全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032199204
混合重金属离子诱导的鲫鱼 DNA 损伤与
基因表达
朱国念1 　周新文2 　孙锦荷3
(11 浙江大学农药研究所 ,浙江 杭州　310029 ; 21 苏州大学核医学院 ,江苏 苏州　215007 ;
31 浙江大学核农所 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :本研究结果表明 ,混合重金属离子诱导了鲫鱼鱼鳃、肝脏组织产生脂质过氧化
作用 (LPO) ;鱼鳃、肝脏组织中的LPO 产物丙二醛 (MDA) 含量与暴露浓度呈指数效应
关系 ;鱼鳃、肝脏的指数方程分别为 Y = e - 2187X + 01687和 Y = e - 2119X + 01115 ;LPO 引发了 DNA
链的断裂损伤 ;3 H2TdR 在鱼鳃、肝脏细胞 DNA 中大量掺入 ,并与重金属离子暴露浓
度间呈双向效应 ;重金属离子的暴露极大地提高了鲫鱼肝脏 DNA 的总甲基化水平 ;
重金属离子的毒性作用干扰了鲫鱼细胞的正常生理周期和基因的表达 ,是引发水生
生物基因毒性作用的主要机制。
关键词 :重金属离子 ;鲫鱼 ;DNA ;损伤 ;表达
收稿日期 :2001211219
作者简介 :朱国念 (1957～) ,男 ,副教授 ,博士 ,主要从事环境毒理学研究。
在实际的自然环境中常存在低浓度的混合污染物 ,尤其是重金属离子 ,能长期存在于自然
水体中 ,又可通过富集作用大量积累于水生生物体内。研究表明污染物之间的确存在着相互
作用 ,使其在生物体内的吸收、积累改变 ,进而影响它们的毒性效应[1～3 ] 。同时 ,As、Cd、Pb、Ni
等重金属离子具有遗传毒性效应[4～5 ] ,因此 ,为进一步明确低浓度下混合重金属离子实际的基
因毒性效应和机制 ,在对京杭运河污染水平调查的基础上 ,选择 Zn、Pb、Cd、Cu 4 种主要污染离
子 ,研究了这 4 种混合重金属离子对鲫鱼细胞 DNA 链的损伤与基因表达的影响。
1 　材料与方法
111 　试剂与设备
提取缓冲液为 100mmol/ L Tris2HCl ( 012mlΠL 蔗糖 , 50mmolΠL EDTA , 100mmolΠL Tris2HCl
pH714) ;TE缓冲液为 10mmolΠL Tris2HCl (pH810) ,EDTA (pH810) ,高压灭菌后储存于 4 ℃冰箱中
备用 ;胞嘧啶和甲基化胞嘧啶标样 (色谱纯)均购自 Sigma 公司 ,CuCl2 、ZnSO4 、CdCl2 及 Pb (NO3 ) 2
均为分析纯 ,3 H2胸腺嘧啶核苷 (3 H2TdR)由中国科学院上海原子核所提供 (放射性浓度为 317 ×
107Bq/ ml ,放射化学纯度 > 95 %) 。仪器设备包括高速冷冻离心机 (Universal 32R) 、分光光度计
(Backman DU 530) 、高效液相色谱仪 (Waters 400 Hs 色谱数据工作站 VER315) 。
991　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :199～202Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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112 　供试鱼及暴露处理
鲫鱼 ( Carassius auratus)从近江水产公司购得 ,体重 20～25g。在暴过气的自来水中驯养 1
周后 ,供试验用。暴露水体的 pH 值为 6195～712 ,总硬度 (以 CaCO3 计) 440mg/ L ,水中溶解氧
(DO)为 619～715mg/ L。驯养和试验期内室温控制在 25 ±1 ℃,保持 12h 光照与 12h 黑暗。
将鲫鱼暴露于 0100、0118、0127、0154mgΠL 的混合重金属离子水体中 (浓度采用混合成分按
比例同时增加和减小的方法。按照 Cu、Zn、Pb、Cd 为 10∶5∶2∶1 比例混合 ,单位为 mgΠL) [7 ] ,每处
理 3 个重复 ,暴露 48h 后 ,处死其中一部分鱼 ,分别取肝脏、鱼鳃组织供脂质过氧化和 DNA 甲
基化分析 ;另外的鱼样每条注射 1111 ×105Bq 的3 H2TdR ,6h 后取肝脏、鱼鳃组织样分析 DNA 损
伤。
113 　分析
11311 　组织脂质过氧化分析 　采用 TBA 法[6 ] ,在 5ml 稀释 10 倍的组织提取液中加入 1ml 20 %
的三氯乙酸和 2ml 0167 % (w/ v) 巴比妥酸 ,在沸水浴中避光加热 10min ,然后以 3000rpm 离心
5min ,在 530nm 处读取吸光度值。鲫鱼组织 DNA 放射性样品制备及分析见参见文献[7 ] 。
11312 　DNA 甲基化分析 　鲫鱼肝脏 DNA 的提取方法参见文献[8 ] 。取 50μL DNA 样品 ,加 50μL
011M NaOH ,在 80 ℃下水浴中水解 2h ,然后用 011M KOH中和水解液。离心取上清液分析。
11313 　高效液相色谱分析[9 ,10 ] 　色谱柱为 Hypersil BDS 200 ×410mm ,流动相由 10 %甲醇、5mM
