全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062776205
辐照花粉辅助授粉克服百合受精前障碍的研究
林　俊1 　张克中1 　贾月慧1 　张启翔2 　马　莉2
(11 北京农学院园林系 ,北京　102206 ;21 北京林业大学园林学院 ,北京　100083)
摘 　要 :采用60 Co 辐照LA 杂种系百合‘耀眼’(‘Dazzle’)花粉 ,通过辅助授粉克服百合‘Dazzle’( ♀) ×川百
合 ( Lilium davidii)的远缘杂交障碍 ,采用荧光显微技术观察授粉后 3～7d 父本花粉及花粉管在母本雌蕊
中的行为。研究结果表明 :采用未处理花粉直接授粉 ,花粉管在花柱中伸长到一定长度后形成胼胝质 ,
停留在花柱中不能进入子房 ;采用蒙导花粉及先锋花粉授粉法能促进花粉管从花柱进入子房 ,并接近或
可能进入胚珠 ,表明辐照花粉辅助授粉能部分地克服百合‘Dazzle’( ♀) ×川百合 (Lilium davidii) 远缘杂
交的受精前障碍。
关键词 :百合 ;辐射花粉 ;辅助授粉 ;远缘杂交
THE OVERCOMING PRE2FERTILIZATION BARRIERS OF LILY
VIA ASSISTING POLLINATION OF IRRADIATED POLLEN
LIO Jun1 　ZhANG Ke2zhong1 　J IA Yue2hui1 　ZHANG Qi2xiang2 　MA Li2
(11 Gardening Department , Beijing University of Agricultural , Beijing 　102206 ;
21 Gardening Department , Beijing Forest University , Beijing 　100083)
Abstract :The effect of irradiated pollen was studied on overcoming incompatibility and incongruity in LA lily cultivar‘Dazzle’
( ♀) ×Lilium davidii . After 3～7 days of pollination , the pollen2tube growth in pistils was observed with fluorescence
microscope. The results showed as follows : for normal pollination , pollen tubes stopped growthing in the styles when they
strengthened to some length , forming callose at the top of them. For the pollination of mentor pollen and pioneer pollen , pollen
tubes entered the ovary , and approached or might penetrated into the ovules. This indicated that the assisting pollination
methods with irradiated pollen were able to overcome the pre2fertilization barriers of‘Dazzle’( ♀) ×Lilium davidii partly.
Key words :lily ; irradiation pollen ;assisting pollination ; distant hybridization
收稿日期 :200827215 　接受日期 :2008208228
基金项目 :北京市科技新星项目 (2003B013) ,国家‘十五’科技攻关项目 (2004BA525B11) , 北京市属市管高校人才强教计划资助项目
作者简介 :林　俊 (19842) ,山西运城人 ,硕士生 ,主要从事园林植物资源与育种研究。E2mail :linjun226 @sohu. com
通讯作者 :张克中 (19682) ,湖北应城人 ,副教授 ,主要从事花卉遗传育种工作。E2mail :zkzzxd @vip . sina. com　　百合LA 杂种系栽培品种‘Dazzle’,花色鲜黄 ,生态适应性强 ,适合用作切花及庭院栽培 ,但花瓣斑点少 ;川百合 ( Lilium davidii)为原产我国西南地区的一种野生百合 ,花色桔红 ,花瓣上有较多斑点。‘Dazzle’( ♀) ×川百合组合为栽培品种与野生百合种之间的杂交 ,属远缘杂交 ,有望培育出花瓣斑点增多、花色新颖 ,且适应性强的百合新品种。百合远缘杂交存在受精前障碍和受精后障碍 ,突破受精前障碍是杂交获得成功 的第一步。花粉温度处理[1 ] 、辐射花粉辅助授粉[2 ] 、激素处理[3 ] 、花柱处理[4 ] 、切割花柱授粉[5 ] 、花柱嫁接[6 ]等措施常用于克服百合受精前障碍。荧光显微镜技术是观察百合花粉在柱头萌发以及花粉管在花柱内生长状况的一种良好方法[7～9 ] 。国内外未见百合‘Dazzle’( ♀) ×川百合杂交育种的报道。本试验拟采用不同剂量60 Co 辐照的百合‘Dazzle’花粉 ,以“先锋花粉”及“蒙导花粉”的形式辅助授粉 ,用于克服该组合的杂交障
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碍 ;并采用荧光显微技术观察不同授粉条件下花粉管
