全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 052372204
草坪草生物技术进展及研究热点
张　磊1 , 2 　胡繁荣1 　沈希宏1 　马传喜2 　吴殿星1 3
(1. 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ; 2. 安徽农业大学农学系 ,安徽 合肥　230036)
摘 　要 :对草坪草转基因、分子标记和体细胞无性系变异等方面的研究进展作了简要的概述 ,提
出了抗逆、抗病虫与环保型、纯天然彩色草坪草的等研究热点。核技术在改良草坪草的观赏性
状、抗逆性、抗病性等方面将发挥重要作用。
关键词 :草坪草 ;转基因 ;核技术
ADVANCES IN TURFGRASS BIOTECHNOLOGY AND HOT RESEARCH TOPICS
ZHANGLei1 , 2 　HU Fan2rong1 　SHEN Xi2hong1 　MA Chuan2xi2 　WU Dian2xing1
(11 Institute of Nucleus Agriculture Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310029 ;
21 Agronomy Department , Anhui Agricultural University , Hefei , Anhui , 　230036)
Abstract :Advances in turfgrass biotechnology including genetic transformation , molecular marker , and somaclonal
variation were briefly reviewed in the paper. Several hot research topics of the development of turfgrass including
abiotic2stress resistance , insect and disease2resistance , and the natural colorful leaves were presented. The nuclear
technique will play very important role in turfgrass improvement such as ornamental character , abiotic tolerance , and
disease resistance.
Key words :turfgrass ; genetic transformation ; nuclear technique
收稿日期 :2003201202
基金项目 :国家自然科学基金 (30370147)和浙江省重大项目 (021102530)
作者简介 :张磊 (1979～) ,安徽蒙城人 ,博士研究生 ,从事草坪草生物技术方面的研究。3 通讯作者 ,E2mail :dxwu @zju. edu. cn ; 　0571 - 86971202草坪草是指构成草坪植被的草本植物 ,具保持水土、改造自然、美化环境等多种功能[1 ,2 ] 。随环境意识的不断增强 ,草坪园林已成为城市规划与社区建设中不可缺少的内容。草坪草的研究开发在发达国家历史较久 ,已是一门成熟的学科和产业。仅美国 ,草坪业的年产值就超过 640 亿美元 ,不仅是经济支柱产业 ,也是吸引就业人数最多的行业之一[3 ] 。其中 ,草种的年交易额超过 518 亿美元 ,仅次于杂交玉米[4 ] ,养护肥料使用量约 7000 万 t ,杀虫剂 54316 万 kg ,除草剂 2046 万 kg ,杀菌剂 245 万 kg。我国草坪业尚处于初级阶段 ,所使用的草坪草 90 %以上依赖进口 ,大片的空地需要绿化 ,是一门充满商机的朝阳产业[5 ] 。