戊烷基磺酸钠 PICB5 及 012 %TEA 组成 ,流速为 016mlΠmin ,检测波长 273nm ,进样量 5μL。采用
外标法比较标准的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的峰面积计算样品含量。
2 　结果与分析
211 　混合重金属离子暴露浓度对鲫鱼脂质过氧化作用的影响
混合重金属离子的暴露浓度在 0100～0154mg/ L 范围内 ,鱼体组织中的 MDA 含量与暴露
浓度之间存在剂量效应关系。统计分析表明 ,鱼鳃、肝脏组织中的 MDA 含量和暴露浓度间均
呈指数曲线关系 (表 3) ,且鱼鳃的敏感性 ( EC50 = 0121mg/ L)高于肝脏 ( EC50 = 1142mgΠL) 。
表 1 　鲫鱼组织 MDA 含量与混合重金属暴露浓度回归统计结果
Table 1 　Results of statistic analysis to the MDA concentration in the fish ( Carassius aruatus)
tissues and the mixture2metals exposure concentration
组织 tissue 回归方程 equation 相关系数 coefficient F EC50 (mgΠL)
鱼鳃 gill Y = e - 2187X+ 01687 0187 6918 0121 (01125 - 01294)
肝脏 liver Y = e - 2119X+ 01115 0191 111 1142 (1113 - 1171)
　注 : Y:组织 MDA 含量 (nmolΠmin·mg 蛋白) ;X:混合重金属离子暴露浓度 (mgΠL) 。
Note : Y:tissue MDA(nmolΠmin·mg protein) ; X:mixture2metal exposure concentration (mgΠL) .
212 　混合重金属离子暴露浓度对鲫鱼组织细胞 DNA的损伤
不同浓度的混合重金属离子对鲫鱼鱼鳃、肝脏细胞DNA 的损伤结果 (表 2)表明 ,在鱼鳃和
肝脏组织中 ,混合重金属离子的毒性作用引发了鲫鱼组织细胞 DNA 的断裂 ,使标记的3 H2胸腺
嘧啶核苷在 DNA 的修复过程中大量掺入。随着混合重金属离子暴露浓度的增大 ,3 H2TdR 的
掺入呈双向效应 ,即在低浓度时 ,3 H2TdR 的掺入量明显高于对照 ,而高浓度时 ,3 H2TdR 的掺入
量逐渐降低。
002 核　农　学　报 17 卷
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表 2 　重金属暴露浓度对鲫鱼组织细胞 DNA
掺入3 H2TdR的影响
Table 2 　The effect of mixture2metals expo2
sure concentration on the incorporation
of 3 H2TdR in the Carassius auratus
tissue cellular DNA
组织 tissue
浓度 concentration (mgΠL)
0100 0118 0127 0154
鱼鳃 gill 61211 83616 72411 62413
肝脏 liver 68015 78512 70113 65418
　注 :4 个样品测定的平均值
Note :The data are the average of 4 determination
213 　不同的混合重金属离子暴露浓度对鲫鱼肝脏
DNA总甲基化水平的影响
混合重金属离子暴露浓度对鲫鱼肝脏 DNA 总
甲基化水平的影响见表 3。3 种浓度处理与对照相
比 ,甲基化水平都很高 ,但 0118mg/ L 与 0127mgΠL 的
处理间差异很小 ,这 2 组处理与 0154mg/ L 的处理间
稍有差异。总的趋势是随着混合重金属离子暴露浓
度的增加 ,鲫鱼肝脏 DNA 的总甲基化水平略有提
高。
重金属离子的胁迫导致鲫鱼组织的脂质过氧化
作用 ,产生的活性氧自由基不能被有效清除时 ,引发
了 DNA 链的断裂损伤。DNA 链的甲基化常常是细
胞阻止 DNA 链发生降解的一种方法 ,反过来其水平的增高也表明存在 DNA 链断裂。
表 3 　混合重金属离子暴露浓度对鲫鱼肝脏 DNA 甲基化水平的影响
Table 3 　Effects of the mixture2metal exposure concentration on the fish liver DNA methylation
浓度 concentration (mgΠL) 胞嘧啶 cytosine (nmol) 甲基化胞嘧啶 methylcytosine (nmol) 甲基化水平 methylation level ( %)
0100 0117442 01003165 1178
0118 0100408 01102335 96117
0127 0100341 01091841 96142
0154 0100306 0117513 98128
　　在正常的细胞发育周期中 (M0 期～M1 期) ,为保持遗传信息的完整性 ,在细胞的不同时
相 ,细胞都要对 DNA 的完整性进行检测 ,只有检测的结果表明 DNA 是完整的前提下细胞才会
进入下一个生理周期。重金属离子对鲫鱼细胞 DNA 链的损伤将干扰其正常的细胞生理周期。
DNA 链的损伤严重时会使细胞凋亡。
