全 文 ：收稿日期 :1998207227
基金项目 :浙江省院士基金及浙江大学农业部核农学重点开放实验室基金
作者简介 :杨培新(1966 - ) ,浙江湖州人 ,浙江大学理学博士 ,浙江大学动物科学学院讲师。1997 年 7 月～1998 年 6 月在
日本东京农业大学修博士课程。现在美国内布拉斯加州医学中心做内分泌博士后。研究方向为生殖内分泌
学。
文章编号 :100028551 (2000) 0120029207
绍鸭垂体 L HRH 放射受体结合法
及其结合特性
杨培新1 　吴美文2 　陈子元2
(1. 浙江农业大学动物科学学院 ;2. 核农学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘要 :以促性腺激素释放激素 (L HRH)的高效类似物 (D2Lys6) L HRH 作为示踪物。在
垂体膜制剂和胶原酶及胰酶分散的体外培养的垂体细胞水平上 ,研究了绍鸭垂体
L HRH 受体的结合特性。106 个垂体细胞与125 I2(D2Lys6) L HRH 在 4 ℃孵育 90min
能获得较高的结合率 ,经 24h 孵育后结合率显著下降。125 I2(D2Lys6) L HRH 与垂体
膜制剂的结合率随膜制剂的浓度增加而增加 ,在每管相当于 1～2 个垂体浓度范围内
呈正相关。特异性结合随 125 I2( D2Lys6 ) L HRH 量的增加而增加 , 实验结果经
Scatchard 分析揭示出特异性结合与结合和游离125 I2(D2Lys6) L HRH 之比呈线性关
系 ,预示绍鸭垂体对 (D2Lys6) L HRH 存在同一类高亲和力的结合位点。垂体膜制剂
和垂体整体细胞的平衡解离常数 ( Kd)分别为 0134nM 和 0143nM ,两个 Kd 值相近且
垂体整体细胞显示出较大的最大结合容量 (Bmax) ,这说明本研究的酶法消化分散垂
体细胞对其 L HRH 受体的损伤较小。(D2Lys6) L HRH (10 - 11～10 - 6 M) 能取代示踪
物的特异性结合。本研究结果验证了绍鸭垂体 L HRH 受体的存在并提供了其基本
结合特性。
关键词 :L HRH放射受体结合法　垂体膜制剂　垂体细胞　125 I2(D2Lys6) L HRH　绍鸭
下丘脑通过其合成的十肽 ———促性腺激素释放激素 (L HRH)与特异的高亲和力的受体结
合后 ,控制垂体前叶分泌促黄体生成素 (L H) 和促卵泡素 ( FSH) 。与哺乳动物不同 ,禽类下丘
脑分泌两种促性腺激素释放激素 ,即 L HRH2I 和 L HRH2Ⅱ,都能促使禽类垂体前叶分泌 L H
和 FSH[1 ] 。哺乳动物 L HRH 与受体的结合特性已分别在垂体细胞膜制剂和体外培养的垂体
细胞上得到阐明[2 ] ,而禽类垂体前叶 L HRH 受体的特性尚未得到明确阐明。鸡的垂体细胞膜
制剂与125 I2(D2Trp6) L HRH 表现出特异性结合[3 ] 。Kawashima 等[4 ]用125 I2(D2Trp6) L HRH 研
究了鸡垂体细胞膜制剂的结合特性 ,发现垂体 L HRH 受体的结合特性随不同的生殖生理时期
而变化。绍鸭是我国优良的产蛋鸭品种 ,阐明其垂体 L HRH 受体的特性可进一步揭示其高繁
殖率的生殖生理基础。本研究用 L HRH 的高效类似物 (D2Lys6) L HRH ,经碘标后作为示踪物 ,
建立了绍鸭垂体 L HRH 受体的放射结合分析法 ,并在整体垂体细胞和垂体细胞膜制剂上探讨
92　核 农 学 报　2000 ,14 (1) :29～35Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
了绍鸭 L HRH 受体的结合特性。
1 　材料与方法
111 　激素与生化试剂
高亲和力的 L HRH 类似物 (D2Lys6) L HRH(p Glu2His2Lys2Ser2Tyr2D2Lys2Leu2Arg2Pro2Gly2
N H2) 、胶原酶 (Collagenase Type Ⅱ) 、胰酶 ( Trypsin) 和牛血清白蛋白 (BSA Fraction V) 均购自
美国 Sigma 公司 ;Na2125 I (100 mCi/ ml)购自英国 Amersham 公司。
112 　动物
产蛋绍鸭 (12 月龄以上 ,体重 115～212kg)购自绍兴绍鸭原种场。在 24h 光照下用固定营
养饲料 (CP :15 % ,ME :21750 kcal/ kg)饲养 15d 以上 ,然后断头取出垂体用于实验。
113 　( D2Lys6) L HRH碘标