的行为 ,以了解该组合杂交障碍产生的原因 ,找到克服
其受精前障碍的适宜方法。
1 　材料及方法
111 　试验材料
以百合LA 杂种系栽培品种‘Dazzle’为母本 ,川百
合 ( Lilium davidii)为父本 ,种植在北京农学院园林系实
验基地温室内 ,于 2007 年 6 月开花期间进行花粉辐照
处理及杂交工作。
112 　辐照花粉辅助授粉
11211 　花粉辐照处理　当母本‘Dazzle’花蕾完全显色
但花苞未打开时 (约开花前 1 - 2d) ,剥开花蕾 ,取出花
药 ,于室内阴凉干燥处使花药自然开裂。收集花粉 ,混
匀 ,用硫酸纸包好。当天送至北京辐照中心钴源室进
行辐照 ,剂量分别为 500、1000 和 2000Gy ,剂量率为
100GyΠmin。辐照完成后 ,装入加有无水氯化钙的干燥
瓶中 ,储藏于 4 ℃冰箱备用。
11212 　去雄　当母本‘Dazzle’花蕾完全显色但花苞未
打开时 ,剥开花蕾去雄。去雄后套袋 ,挂吊签。
11213 　蒙导花粉辅助授粉　当母本‘Dazzle’柱头上出
现分泌物时 ,将经辐照处理的母本‘Dazzle’花粉与未辐
照的父本 (川百合) 花粉等量混合均匀 ,然后授于母本
柱头上。
11214 　先锋花粉辅助授粉　当母本‘Dazzle’柱头上出
现分泌物时 ,先用辐照过的母本花粉进行自花授粉。
24h 后 ,再授以父本 (川百合)花粉。
11215 　11 种授粉方法及取材　本试验设置了 11 种授
粉方法 (见表 1) ,其中以柱头直接授粉作为对照。每
种授粉方式授粉 30～40 朵 ,其中 15 朵结实 ,剩余的 15
～25 朵用于分授粉后 3、5、7d 三个时段的母本材料进
行显微观察前的固定 ,每天早晨取材。
表 1 　11 种不同的授粉方法
Table 1 　11 different pollination methods
授粉方法
pollination method
方法描述
description of different pollination methods
S(F) 用未经辐照处理的母本花粉进行自花授粉
self2pollination with the untreated female pollen
S(500Gy) 用经 500Gy 辐照的母本花粉进行自花授粉
self2pollination with irradiated female pollen at 500Gy
S(1000Gy) 用经 1000Gy 辐照的母本花粉进行自花授粉
self2pollination with irradiated female pollen at 1000Gy
S(2000Gy) 用经 2000Gy 辐照的母本花粉进行自花授粉
self2pollination with irradiated female pollen at 2000Gy
C(500Gy + M) 经 500Gy 辐照的母本花粉与未辐照的父本花粉等量混合均匀后授粉
pollination with the mixed pollen of half irradiated female pollen at 500Gy and half male pollen
C(1000Gy + M) 经 1000Gy 辐照的母本花粉与未辐照的父本花粉等量混合均匀后授粉
pollination with the mixed pollen of half irradiated female pollen at 1000Gy and half male pollen
C(2000Gy + M) 经 2000Gy 辐照的母本花粉与未辐照的父本花粉等量混合均匀后授粉
pollination with the mixed pollen of half irradiated female pollen at 2000Gy and half male pollen
C(500GyΠMΠ24h) 先用 500Gy 辐照母本花粉授粉 ,过 24h 后再用未辐照的父本花粉授粉
pollination with irradiated female pollen at 500Gy first ,and with male pollen 24h later
C(1000GyΠMΠ24h) 先用 1000Gy 辐照母本花粉授粉 ,过 24h 后再用未辐照的父本花粉授粉
pollination with irradiated female pollen at 1000Gy first ,and with male pollen 24h later
C(2000GyΠMΠ24h) 先用 2000Gy 辐照母本花粉授粉 ,过 24h 后再用未辐照的父本花粉授粉
pollination with irradiated female pollen at 2000Gy first ,and with male pollen 24h later
C(CK) 用未辐照父本花粉直接授粉于母本柱头上
male pollen was directly applied onto the female stigma
注 :S代表自交 ;C代表杂交 ;F 代表母本 ;M代表父本。下表均同。
Note :S : selfing ; C : cross ; F : female parent ; M: male parent . The same as following tables。
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113 　材料的处理及观察
授粉后 3、5 和 7d ,以不同授粉方式授粉的雌蕊为
材料 ,每次每个处理固定 5～8 个材料。材料放入长试
管 ,加入 FAA 固定液后 ,用真空泵抽气直至材料不再
