筛选出了航天搭载后怀地黄种子无菌萌发
的最适条件和试管苗快繁的最佳培养基 ,为进一步选
育出的优良品种的快速繁殖及迅速推广应用提供了一
条有效途径。
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更　　正
2009 ,23 , (1) : 145～149 ,由朱其松、黄建中等人撰写的论文《除草剂对不同耐寒性水稻幼苗的氧化胁迫效应》
第 146 页“112 　水稻幼苗的培养与处理”中 ,“光照期间的光通量为 160 º molΠm2 ·s”应为“光照期间的光通量为
160μmolΠm2·s”;第 147 页的图 3 纵坐标 ,H2O2 、GSH和 AsA 的含量单位“nmolΠg·FW”应为“μmolΠg·FW”。特此更正。
872 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (2) :274～278