将 5μg (D2Lys6) L HRH 溶解于 10μl 的 011M 醋酸中 ,加入 1mCi125 I2Na10μl ,与 8μg 溶解于
20μl 0105M 磷酸缓冲液 ( PB) 的氯胺 T 反应 1min ,用 500μl 015MPB 中止反应 ,反应物在 1 ×
50cm 的 Sephadex G225 柱上用 011 % BSA2011M 醋酸分离 ,125 I 游离峰后继的第 1 个峰为125 I2
(D2Lys6) L HRH ,取峰值管用 015 M PB 适当稀释后 ,在 - 20 ℃保存可持续使用 30d。用严格配
制的 (D2Lys6) L HRH 标准溶液取代125 I2(D2Lys6) L HRH 与垂体细胞膜制剂的结合 ,当取代
50 %的125 I2(D2Lys6) L HRH 的结合时 ,求得比放射活性约为 72115μCi/μg。
114 　垂体细胞膜制剂制备
取出的新鲜垂体用冰冷的分析试剂 (10 mM Tris2HCl ,1mM 1 ,42二硫代苏糖醇 ,015 %
BSA ,p H716)洗涤 3 次 ,用 D Y 892I 型电动玻璃匀浆机在冰上匀浆 ,250g 匀浆液于 4 ℃离心
5min ,取出上清液并加入适量 4M MgCl2 ,稀释至 2 倍体积等分分装于 2 个试管中 ,15 ,000g 超
速离心 45min ,沉淀即为制备的垂体膜制剂 ,沉淀悬浮于适量的冰冷分析试剂中 (1 个垂体等同
于 100μl 膜制剂) ,并立刻用于结合实验。为了测定膜制剂的粗蛋白 ,其中 1 等分的垂体膜制
剂用不含 BSA 的分析试剂经同样程序制备 ,用 Bradford 法测定膜制剂的粗蛋白 ,BSA 作为测
定的标准品。
115 　垂体前叶细胞培养
无菌条件下取出垂体前叶 ,用 DMEM 液冲洗数次 ,充分剪碎后垂直悬浮在 DMEM 液中
静止 5min ,弃去上清液 ,垂体小块用含 0105 %胶原酶的 DMEM 在搅动状态下 37 ℃消化
45min ,用灭菌的巴氏管轻轻吹打消化液 ,分散被消化的垂体块 ,静置数分钟 ,取出上清液。试
管底部垂体小块继续用含 0125 %胰酶消化 30min ,用含犊牛血清的 DMEM 中止胰酶消化 ,再
用巴氏管吹打消化液 ,静置数分钟 ,取出上清液 ,并合并两上清液 ,以 100g 离心 8min 回收细
胞 ,沉淀即为分散的细胞。加入含 10 %犊牛血清的 DMEM 悬浮垂体细胞 ,用血球计数器计数
细胞 ,细胞产率约为 106 个细胞每个垂体 ,稀释成 015 ×106 个细胞/ ml ,细胞在 5ml 的细胞培养
瓶中培养 48h 后 ,用苔芬蓝检测细胞活率达 90 %以上 ,100g 培养物经 8min 离心后抽吸掉上清
液 ,细胞重新悬浮于放射受体分析液中 (100μl 含 106 个细胞) 。培养中的绍鸭垂体细胞见图版 1。
116 　放射受体结合分析
11611 　整体垂体细胞 　将 100μl 细胞悬液 (含 106 个细胞) 、100μl 分析试剂 (特异性结合管)
或含 10 - 6M (D2Lysb) L HRH 的分析试剂 (相应对照管) 和 100μl 125 I2(D2Lys6) L HRH 于 4 ℃下
03 核　农　学　报 14 卷
图版 Ⅰ　培养中的绍鸭垂体细胞
(由胶原酶和胰酶消化垂体制备而得)
Plate. Ⅰ. Shao duck pituitary cell culture prepared
by enzymatic dispersion with collagenase
and trypsin
反应 90min ,用 2ml 冰冷的 PBS 终止反应 ,反应
管于 4 ℃2000g 离心 30min ,将沉淀进行放射性
计数。
11612 　垂体细胞膜制剂 　将膜制剂、100μl 分
析试剂或含 10 - 6M (D2Lys6) L HRH 分析试剂和
100μl 125 I2( D2Lys6 ) L HRH 于 4 ℃下 反 应
90min ,用 2 ml PBS 含 2 % PEG 中止反应 ,在
10000g 下离心 30min ,沉淀用 Beckman 计数器
计数 ,计数效率为 75 %。
特异性结合等于特异性结合管沉淀的放射
性减去相应对照管沉淀的放射性。单位以 pM
表示 ,结合反应的平衡解离常数 ( Kd) 和最大结
合容量 (Bmax)按 Scatchard 方法计算 (1949) 。
2 　结果与分析
211 　孵育时间对结合率的影响
含 106 个细胞的 100μl 细胞悬液与 20 000cpm 125 I2(D2Lys6) L HRH 于 4 ℃结合反应 ,分别
孵育 90min 和 24h。用含 10 - 6M (D2Lys6) L HRH 的管作相应对照。短时间孵育结合率 (B/ T)
