全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032207205
辐照西洋参培养物皂苷次生代谢调控的研究
张美萍　王　义　孙春玉　李向高
(吉林农业大学　吉林长春　130118)
摘 　要 :研究了不同前体、前体浓度、前体加入时期、前体作用时间、ATP 浓度、烟酸浓
度对西洋参芽胞愈伤组织生长及皂苷合成的影响。结果表明 :011 %甲羟戊酸对生长
有抑制作用 ,对皂苷合成有明显的促进作用 ;100mgΠL 亮氨酸对生长无明显影响 ,对
皂苷合成有促进作用 ;444mgΠL 的醋酸镁对培养物生长和皂苷合成都有促进作用 ;在
继代开始时加入前体皂苷含量最高 ;甲羟戊酸作用 6h 皂苷产量最高 ;160mgΠL ATP 对
生长和皂苷合成均有促进作用 ;110mgΠL 烟酸利于培养物生长和皂苷合成 ;用60 Coγ
射线辐照培养物 ,剂量为 4000Gy 时得到皂苷含量高于原愈伤组织 1 倍的细胞系。
关键词 :西洋参 ;愈伤组织培养 ;皂苷 ;次生代谢调控
收稿日期 :2003203203
基金项目 :国家科技部科技型企业技术创新基金资助项目 (00C26N2210138)
作者简介 :张美萍 (1964～) ,女 ,农学博士 ,副教授 ,从事药用植物细胞工程研究。
对于那些代谢途径已弄清的次生代谢物 ,在培养基中补加适当的前体物质[1 ] 、中间代谢物
或旁路抑制剂[2 ] ,对目的次生代谢产物产量的提高是有效的 ,可较大地提高次生代谢物的产
量。然而 ,补加直接前体对终产物的增加并不一定起作用 ,寻找最有效的前体并不简单 ,而且
前体的加入方式对获得满意的结果是很关键的 ,特别是对于那些具有毒性和不稳定性的化合
物。西洋参皂苷合成途径不十分清楚 ,本实验试图通过饲喂前体、辅酶、ATP 并结合辐照处理
来提高西洋参皂苷产量 ,间接证明皂苷的合成途径 ,为定向化生产单体皂苷提供依据。
1 　材料和方法
采用本实验室筛选的西洋参芽胞愈伤组织无性系作为实验材料。西洋参芽胞愈伤组织悬
浮培养物添加不同前体、ATP 和烟酸 ,测定培养物生长量和皂苷含量。
60 Coγ辐照在长春高新辐射中心进行 ,愈伤组织继代培养 10d 后进行 ,辐照剂量分别为 0
(CK) 、1000、2000、3000、4000Gy ,剂量率为 90Gy/ min。辐照后继续培养 15d ,测定生长量和皂苷
含量 ;辐照处理后继代 5 次 ,用 HPLC 测定皂苷含量。以鲜重及干重 (g/ 瓶) 作生长指标测定细
胞生长量 ,具体方法见文献[3 ] 。培养物中皂苷含量测定方法如下 :将培养物于 60 ℃烘干 ,研
碎 ,精称 1g ,用甲醇回流提取 ,具体方法见文献[4 ] 。紫外分光光度分析 (DU27500) 方法见文
献[3 ] 。高效液相色谱柱选用 Zobarx C8 柱 ,流动相采用乙腈和水梯度洗脱 ,流速 115mlΠmin ,柱温
702　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :207～211Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
33 ℃,检测波长 203nm ,具体方法见文献[4 ] 。
2 　结果与分析
211 　前体对培养物生长和皂苷的含量影响
21111 　前体的加入 　本实验选择了 4 种间接前体 :醋酸镁、L2亮氨酸、甲羟戊酸和辅酶 A ,它们
对培养物的生长和皂苷含量的影响见表 1。从表 1 看出 ,除甲羟戊酸外 ,加入的前体物对生长
都有促进作用。加入甲羧戊酸对皂苷合成有明显促进作用 ,是对照的 2 倍左右 ,醋酸镁的促进
作用次之 ,推测西洋参皂苷合成途径可能与人参皂苷合成途径一样 ,走醋酸 →甲羟戊酸 →三十
六碳六烯 →人参皂苷的合成途径。
表 1 　不同前体对培养物生长和皂苷合成的影响
Table 1 　Effects of different precursors on callus growth and saponin formation