进入 WTO 后 ,要走草坪业国产化之路 ,除注重资源保护和良种引种外 ,应加强生物技术的应用 ,培育我国拥有自主知识产权的草坪草新品种[6 ] 。自 1988 年首例转基因草坪草鸭茅报道以来 ,转基因在主要的草坪草品种上相继获得了成功 ,但由于生物安全性的原因至今尚未有转基因草坪草进入商业化应用[7 ] 。在草坪草育种中 ,有机结合转基因、分子标记等技术 ,缩短育种周期 ,有效改良草坪草的抗逆、抗病、抗虫和抗除草剂等性状 ,将是草坪草研究的新领域。
273　 核 农 学 报　2004 ,18 (5) :372～375Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　草坪草转基因研究
111 　品种类型与目标基因
自鸭茅首次转化以来 ,迄今已有 8 种以上不同类型的草坪草进行转化研究并获得转基因植株。除
结缕草为暖季型外[8～10 ] ,其它多为冷季型草坪草 ,即鸭茅[7 ] 、高羊茅[12～16 ] 、匍匐剪股颖[17～20 ] 、草甸羊
茅[21 ] 、紫羊茅[14 ,15 , 22 ] 、小糠草[23 ] 、多年生黑麦草[24 ,25 ] 、草地早熟禾[11 ] 。遗憾的是 ,狗牙根等最主要的运动
场草坪草 ,白三叶和马蹄金等最主要的观赏草坪草尚未见成功遗传转化的报道。
目前 ,转化的有用基因较少 ,主要为抗除草剂基因 Basta。转化的目标基因仅是单基因 ,尚未见将含
抗病、抗虫、耐逆性、抗除草剂等两个或几个基因中的基因同时遗传转化的报道。与其它转基因作物一
样 ,由于对转基因草坪草的生物安全性缺乏足够的认识 ,目前美国只批准了匍匐剪股颖 1 种转基因草坪
草进行大田测试[22 ] 。
112 　外植体
在转化的报道中 ,成熟种子是利用最多的外植体[26 ] 。其它部位的外植体主要有 :叶基部切片[7 ] ,未
成熟胚和花序[27 ] 。以往的草坪草转化中 ,无论是 PEG法或电穿孔法 ,多以通过从胚性愈伤细胞悬浮培
养物或从细胞悬浮培养而来的原生质体作为基因转化的受体 ,程序比较繁琐 ,不但培养悬浮细胞和分离
原生质体难度大 ,而且从原生质体再生植株也很困难。Cho 等[15 ] 以高羊茅和紫羊茅可高度再生的绿色
组织诱导形成的胚性愈伤组织为受体 ,轰击分别含 hpt , bar 和 gus 基因的 3 种质粒。在转基因植株中 ,3
种质粒的共表达率为 25 %～27 % ,两个基因的共表达率为 50 %～75 %。
Cho 等[15 ]进一步将绿色组织形成的胚性愈伤在弱荧光灯下 (16h 10～30μEm - 2 s - 1 )经 4～5 个月的预
培养 ,发现更适合转化。采用这种方法从 118 个高羊茅的绿色组织中获得了 8 个转基因株系 ,这 8 个株
系全部得到再生 ,转化频率为 618 % ;从紫羊茅 245 个绿色组织中获得了 11 个转基因株系 ,其中有 9 个
株系得到再生 ,其转化频率为 317 %。上述方法的缺点是转化所需的时间较长 ,Cho 等转化高羊茅和紫
羊茅用了约 12 个月的时间[15 ] 。
113 　转化方法
目前草坪草转基因中应用最多的方法是DNA 直接导入法和基因枪法。
11311 　DNA 直接导入法 　已成功用于高羊茅[12～16 ] 、匍匐剪股颖[20 ] 、紫羊茅[22 ] 、小糠草[23 ] 、结缕草[9 ,10 ]的
遗传转化并获得再生植株。
11312 　基因枪法 　已成功用于高羊茅[14 ,15 ] 、草地早熟禾[11 ] 、多年生黑麦草[24 ,25 ] 、匍匐剪股颖[17～20 ] 、结缕
草[9 ,10 ]的遗传转化并获得再生植株。
11313 　农杆菌介导法 　农杆菌介导法在草坪草遗传转化中应用不多 ,笔者所在的实验室初步建立了结
缕草、高羊茅和白三叶等草坪草的转化体系。农杆菌介导转化时 ,应合理考虑激素尤其是 2 ,42D 的使