为 10104 % ,经 24h 后 ,结合率下降为 2197 %(见图 1) 。可见 ,125 I2(D2Lys6) L HRH 与垂体细胞
的结合反应为快速反应。由于长时间孵育细胞的酶活性降解125 I2(D2Lys6) L HRH 影响结合
率 ,本研究采用短时孵育。
图 1 　4 ℃下孵育 90min 或 24h 125 I2(D2Lys6 ) L HRH
与 106 垂体细胞的结合率
Fig. 1. 125 I2(D2Lys6) L HRH binding with 106
isolated pituitary cells during incuba2
tion at 4 ℃for 90 min or 24h
以特异性结合与总计数之比表示 (B/ T) ;数值为 3 个
反应管的平均值
Data show fraction bound ( B/ T , percentage of total
counts) corrected for nonspecific binding measured in the pres2
ence of 10 - 6 M (D2Lys6) L HRH. 图 2 　125 I2(D2Lys6) L HRH 与不同浓度的垂体膜制剂Fig. 2. 125 I2(D2Lys6) L HRH binding to in2creasing concentrations of Shao duckpituitary membrane preparation相当于 1～2 个垂体结合反应的特异性结合率 (B/T) ;数值为 3 个反应管的平均值。Equivalent to 1～2 pituitaries per tube. Parallel incu2bations were also carried out in the presence of 10 - 6 M (D2Lys6) L HRH and the results used for correction of nonspe2
cific binding.
13　1 期 绍鸭垂体 L HRH 放射受体结合法及其结合特性
212 　不同垂体膜制剂浓度与125 I2( D2Lys6) L HRH的结合率
以不同浓度的垂体膜制剂与125 I2(D2Lys6) L HRH 结合反应 ,特异性结合随膜制剂浓度增
加而增加 (见图 2) ,相当于 2 个垂体的膜制剂与125 I2(D2Lys6) L HRH 的结合率在本次实验中为
8180 %。垂体膜制剂浓度在本实验的范围内 (1～2 个垂体) ,125 I2(D2Lys6) L HRH 的特异性结
合与之呈正线性关系。
213 　125 I2( D2Lys6) L HRH的结合平衡
垂体膜制剂和垂体细胞悬液与不同浓度的125 I2(D2Lys6) L HRH (2 ,0000～30 ,0000 cpm 和
3 ,5000～35 ,0000 cpm) 反应 ,经 Scatchard 方法分析 ,在本实验125 I2(D2Lys6) L HRH 浓度范围
内 ,饱和结合反应结果呈线性关系 (见图 3) ,说明结合反应为一级反应 ,即可推测为125 I2(D2
Lys6) L HRH 与垂体上同一类型的结合位点结合。经 Scatchard 计算及线性模拟 ,求得垂体细
胞膜制剂和垂体细胞与125 I2(D2Lys6) L HRH 结合反应的平衡解离常数 ( Kd)分别为 0134nM 和
0143nM。两者十分相近。而最大结合率 (Bmax ) 垂体细胞较垂体细胞膜制剂大 ,分别为
8185pM 和 28116 pM (见图 3) 。
图 3 　绍鸭垂体细胞膜制剂 (22μg 蛋白质每反应管) (a) 与培养的垂体细胞 (106 个/ 反应管)
(b)与不同浓度的125 I2(D2Lys6) L HRH 结合反应的结合率。
Fig. 3. Specific binding of Shao duck pituitary membrane preparation (22μg pro2
tein/ tube) (a) to isolated pituitary cells(106 cells) (b) to increasing concen2
t rations of 125 I2(D2Lys6) L HRH
数值为 3 个反应管的平均值 (a)垂体细胞膜制剂 , (b)垂体细胞
Data were corrected for nonspecific binding determined in the presence of 10 - 6 M (D2Lys6) L HRH.