冒出气泡 ,然后放入 4 ℃冰箱保存备用。
把固定好的已授粉花柱依次放入 30 %、50 %浓度
酒精进行梯度脱水 ,每个浓度脱水 10min。然后用清
水冲洗干净。百合花柱较长 ,不易软化均匀。故将每
根花柱切成不等的三段 ,标注上下次序 ,装进试管 ,然
后往试管中注入 8mmolΠL NaOH软化液 ,放入 60 ℃水浴
锅中保温 1h 进行软化。
材料软化完成后 ,用大量清水冲洗 ,直至变为透
明。将试管中的水吸净 ,滴入 011 %的苯胺兰溶液进 行染色 ,过夜。将染好色的材料取出 ,做成临时切片 ,放在 200 ×及 400 ×荧光显微镜下进行观察 ,并拍照。2 　结果与分析211 　辐照对母本花粉柱头萌发的影响未辐照的母本花粉 ,自花授粉后 ,花粉可以在柱头及花柱中正常萌发伸长 (见图 1 - a ,表 2) 。经 500、1000 和 2000Gy 辐照后的母本花粉 ,自花授粉后 ,在柱头上未能萌发 (见图 1 - b ,c ,d) 。说明所用剂量的辐照破坏了母本花粉的萌发能力 ;辐照花粉辅助父本花粉授粉 ,不会产生母本自花授粉结实的情况。
图 1 　辐照处理与未辐照的母本花粉柱头萌发的情况
Fig. 1 　The germinating condition of irradiation female pollen and unirradiated female pollen
a 未辐照 ;b ,c ,d 经不同剂量60Co”辐射后
a :the unirradiaed female pollen ; b ,c ,d :the irradiated female pollen at 500 ,1000 and 2000Gy
表 2 　不同剂量60 Co 辐射‘Dazzla’
花粉后的萌发率(授粉后第 3 天)
Table 2 　The germination rate of different doses of 60 Co
irradiated female pollen (3 days after pollination)
授粉方法
pollination method S
(F) S(500Gy) S(1000Gy) S(2000Gy)
萌发率
germination rate
8218 % 0 0 0
212 　500 Gy 辐照母本花粉辅助授粉对父本花粉管行
为的影响
以 500Gy 辐照处理的母本蒙导花粉和先锋花粉辅
助父本花粉进行授粉 ,授粉后第 3 天 ,父本花粉管在花
柱中的伸长长度分别为 418cm 和 910cm (图 2 - b、表
3) , 明显长于仅授以父本花粉时的伸长长度 (约
317cm) (图 2 - a、表 3) 。 仅授以父本花粉时 ,授粉后第 5 天 ,父本花粉管在花柱中伸长到一定程度 (约 1015cm) 后停止了伸长 ,顶端出现了胼胝质现象 (见图 2 - c) 。以经 500Gy 辐照处理后的母本花粉辅助父本花粉进行授粉时 ,父本花粉管在花柱中的伸长并未受到抑制 ,部分花粉管已进入子房到达珠孔端 (图 2 - d ,表 3) 。采用蒙导花粉以及先锋花粉辅助父本花粉进行授粉时 ,授粉后第 7d ,子房中几乎每个胚珠的珠孔端都可观察到一条花粉管 ,表明父本花粉管可能已经接近胚珠或已进入胚珠 (图 2 - e) 。仅授以父本花粉时 [ C(CK) ] ,花粉管保留着第 5d 花粉管顶端出现胼胝质情景 ,花粉管停留在花柱中 (长度约 1110cm) (表 3) 。213 　1000 和 2000 Gy 辐照母本花粉辅助授粉对父本花粉管行为的影响同为授粉后第3 、5 、7d ,1000和2000 Gy两种处理
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图 2 　授粉后第 3、5、7 天 ,辐照母本花粉辅助授粉与直接授粉花粉管生长情况对比图
Fig. 2 　3 ,5 ,7 days after pollination , the contraction between the growth of assisting
pollination of irradiated pollen and normal pollination.
a :川百合花粉直接授粉后 3d ;b :500Gy 辐照花粉辅助川百合花粉授粉后 3d ;c :川百合花粉直接授粉后 5d ;d :500Gy 辐照花粉辅助川百合花粉授粉后
5d ;e :500Gy 辐照花粉辅助川百合花粉授粉后 7d ;f :1000Gy 辐照花粉辅助授粉后 7d ;g :2000Gy 辐照花粉辅助授粉后 7d.
a :‘Dazzle’( ♀) ×Lilium davidii , 3 days after normal pollination ; . b :‘Dazzle’( ♀) ×Lilium davidii , 3 days after assisting pollination of pollen irradiated by
500Gy ; c :‘Dazzle’( ♀) ×Lilium davidii , 5 days after normal pollination ; d :‘Dazzle’( ♀) ×Lilium davidii , 5 days after assisting pollination of pollen irradiated
by 500Gy ; e :C(500Gy + M) ,7 days after pollination ; f :C(1000Gy + M) ,7 days after pollination ; g :C(2000Gy + M) ,7 days after pollination.
