全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062436205
中华结缕草成熟胚再生影响因素研究
钱永强1 　孙振元1 　韦善君3 　李　云2 　韩　蕾1
(11 中国林业科学研究院林业研究所/ 国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091 ;
21 北京林业大学生物科学与技术学院Π教育部林木花卉遗传育种重点实验室 ,北京　100083 ;
31 华中科技大学生科院 ,湖北 武汉　430074)
摘 　要 :以中华结缕草 (Zoysia sinica Hance) 成熟胚为外植体 ,研究了培养基、水解酪蛋白 (CH) 、
水解乳蛋白 (LH) 、植物生长调节剂等对愈伤组织诱导及其生长的影响 ,以及不同继代周期对
愈伤组织分化及植株再生的影响。结果表明 :2 ,42D 是影响愈伤组织诱导的关键因素 ;MS 无
机成分及有机成分含量对愈伤组织生长影响不显著 ,附加 CH 500mgΠL 利于愈伤组织生长 ;继
代培养次数直接影响胚性愈伤组织的诱导及植株再生 ;不经继代培养转入分化培养基的愈伤
组织植株再生率最高达 3412 % ,随继代次数的增加 ,再生率明显下降 ,继代培养 3 次的愈伤组
织再生率低于 10 %。
关键词 :中华结缕草 ;成熟胚 ;培养周期 ;植株再生
FACTORS INFLUENCING MATURE EMBRYO REGENERATION OF Zoysia sinica HANCE
QIAN Yong2qiang1 　SUN Zhen2yuan1 　WEI Shan2jun3 　LI Yun2 　HAN Lei1
(11 Research Institute of Forestry , Chinese Academy of Forestry/ Key Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing , 100091 ;
21 Key Lab for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants , MOEΠCollege of Biological Science and Biotechnology , Beijing Forestry
University , Beijing , 100083 ;31Department of Life Science , Huazhong University of Science & Technology , Wuhan , Hubei , 430074)
Abstract :The main factors influencing the callus induction , subculture and plant regeneration from mature embryo
of Zoysia sinica Hance were studied. The results showed that the concentration of 2 , 42D ( 2 , 42
Dichlorophenoxyacetic acid) influenced the quality as well as induction rate of calli . The addition of 500mgΠL CH
(Casein acids Hydrolysate) in subculture could remarkably improve the quality of calli . The plant regeneration was
correlative with subculture cycles. The regeneration ability droped down with the increase of subculture cycles. The
regeneration rate of the calli which was not cultured in subculture medium reached 3412 %. And there were only
less than 10 % of the calli subcultured for 3 cycles could regenerate plants.
Key words : Zoysia sinica Hance ; mature embryo ; subculture cycles ; plant regeneration
收稿日期 :2005207211