用。2 ,42D 有利于愈伤组织的诱导 ,但显著降低分化成苗效果。Khayri 等[28 ] 在诱导结缕草分化时 ,发现
分化培养基上不加 2 ,42D 时平均每块愈伤可长出 16 个小植株 ,而在浓度为 5mgΠL、715mgΠL、10mgΠL 的 2 ,
42D 处理后平均每块愈伤仅长出 012 个小植株。
114 　选择标记及其浓度
草坪草转基因植株或细胞的筛选主要选用抗生素、除草剂或绿色荧光蛋白。抗生素中多为潮霉素 ,
除草剂则是 bialaphos。不同草坪草品种对选择标记的耐受力不同 ,因而所需的选择标记浓度也有所不
同。Spangenberg 等[25 ]对多年生黑麦草转化时 ,潮霉素的最高浓度为 200mgΠL ,而 Inokuma 等[9 ] 筛选结缕
草的转化体时 ,其最高浓度可达 400mgΠL。Hartman 等[17 ]用 bialaphos 筛选匍匐剪股颖时浓度较低 ,为 2～
4mgΠL。Asano 等[23 ]筛选紫羊茅时所用的 G418 浓度为 20mgΠL。
2 　草坪草蛋白质和分子标记研究
传统的表型标记育种 ,具有简单、直观的优点 ,但易受环境和生理代谢的影响。采取与农艺性状相
373　5 期 草坪草生物技术进展及研究热点
关的理化标记和分子标记辅助选择 ,不仅可大大提高育种效率 ,也可鉴定和保护品种资源。
21 1 　蛋白质标记
Wilkinson 首次在草坪草中开展蛋白质标记的研究[29 ] 。他分析了剪股颖和草地早熟禾的全蛋白质
电泳图谱 ,发现不同品种间叶蛋白的条带不尽相同。蛋白质标记研究最多的是同工酶标记。Wehner
等[30 ]鉴定了 Kentucky Bluegrass 不同品种中过氧化物同工酶的差异。Villami 等[31 ] 利用酯酶和磷酸葡萄
糖变位酶的同工酶标记 ,进行紫羊茅的鉴定。可用于草坪草的其它同工酶系还包括磷酸葡萄糖异构酶、
谷氨酸草酰转氨酶、磷酸丙糖异构酶等。
212 　DNA分子标记
应用于草坪草研究的 DNA 分子标记主要有 RAPD、RFLP、AFLP 和 SSR 标记。Caetano 等[32 ]研究了野
牛草的 DNA 指纹图谱 ,发现 RAPD 标记对野牛草不同品种的分辨率高达 97 %。Huff 等[33 ] 运用 RAPD 标
记 ,确定了草地早熟禾兼性无融合生殖植株的遗传起源。Xu 等[34 ] 利用 RFLP 标记构建了高羊茅和黑麦
草的树状图 ,确定了两者之间的亲缘关系。Caetano 等[35 ] 根据 AFLP 标记识别鉴定狗牙根的不同品种。
Liu 等[36 ]用 SSR 标记对雀稗生态型进行了分类。
3 　体细胞无性系变异
体细胞无性系变异是组织培养中经常发生的现象 ,被视为育种的一种重要新变异源。目前尚未见
到通过此方法选育出草坪草新品种的报道。由于对转基因植物的担忧 ,近年来体细胞无性系变异育种
深受重视 ,美国最近筛选鉴定了一些优异突变体。我国也正加强该方面的研究 ,以选育优质抗逆草坪
草 ,尤其是用于西北地区的城市绿化和水土保持。
4 　草坪草研究热点
411 　优质抗逆草坪草
41111 　提高耐寒性 ,延长绿叶期 　绿化使用的草坪草分冷季和暖季 2 种类型。受固有生长特性的制
约 ,当前市场上尚未见四季常绿的草坪草品种。绿化实践中 ,冷季型草坪草冬季低温条件下表现为正常
绿色 ,夏季高温条件下进入休眠期 ,地上部分死亡 ,叶片变为枯黄。相反 ,暖季型草坪草则在夏季高温下
呈正常绿色 ,冬季低温下叶片表现枯黄。提高暖季型或冷季型草坪草的耐寒性或耐热性 ,以达到延长保
持绿叶期之目的系园林绿化者的时尚追求。
41112 　节水抗旱性和耐盐性 　随着城市草坪绿化面积的日益增加 ,草坪灌溉需水的维持是许多城市景
观设施中竞争用水的一个重要方面[37 ] 。研究表明 ,不同草坪草品种间水分消耗率差异明显 ,一般为 3～