的蒙导花粉和先锋花粉辅助授粉与 500Gy 处理获得类
似的效果 ,均很好地克服了父本花粉管在柱头及花柱
中萌发伸长所遇到的障碍 (表 3) 。
其不同之处在于 ,1000 和 2000Gy 两种剂量下的蒙
导花粉和先锋花粉辅助授粉后第 7d ,可以观察到胚珠
形态结构发生变化 :胚珠外壁出现网纹 ,胚珠上出现类
似于珠孔塞的结构 (图 2 - f ,g) ,而珠孔塞具有帮助花
粉管进入胚珠的机械、营养或向化性功能[10 ] 。
3 　结论与讨论
在LA 百合杂种系栽培品种‘Dazzle’( ♀) ×川百
合 ( Lilium davidii)杂交试验中 ,采用父本花粉直接授于
母本柱头 ,花粉管在花柱中伸长到一定长度后形成胼
胝质 ,花粉管停留在花柱中下部 ,进入不了子房 ;采用
蒙导花粉及先锋花粉授粉法能促进花粉管从花柱进入
子房 ,接近或可能进入胚珠 ,表明辐照花粉辅助授粉能
部分地克服百合‘Dazzle’( ♀) ×川百合 ( Lilium davidii)
远缘杂交受精前障碍。
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表 3 　不同授粉方法对父本花粉管伸长的影响
Table 3 　The effect of different pollination
methods on male pollen‘s elongation
授粉方法
pollination methods
父本花粉管伸长状况
the male pollen‘s elongation length (cm)
授粉后 3 天
3 day after
pollination
授粉后 5 天
5 day after
pollination
授粉后 7 天
7 day after
pollination
C(CK) 317cm 1015cm 1110cm
C(500Gy + M) 418cm > 1215cma > 1218cma
C(500GyΠMΠ24h) 910cm > 1310cma > 1310cma
C(1000Gy + M) 415cm > 1217cma > 1215cmb
C(1000GyΠMΠ24h) 912cm > 1310cma > 1312cmb
C(2000Gy + M) 916cm > 1218cma > 1310 cmb
C(2000GyΠMΠ24h) 11cm > 1310cma > 1217cmb
注 a : 花粉管到达珠孔端 ;b :胚珠外壁出现网纹。授粉方法见表 1。
Note a :pollen tubes approached the position of micropyle ; b : the emergence of
reticulation in the outer wall of ovules. Pollination methods see Table 1.
花粉辐照是较为有效的使亲和花粉不具有供精能
力的方法 ,其中首要考虑的问题是选择一个合适的剂
量 ,过高的剂量可能会导致蛋白质等亲和性识别物质
被破坏。在 Van Tuyl (1982) 的试验中 ,认为 1000 和
2500Gy 是麝香百合适宜的辐照剂量[11 ] 。从本试验结
果来看 ,对于百合‘Dazzle’,500、1000 和 2000Gy 三种辐
射剂量均是适宜的。
‘Dazzle’( ♀) ×川百合 ( Lilium davidii) 为远缘杂
交 ,‘Dazzle’柱头和花柱上的蛋白会对异种材料川百合
的花粉萌发和伸长产生一定的拒绝反应 ,所以直接授
粉后 ,花粉管伸入到花柱中下部时产生了胼胝质 ,不再
继续伸长。但是‘Dazzle’辐照花粉的“蒙导”和“先锋”
作用 ,会消耗掉一定量的拒绝蛋白[12 ] ,从而促进了川
百合花粉在异种柱头和花柱中的萌发伸长 ,促使花粉
管伸入子房 ,接近或进入胚珠 ,部分地克服了受精前障
碍。
由于没有观察到双受精行为 ,因此无法断定该技
术是否已将受精前障碍完全克服 ,只能得出辐照花粉
辅助授粉能部分地克服该组合受精前障碍的结论。
在田间试验中 ,我们未能获得有种子的杂种果实 ,
表明受精后障碍并未得到完全克服。百合杂交障碍较
为复杂 ,它分为受精前障碍和受精后障碍。受精前障
碍是指异种花粉在母本柱头和花柱中不能萌发伸长 ,
或者萌发伸长能力较弱、花粉管进入不了子房或胚珠、
不能发生双受精。受精后障碍是指发生双受精后 ,杂
种胚不发育或者发育较为困难 ,或者由于杂种胚和胚
乳代谢上的不协调、胚乳的早期败育 ,致使杂种胚败
育。由我们的试验结果来看 ,辐照花粉辅助授粉能促
使花粉进入子房 ,接近或进入胚珠 ,能部分地克服受精
前障碍。如果将辐照花粉辅助授粉措施与克服受精后
障碍措施 ,例如 :离体子房培养、离体子房切片培养、离
体胚珠培养、离体胚拯救等结合起来 ,是有可能克服该
组合杂交障碍 ,获得杂种苗的。
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