(a) Pituitary membrane preparation , (b) Pituitary cell
214 　( D2Lys6) L HRH取代125 I2( D2Lys6) L HRH的特异性结合
加入不同浓度的非标记 (D2Lys6) L HRH (10 - 11～10 - 6 M) 能取代部分125 I2(D2Lys6) L HRH
与垂体膜制剂的结合。125 I2(D2Lys6) L HRH 在不同 (D2Lys6) L HRH 浓度存在下表现的结合率
见图 4。
23 核　农　学　报 14 卷
图 4 　125 I2(D2Lys6) L HRH 与绍鸭垂体膜制剂的结合被不同浓度的 (D2L ys6) L HRH 所取代
Fig. 4. Displacement of 125 I2(D2Lys6) L HRH by increasing concentrations
of unlabeled (D2Lys6) L HRH from Shao duck pituitary membrane preparations.
　　以特异性结合与总计数之比表示 ,数值为 3 个反应管的平均值。
　　Data are the fraction of bound label (percentage of total counts) after substraction
　　of nonspecific binding in the presence of 10 - 6 M cold peptide.
3 　讨 　论
本研究用 (D2Lys6) L HRH 碘标记证明了绍鸭垂体 L HRH 受体的存在。在禽类上 ,Millar
和 King[3 ]报道125 I2(D2Lys6) L HRH 能与鸡垂体膜制剂特异结合 ; Kawashima[4 ]用125 I2(D2Lys6)
L HRH 阐明了鸡垂体 L HRH 受体的结合特性和结合容量 ;本研究从 Scatchard 分析所得的解
离常数 ( Kd) 与 Kawashima 在鸡上报道的结果相近。本研究使用的垂体采自产蛋绍鸭 ,
Scatchard 分析所得的最大结合容量要比在产蛋鸡上报道的结果大 ,这反应了禽类品种间的差
异 ,同时也体现了绍鸭下丘脑2垂体生殖轴的独特性 ,垂体 L HRH 受体位点对 L HRH 有较高的
结合容量 ,反应了垂体对下丘脑促性腺激素释放激素有较高的灵敏度。Scatchard 分析揭示
125 I2(D2Lys6) L HRH 特异性结合的量与特异性结合和游离的125 I2(D2Lys6) L HRH 之比呈线性
关系 ,说明该结合反应是一级反应 ,绍鸭垂体对 (D2Lys6) L HRH 存在同一类型的受体结合位
点 ,并且有较高的亲和力 ( Kd 值较大) 。
天然的 L HRH 易被脑和垂体的蛋白酶从 Gly62Leu7 处裂解[5 ] ,人工合成的 L HRH 类似物
在 6 位用 D2氨基酸取代 ,从而降低其对降解酶的敏感性 ,增强了其生物活性[6 ] ,L HRH 的高效
类似物对垂体L HRH 受体有较高的亲和力[7 ] 。(D2Lys6) L HRH 是L HRH 的一种高效类似物 ,
在本研究中短期孵育表现出很好的稳定性 ,获得与其它研究相等同的结合率 ;但长期孵育仍能
被细胞酶降解 ,显著地降低结合率。从本研究结果看 ,用 (D2Lys6) L HRH 可建立快速稳定的
L HRH 放射受体结合法。
L HRH 放射受体法需高比放射性碘标记的 L HRH 类似物。L HRH 上的酪氨酸和组氨酸
残基的碘化直接与其生物活性和免疫活性相关。Hunter 和 Greenwood 首先用氯胺 T 法标记
L HRH。Piyachaturewata[8 ]证明氯胺 T 法易引起双碘化 ,而双碘标记的 L HRH 失去生物活性。
从本研究碘标看 ,控制氧化剂的量和反应时间 ,用传统和操作简单的氯胺 T 法 ,可以得到高生
物活性的125 I2(D2Lys6) L HRH 。
(D2Lys6) L HRH 能取代部分125 I2(D2Lys6) L HRH 与垂体膜制剂的结合 ,进一步证明了125 I2
33　1 期 绍鸭垂体 L HRH 放射受体结合法及其结合特性
(D2Lys6) L HRH 与垂体膜制剂的结合是特异性结合 ,这也反应在随着垂体膜制剂浓度的增加 ,
这种特异性结合也随之增加。禽类 L HRH 有两类 :即 L HRH2Ⅰ和 L HRH2Ⅱ,它们与垂体上的
L HRH 受体结合后促进垂体释放 L H 和 FSH。(D2Lys6) L HRH 是 L HRH 的高效类似物 ,它与
垂体上 L HRH 受体结合有较强的亲和力。125 I2(D2Lys6) L HRH 作为标记物来建立绍鸭垂体
L HRH 受体放射结合法是可行的。
整体细胞上观察到的 Kd 值与在垂体膜制剂上观察到的 Kd 相近。这说明本研究所用的
分散垂体细胞的酶消化法没有对垂体 L HRH 受体造成很大的伤害。有报道[9 ]指出用胰酶消
化获得的细胞不能检测 L HRH 受体的特异性结合 ,胰酶使垂体细胞丢失了大部分 L HRH 受
体 ,而胶原酶的消化相对温和 ,对 L HRH 受体损伤小 ,但细胞产率低。本研究采用的胶原酶2