8mmΠd ,高的达 12mmΠd ,选用 1 个抗旱品种甚至能节约用水 50 %以上[38 ] 。因此 ,通过选育抗旱草坪草来
减少灌溉用水且保证草坪质量将是一个重要的措施。当前 ,我国特别缺乏抗旱的草坪草品种 ,草地绿化
也集中在经济发达的地区 ,在西部地区紧缺节水抗旱草坪草品种 ,开展节水抗旱草坪草研究具有特殊的
现实意义。
412 　抗病虫与环保型草坪草
建坪后的管理技术是当前草坪工作者最为关注的环节 ,也是缩短我国草坪质量和国外差距的根
本[39 ] 。据不完全统计 ,我国每年用于建坪的进口草种达 100t 以上 ,建植各类草坪约 500 万 m2 ,但是因病
虫害类型不同和存在地域性的差异 ,导致病虫害等问题频频发生 ,引起草坪质量明显下降和严重退化 ,
造成大量的资金浪费。针对进口草种建坪后病虫害频发的问题 ,研究人员提出了一些措施 ,但多以药剂
防治为主 ,虽有一定的效果但并不理想。为避免环境污染 ,采取生物防治、加强多抗新品种的选育将是
今后草坪草的研究趋势。
另外 ,随着城市绿地面积的不断扩大 ,将能富集重金属离子的基因 ,如汞离子还原酶基因 merA ,以
及来源于微生物的可降解污染物的基因 ,如可降解有机污染物的邻苯二酚 1 ,2 双加氧酶基因 tf dC ,转入
473 核　农　学　报 18 卷
到草坪草中去 ,进而培育出环保型草坪草新品种 ,使其同时具备美化环境和污染处理的双重功效 ,也是
今后的研究重点。
413 　纯天然彩色草坪草
由于缺乏其它颜色的草坪草专用品种 ,在绿化中只能利用颜色单一的绿色草坪。实际生活中 ,运动
场和高尔夫球地 ,尤其是每逢重大赛事和重要庆祝活动等 ,纪念文字、吉祥物和标志物等彩色图案的配
制往往不得不采用化学染料。迄今为止 ,国内外尚未有彩色草坪草培育的研究报道。最近 ,笔者所在的
实验室成功从高羊茅、剪股颖、猎狗等中创造了金色、粉红、淡绿和银边等叶色与绿色迥然不同的彩色草
坪草资源 ,为该领域的重大突破提供了可能。
5 　核技术在草坪草改良中的潜在应用
作为核技术农业应用的一个重要方向 ,植物诱变育种取得了举世瞩目的成就。目前 ,一些新的诱变
技术 ,如空间技术正成为新的诱变手段 ,核辐射与生物技术相结合可大幅度提高诱变效率和效果 ,其应
用也日益增多。据不完全统计 ,至 1998 年我国已在水稻、麦类、桑、花卉等 40 多种植物上诱变育成 513
个品种 ,其种植面积约占我国各类作物种植面积的 10 %。此外 ,核技术在有效创造自然界未有的新基
因方面也有不可替代的作用。因此 ,核技术在园艺花卉等经济作物新品种培育中的应用将更加广泛。
如上所述 ,草坪质量的优劣是世界各国关注的重点。提高坪性性状 (如矮生性 ,以降低草坪草的修
剪 ;改良叶形和叶色 ,以提高观赏性状等) 、抗逆性 (耐寒、耐热、耐旱、耐盐碱性) 、抗病虫性等 ,选育优质
抗逆草坪草的研究前沿。利用核技术改良这些性状在不同的植物诱变育种上已有成功的例子。因此 ,
我们有理由相信核技术 ,尤其是离体诱变技术 ,将在优质抗逆草坪草育种改良起重要的作用。
参考文献 :
[ 1 ] 　艾定增 1 草坪文化与环境色彩. 中国园林 , 1993 , 9 (1) : 32～33
[ 2 ] 　Henderson S , et al . Residential lawn alternatives : a study of their distribution , form and structure. Landscape and Urban Planning ,1998 , 42 : 135
～145
[ 3 ] 　Kidd G. Why do agbiotech firms neglect turf grasses. Biotechnol , 1993 , 11 : 268
[ 4 ] 　刘自学. 中国草业的现状与展望. 草业科学 , 2002 , 19 : 6～8.