DNA 甲基化可以在转录水平上影响到基因的表达 (主要是转录的起始阶段) 。DNA 甲基
转移酶在增殖细胞核抗原 ( PCNA) 的参与下聚集在 DNA 复制叉处 ,催化“半甲基化”的子代
DNA 转变为“全甲基化”DNA。甲基化可能通过如下的途径抑制基因的表达[11 ] :5mC 的甲基影
响了蛋白质因子与 DNA 间的相互作用 ,DNA 的大沟是众多蛋白质因子与 DNA 的结合部位 ,
5mC的甲基也恰好处于此沟内 ,从而阻碍了蛋白质因子与 DNA 的相互作用 ;其次 ,DNA 的甲基
化导致染色质结构的改变 ,在甲基化结合蛋白 (MeCPs) 的参与下 ,组蛋白乙酸化水平降低 ,组
蛋白所带电荷发生变化 ,使 DNA 骨架结合状态随之变化 ,进而影响了染色质的结构 ,而抑制基
因表达。
实验结果表明 ,肝脏细胞的 DNA 的总甲基化水平是非常低的 ,一旦暴露于含重金属离子
的水体中 ,甲基化水平就大大提高。其甲基化水平的改变给水生生物鲫鱼带来的后果是非常
严重的。它可通过抑癌基因的抑制使水生生物致癌[9 ] 。
3 　结论
1. 混合重金属离子的暴露使得鲫鱼组织产生脂质过氧化作用 (LPO) ,鱼鳃、肝脏组织中的
102　3 期 混合重金属离子诱导的鲫鱼 DNA 损伤与基因表达
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LPO 产物丙二醛 (MDA)与暴露浓度呈指数效应关系 ;LPO 诱导了鲫鱼鱼鳃、肝脏组织细胞 DNA
链断裂损伤 ,可极大地提高鲫鱼肝脏细胞 DNA 的甲基化水平。
2. 混合重金属离子的暴露引发了鲫鱼组织的脂质过氧化作用 ,产生的自由基使 DNA 链断
裂 ,进一步使 DNA 甲基化水平提高 ,这些毒性效应干扰了鲫鱼细胞的正常生理周期和基因表
达 ,是重金属离子基因毒性作用的主要机制。
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DNA DAMAGE AND ITS GENE EXPRESSION OF FISH INDUCED BY MIXTURE2METALS
ZHU Guo2nian1 　ZHOU Xin2wen2 　SUN Jin2he3
(1. Institute of Pesticide Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310029
2. College of Irradiation Medical Sciences , Suzhou University , Suzhou ,Jiangsu prov. 　215007
3. Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310029)
Abstract :DNA damage and its gene expression in fish( Carassius auratus ) after exposed in mix2
ture2metals of 0100～0154mgΠL were studied. The results demonstrated that the lipid superoxide
was induced in the fish gill and liver tissues. The exponential relation was found between the MDA
( LPO product) content and exposure concentration. The equations for the gill and liver were Y =
e
- 2187X+ 01687
and Y = e - 2119X+ 01115 respectively. LPO caused the breakage of DNA strand and 3 H2TdR
incorporation increased greatly in the gill and liver DNA. A double effect was shown between the
3 H2TdR incorporation and exposure concentration. The mixture2metals also improved signif icantly
the methylation level in the liver DAN. The toxicity of the mixture2metals disturbed the normal
physiological circle and inhibited the gene expression of the fish cell , which was the main genotox2
icity mechanism to the aquatic organism.
Key words :heavy metals; Carassius auratus ; DNA damage and expression
202 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :199～202
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