前体
precursor
鲜重增加
increase of FW(gΠflask) 干重增加increase of DW(gΠflask) 皂苷含量saponin content ( %) 皂苷产量saponin yield (gΠL)
L2亮氨酸　L2leucine 5. 46 0. 344 5. 06 1. 996
醋酸镁　Mg(Ac) 2 6. 89 0. 462 5. 76 2. 970
辅酶 A 　Coenzyme A 8. 12 0. 492 3. 25 1. 757
甲羟戊酸　meralonic acid 1. 92 0. 115 6. 14 1. 000
CK 5. 38 0. 35 3. 04 1. 222
21112 　不同浓度的前体对培养物生长和皂苷合成的影响 　为了寻找前体饲喂的最佳浓度 ,对
醋酸镁作了不同浓度的筛选 ,结果见图 1。图 1 结果表明 ,当 Mg (Ac) 2 浓度在 444mgΠL 时 ,鲜
重、干重增加量最高 ,皂苷含量也最高 ,因此在西洋参芽胞愈伤组织悬浮培养时 ,可用 Mg(Ac) 2
代替 MgSO4 。
21113 　不同生长时期加入前体对培养物皂苷含量的影响 　因加入时期不同 ,前体对培养物生
长和次生代谢物合成的影响不同 ,结果见表 2。由表 2 看到 ,Mg (Ac) 2 开始加入时皂苷含量最
高 ,随着生长时期的延长 ,加入 Mg(Ac) 2 不利于皂苷合成。
表 2 　不同生长期加入前体对皂苷合成的影响
Table 2 　Effect of adding precursor in different growth phase on saponin formation ( %)
前体 precursor
时间 time (d)
0 5 10 15 20
Mg(Ac) 2 5. 76 5. 25 4. 03 3. 14 2. 96
CK 3. 04 — — — —
　　注 :加入 Mg(Ac) 2 浓度为 444mgΠL ,培养 30d ;
　　Note :Mg(Ac) 2 444mgΠL ,30day of culture.
21114 　前体作用时间对培养物生长和皂苷含量的影响 　加入甲羟戊酸利于西洋参皂苷合成 ,
但是甲羟戊酸对培养物有明显的毒害作用 ,如果培养物和甲羟戊酸长时间接触 ,培养物受毒害
而死 ,因此本实验为了寻找甲羟戊酸与培养物接触的最佳时间 ,选择了培养物与甲羟戊酸相互
作用 3、6、9、12、24h ,结果见表 3。表 3 表明 ,随着甲羧戊酸作用时间延长 ,培养物鲜重和干重增
802 核　农　学　报 17 卷
加量逐渐减少 ,而随甲羧戊酸作用时间延长 ,皂苷含量呈上升趋势 ,但最后基本稳定在 5 %左
右 ,从皂苷产量上看 ,最佳作用时间为 6h ,此时皂苷产量最高 ,为 11137gΠL ,是对照的 1134 倍左
右。
表 3 　甲羟戊酸作用时间对培养物生长和皂苷含量的影响
Table 3 　Effects of meralonic acid reaction time in medium on callus growth and saponin content
甲羟戊酸作用时间
meralonic acid reaction
time (h)
鲜重增加量
increase of FW(gΠflask) 干重增加量increase of DW(gΠflask) 皂苷含量saponin content ( %) 皂苷产量saponin yield (gΠL)
3 3. 87 0. 217 3. 12 0. 817
6 3. 12 0. 172 5. 26 1. 137
9 2. 06 0. 125 5. 57 0. 954
12 1. 05 0. 0620 6. 04 0. 660
24 0. 68 0. 040 5. 92 0. 515
ck 4. 02 0. 237 2. 98 0. 847
　　注 :甲羧戊酸浓度为 011 %。
Note :The concentration of meralonic acid is 011 %.