[ 5 ] 　韩烈保. 草坪业 - 我国新兴的朝阳产业. 科技大市场 , 2001 , 22 : 57
[ 6 ] 　孙吉雄. 积极开发国有草坪草草种质资源 , 实现草坪种子国产化. 见 : 陈佐忠. 面向 21 世纪的中国草坪科学与草坪业. 北京 : 林
业大学出版社 , 1999 , 13～15
[ 7 ] 　Horn M E , et al . Transgenic plants of Orchardgrass ( Dactylis glomerata L. ) from protoplast . Plant Cell Rep ,1988 , 7 : 469～472
[ 8 ] 　Ahn B J , et al . In : Annual Meeting of Korean society of Plant Tissue Culture and Joint Workshop for Plant Biotechnology Between Korean and
Israel . Korea : Seoul National University Press , 1998 , 35
[ 9 ] 　Inokuma C , et al . Transgenic Japanese lawngrass ( Zoysia japonica Steud . ) plant regenerated from protoplast . Plant Cell Rep ,1998 , 17 : 334～
338
[10 ] 　Park G H , et al . Electroporation condition for DNA transfer into somatic embryogenic callus of Zoysia japonica . Korean J Plant Tissue Cult ,1998 ,
25 : 13～19
[11 ] 　马忠华 , 张云芳 , 徐传祥 , 等. 早熟禾的组织培养和基因枪介导的基因转化体系的初步建立. 复旦学报 (自然科学版) , 1999 , 38
(5) : 540～544
[12 ] 　Wang Z Y, et al . Transgenic plant of tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) obtained by direct gene transfer to protoplast . Biotechnology ,
1992 , 10 : 691～696
[13 ] 　Ha SB , et al . Transgenic turf2type tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) plant from protoplast . Plant Cell Rep ,1992 , 11 : 601～604
[14 ] 　Spangerberg G, et al . Transgenic tall fescue ( Festuca arundinacea . ) and red fescue ( F. rubra) plants from microprojectile bombardment of
embryogenic suspension cell . J Plant Physiol ,1995 , 145 : 693～701
[15 ] 　Cho M J , et al . Production of transgenic tall fescue and red fescue plants by particle bombardment of highly regenerative tissues. Plant Cell Rep ,
2000 , 19 : 1084～1089
(下转第 396 页)
573Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (5) :372～375
θCF3 ClO θ COOHNO2 + NH2S2CH3 PO3Cl θCF3 ClO θ 14CONHSO2CH3NO2
将硝化物、01222g 甲基磺胺和 11482gPOCL3 投入 25ml 三口瓶中 ,保持温度 90 ℃反应 16h ,脱溶 ,加水
4ml。用乙醚萃取 3 次 ,脱溶 ,得浅黄色固体 015535g ,放射强度 1184mci ,比强 31324μciΠmg。化学收率
6715 % ,放化收率 42144 %。
所得化合物与标准虎威在同一块硅胶 GF2254 在薄层上进行分离 ,两者的 Rf 值相同 ,说明为同一种
化合物。产物用薄层扫描法测得放化纯度大于 99 %。
参考文献 :
[1 ] 　Hagood T E ,Bauaman J L. Growth Analysis of Soybeans in Competition with Velvetleaf . Weed Science , 1980 , 28 :729～734
[2 ] 　Oriwick P L , Schreiber M M. Interference of Redroot Pigweed and Robust Foxtail in Soybeans( Glycine max) . Weed science , 1979 ,27 : 665～674
[3 ] 　BP. 2 ,014 ,565
[4 ] 　特开昭 58 - 26860
[5 ] 　特开昭 58 - 38235
[6 ] 　特开昭 56 - 127331
[7 ] 　唐除痴 ,等. 农药化学. 天津 :南开化学出版社 ,1998 ,554～558
(上接第 375 页)
[16 ] 　Dalton S J , Bettany A J E , Timms , et al . The effect of selection pressure on transformation frequency and copy number in transgenic plants of tall
fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) . Plant Sci ,1995 , 108 : 63～70
[17 ] 　Hartman C L , et al . Herbicide resistant turfgrass ( Agrostis palustris Huds . ) by biolistic transformation. Biotechnol ,1994 , 12 :919～923
[18 ] 　Lee L , et al . Transformation and regeneration of creeping bentgrass ( Agrostis palustris Huds . ) protoplast . Crop Sci ,1996 , 36 : 401～406