胰酶混合法 ,从结合反应的结果看 ,既对 L HRH 受体损伤小又能获得较高的细胞产率 ,实验结
果也可能预示着胰酶消化的细胞经 48h 静态培养后能恢复损伤。
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43 核　农　学　报 13 卷
A RADIORECEPTOR ASSAY OF L UTEINIZING HORMONE2REL EASING
HORMONE RECEPTOR AND CHARACTERIZATION OF L HRH BINDING TO
PITUITARY RECEPTORS IN SHAO D UCK
YAN G Pei2xin1 　WU Mei2wen2 　CHEN Zi2yuan2
(1 . College of A ni mal Scieces ;2 . Instit ute of N uclear2A gricult ural Sciences ,
Zhejiang A gricult ural U niversity , Zhejiang Prov . Hangz hou 　310029)
ABSTRACT: The properties of Shao duck pituitary luteinizing hormone2releasing hormone
( L HRH) receptors were analyzed in pituitary membrane preparation and isolated pituitary cells
prepared by enzymatic dispersion with collagenase and trypsin , by using a superagonist analog
of ( D2Lys6) L HRH. High binding of 125 I2( D2Lys6) L HRH to 106 cultured cells of Shao duck was
observed after a 90 minute incubation at 4 ℃, while binding was signif icantly reduced after a
24h incubation. Binding of the radiol igand was a f unction of tissue concentration of Shao duck
pituitary membrane preparation , with a positive correlation over the range of 1～2 pituitary per
tube. Specif ic binding for 125 I2( D2Lys6) L HRH increased with the increase in the amount of 125 I2
( D2Lys6 ) L HRH. The Scatchard analysis of data revealed a l inear relationship bet ween the
amount of specif ic binding and the ratio of specif ic binding to free 125 I2( D2Lys6) L HRH, indi2
cating a single class of high aff inity sites. Equil ibrium dissociation constant( Kd) was 0134 nM
in pituitary membrane preparation and 0143nM in isolated pituitary cells. Both Kd values were
near and the maximum binding capacity ( Bmax) was great in isolated cells , suggesting no signif i2
cant loss of the L HRH receptor population caused by the enzymatic procedure employed for cell
dispersion in the present study. Addition of ( D2Lys6 ) L HRH displaced bound 125 I2( D2Lys6 )
L HRH. These results demonstrated the presence and provided characterization of L HRH recep2
tors in Shao duck pituitary.
Key words : L HRH radioreceptor assay ; membrane preparation ; cell culture ; 125 I2( D2Lys6 )
L HRH ; Shao duck
53Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (1) :29～35