212 　ATP对培养物生长和皂苷合成的影响
为探讨 ATP 对皂苷合成的影响 ,设置了不同浓度 ATP 对培养物生长和皂苷合成影响的实
验 ,结果见图 2。由图 2 看出 ,当 ATP 浓度为 160mgΠL 时 ,鲜重增加量和干重增加量最高 ,皂苷
含量也最高 ,为 51556 % ,可见 ,一定浓度的 ATP 不仅促进细胞生长 ,而且还促进皂苷合成 ,说
明在西洋参皂苷合成中需要 ATP 分子的参与。
图 1 　不同浓度的醋酸镁对培养物生长
和皂苷合成的影响
Fig. 1 　Effects of different Mg(Ac) 2
concentration on callus growth and
saponin formation
图 2 　不同浓度的 ATP对培养物生长
和皂苷合成的影响
Fig. 2 　Effects of different ATP concentration
on callus growth and saponin formation
213 　烟酸对培养物生长和皂苷合成的影响
烟酸是 NADPH的组成成分 ,如果皂苷合成途径需要 NADPH参与 ,添加烟酸也许会对细胞
生长和皂苷合成有影响 ,结果见图 3。
902　3 期 辐照西洋参培养物皂苷次生代谢调控的研究
图 3 表明 ,当烟酸浓度在 110mgΠL 时 ,干、鲜重增加量、皂苷含量、皂苷产量都高于其它浓
度 ,说明烟酸参与皂苷合成代谢 ,并有促进作用。另外 MS 基本培养基中烟酸浓度为 015mgΠL ,
本实验体系应将烟酸浓度提高到 110mgΠL。
214 　60 Coγ辐照对培养物生长和皂苷合成的影响
60 Coγ辐照与前体醋酸镁相结合 ,观察培养物生长和皂苷合成情况 ,结果见表 4。
表 4 　不同60 Coγ辐照对培养物生长和皂苷合成的影响
Table 4 　Effects of 60 Coγ2rays on callus growth and saponin formation
剂量
dose ( Gy)
鲜重增加
increase of FW
(gΠfiask) 干重增加increase of DW(gΠfiask) 皂苷含量saponin content( %) 皂苷产量saponin yield(gΠL)
　0 6. 88 0. 464 5. 77 2. 980
1000 2. 74 0. 432 5. 21 1. 788
2000 2. 51 0. 386 5. 70 1. 964
3000 2. 49 0. 344 4. 76 1. 368
4000 0. 372 0. 182 10. 40 10. 386
从表 4 看出 ,随辐照剂量增加 ,培养物细胞生长受阻 ,但在 4000Gy 时 ,皂苷含量是对照的 1
倍左右。将此剂量下的愈伤组织经过 5 次继代 ,细胞生长明显提高 ,高效液相色谱法测总皂苷
含量为 10140 % ,单体皂苷 Rg1 0136 % ,Re 0172 % , Rb1 2186 % , Rc 019 % ,Rb2 0130 % ,Rd 0182 %
(图 4) 。
图 3 　不同浓度的烟酸对培养物生长
和皂苷合成的影响
Fig. 3 　Effects of different nicotinic
acid concentration on callus growth
and saponin formation
图 4 　培养物中皂苷的高效液相色谱分析
Fig. 4 　HPLC determination standard
(A) and extract (B) of saponin
in callus
3 　讨论
11 饲喂前体可以促进次生代谢产物的合成 ,从而提高次生代谢物的含量 ,但在饲喂前体
012 核　农　学　报 17 卷
时要注意前体的浓度和饲喂前体的时间和前体的作用时间。
21 应用60 Coγ辐照处理已在不少培养细胞中获得所需性状的突变体 ,成为植物细胞工程
中高产细胞系筛选的重要手段[5 ] 。对西洋参培养物进行辐照处理尚未见报道。本实验应用前
体和辐照处理相结合 ,初步筛选到 1 个无性系 ,在 4000Gy 下虽然生长缓慢 ,但皂苷合成能力有
大幅度提高 ,皂苷产量远远高于对照 ,表明该剂量下的60 Coγ辐照可以获得西洋参高产细胞
系。关于有效诱变下的细胞学、细胞组织化学 ,代谢调节还有待深入研究 ,以期阐明辐照下的
细胞分化状态和皂苷合成途径的调节 ,以达到进一步提高西洋参愈伤组织培养物产量、稳定生
产能力的目的 ,为大规模培养生产有效成分提供理论依据和技术支持。
参考文献 :
[ 1 ] 　Khodakovskaya M V ,et al . The effect of some metabolites of isoprenoid pathway on the biomass accumulation and content of ginsen2
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[4 ] 　中华人民共和国药典. 2000 年版. 附录 38～40
[5 ] 　赵德修 ,汪沂 ,赵敬芳. 不同理化因子对雪莲培养细胞中黄酮类形成的影响. 生物工程学报 ,1998 ,14 (3) :259
STUDY ON THE SECONDARY METABOLIC REGULATION OF CALLUS OF
Panax quinquefolium L.
ZHANG Mei2ping 　WANG Yi 　SUN Chun2yu 　LI Xiang2gao
( Jilin Agricultural University , Changchun , Jilin prov. 　130118)
Abstract :The effects of precursors with different kind , concentration , growth phase , time and
different ATP , nicotinic acid concentration on the callus growth and saponin formation with the
buds of Panax quinquefolium L. has been studied. The results showed that 011 % meralonic acid
inhibited the callus growth but promoted the saponin formation ; L2leucine of 100mgΠL had no ob2
vious effects on callus growth , but promoted the saponin formation ; Mg( Ac) 2 of 444mgΠL pro2
moted both the callus growth and saponin content. The optimum time for precursor feeding is at
the beginning of regeneration. The optimum time for meralonic acid is 6h; ATP of 160mgΠL pro2
moted both the callus growth and saponin formation. Nicotinic acid of 110mgΠL promoted callus
growth and saponin formation. With 4000 Gy of 60 Coγ2rays , the saponin content has been in2
creased 1 time compared with nonirradiation.
Key words : Panax quinquefolium L ; callus suspension culture ; saponin ; secondary metabolic
regulation
112Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :207～211