[19 ] 　Xiao L , et al . Efficient selection and regeneration of creeping bentgrass transformants following particle bombardment . Plant Cell Rep ,1997 , 16 :
874～878
[ 20 ] 　Zhong H , et al . Transgenic plants of turfgrass ( Agrostis palustris Huds . ) from microprojectile bombardment of embryogenic callus. Plant Cell Rep ,
1993 , 12 : 1～6
[21 ] 　Wang Z Y, et al . Fertile plant regeneration from protoplast of meadow fescue ( Festuca pratensis Hunds . ) . Plant Cell Rep ,1993 , 12 : 95～100
[22 ] 　Spangerberg G, et al . Protoplast culture and generation of transgenic plant in red fescue ( Festuca rubra L. ) . Plant Sci ,1994 , 97 : 83～94
[23 ] 　Asano Y, et al . Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporation2mediated direct gene transfer into protoplast . Plant Cell Rep ,1994 ,
13 : 243～246
[24 ] 　Mass H M , et al . Stable transformation and longterm expression of the gusA reporter gene in callus lines of Perennial ryegrass ( Lolium perenne
L. ) . Plant Mol Biol ,1994 , 24 : 401～405
[25 ] 　Spangerberg G, et al . Transgenic perennial ryegrass ( Lolium perenne) plants from microprojectile bombardment of embryogenic suspension cells.
Plant Sci ,1995 , 108 : 209～217
[26 ] 　Lee L. Turfgrass biotechnology. Plant Sci ,1996 , 115 : 1～8
[27 ] 　Vasil V , et al . Isolation and culture of cereal protoplasts. Theor Appl Genet , 1980 , 56 : 97～99
[28 ] 　Khayri A L , et al . Plant regeneration of zoysia grass from embryo2derived callus. Crop Sci , 1989 , 29 : 1324～1325
[29 ] 　Wilkinson J F , et al . Electrophretic identification of Agrostis palustris and Poa praterasis cultivars . Crop Sci , 1972 , 12 : 833～834
[30 ] 　Wehner J D , et al . Separation of Kentucky bluegrass cultivars using peroxidase isoenzyme binding patterns. Crop Sci , 1976 , 16 : 476～479
[31 ] 　Villami C B , et al . Isoelectric focusing of esterases for fine fescue identification. Crop Sci , 1982 , 22 : 786～793
[32 ] 　Caetano A , et al . DNA amplification fingerprinting using very short abbitrary oligonucleatide primers. Biotechnol , 1991 , 9 : 553～556
[33 ] 　Huff D R , et al . Determining genetic origins of aberrant progeny from facultative apomictric Kentucky bluegrass using a RAPD marker. Theor Appl
Genet , 1993 , 87 : 201～208
[34 ] 　Xu W W , et al . Phylogeny of tall fescue related species using RFLPs. Theor Appl Genet , 1994 , 88 : 685～690
[35 ] 　Caetano A , et al . DNA amplification fingerprinting analysis of bermudagrass ( Lynodon dactylon ) genetic relationships between species and
interspecific crosses. Theor Appl Genet ,1995 , 9 : 228～235
[36 ] 　Liu Z W , et al . Charaterization and analysis of simple sequence repeat (SSR) loci in seashore paspalum ( Paspalum vaginatum swartz . ) . Theor
Appl Genet ,1995 , 91 : 47～52
[37 ] 　刘振虎 , 李魁英 , 张爱峰. 草坪草需水抗旱研究概述. 中国草地 , 2001 , 23 (4) : 66～68
[38 ] 　Bayor B J . Turfgrass water stress : Drought resistance components , physiological mechanism and species2genotypes diversity. Pro. The Sixth Int
Turf Sci . Tokyo , Japan : 1989 , 23～28
[39 ] 　温明章 , 杜生明 , 陈越. 我国草坪科学的现状与发展. 生命科学 , 1999 , 11 (5) : 218～220
693 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (5) :394～396