基金项目 :国家“863”计划 :优质抗逆草坪草早熟禾等新品种选育 (2002AA241061)
作者简介 :钱永强(1979 - ) 男 , 山东日照人 ,在读博士生 ,从事园林植物育种方面的研究。孙振元为通讯作者 ,Email :sunzy @caf . ac. cn
中华结缕草 ( Zoysia sinica Hance)为禾本科画眉草亚科结缕草属多年生低矮草坪草 ,具有耐旱、耐盐
与耐贫瘠土壤及耐践踏等特性 ,常用作水土保持地表植被覆盖 ,也是滨海城市及庭院草地绿化的理想植
物 ,在我国有大面积种植[1 ] 。中华结缕草具有典型 C4 植物叶部解剖构造[2 ] ,但较短的绿色期影响了作
为暖季型草坪草的观赏和实用价值。现代生物技术如突变体筛选及遗传转化技术在结缕草属植物组培
再生及遗传转化的研究中应用已有不少报道[3～7 ] ,如在植物生长调节物质种类、浓度配比和微量物质等
对愈伤组织诱导、继代及再生的影响方面的研究 ,但未见有中华结缕草的相关报道。本文以中华结缕草
634　 核 农 学 报　2005 ,19 (6) :436～440Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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成熟胚为外植体 ,研究了培养基营养物质及愈伤组织培养周期对再生植株的影响 ,初步确定了影响再生
的关键因素 ,为完善中华结缕草再生体系 ,进而开展遗传转化研究提供基础条件。
1 　材料与方法
111 　试验材料　山东青岛产中华结缕草 ( Zoysia sinica Hance)成熟种子。将种子解除休眠[9]后用作外植体。
112 　试验方法
11211 　影响愈伤组织诱导的因素　以改良 MS(1Π2MS无机物 + 3Π2MS有机物 ,其它不变) 为基本培养基 ,对 2 ,
42D(015、210、315 和 510mgΠL) 、NAA (0、015、110 和 210mgΠL) 、IAA (0、015、110 和 210mgΠL) 、肌醇 (100、200、300
和 400 mgΠL)及蔗糖 (1 %、3 %、5 %和 7 %) (WΠV) 不同浓度配比进行诱导筛选 ,采用 L (45 ) 设计 ,共 16 个处
理。将经解除休眠处理的种子于无菌条件下表面灭菌后 ,垂直于胚横切伤至胚后接种到上述培养基中。
每皿接种外植体 30 个 ,于 24 ℃～26 ℃暗培养 40d 左右 ,观察愈伤组织的诱导情况。每处理重复2 次。
11212 　不同营养成分对愈伤组织生长质量的影响　取在上述改良MS + 2 ,42D 210mgΠL 的培养基中诱导
出的愈伤组织 ,转接到添加 2 ,42D 215 mgΠL 及 KT(激动素) 011 mgΠL 不同继代培养基中。MS 基本培养
基为参照 ,对 MS 大量元素 (1MS、3Π4MS、1Π2MS、1Π4MS) 、MS 有机成分 (1MS、5Π4MS、3Π2MS、2MS) 、CH(水解
酪蛋白) (0、500、1000、2000 mgΠL) 、LH(水解乳蛋白) (0、100、200、400 mgΠL)及α- 酮戊二酸 (0、50、100、200
mgΠL)进行筛选。试验采用L (45 ) 设计 ,共 16 个处理。转接前称量每皿所放愈伤组织的质量 ,记为初
重。每皿放愈伤组织 10 块 ,每个处理重复 3 次。暗培养 20 d 后调查愈伤组织生长情况 ,并称量末重 ,获
得该培养周期愈伤组织增重率 ,结合愈伤结构特征筛选影响愈伤组织生长的主要因素及其用量。
11213 　2 ,42D 与细胞分裂素对愈伤组织分化及植株再生的影响　将经继代培养筛选的愈伤组织转接到
相同培养基 (1Π2MS无机物 + 3Π2MS有机物 + 铁盐 + 微量 + CH 500mgΠL +α2酮戊二酸 100mgΠL + 2 ,42D 215mgΠL
+ KT011mgΠL + 蔗糖 30 gΠL + 琼脂 515 gΠL)中 ,培养 10 d 后 ,接入以MS 为基本培养基 ,含 KT 011mgΠL 和
2 ,42D 不同浓度 (0、011、012、013 和 014mgΠL)分化培养基中 ,培养 30d ,调查愈伤组织分化情况。
11214 　继代次数及植物生长调节物质对愈伤组织植株再生的影响　利用上述试验所筛选出的最佳诱
导培养基诱导获得约 500 块愈伤组织 ,根据继代次数 ,分 4 次接种到以 MS 为基本培养基 ,含 KT 011mgΠ
L、BA 011mgΠL 和 ZT 011mgΠL 的 3 种分化培养基中。每 3 周继代 1 次 ,继代培养次数记为 1、2、3 次共 3
个处理 ,不经继代培养的记为 0 次处理。每次转入分化培养时 ,每种分化培养基接种 3 皿 ,每皿接愈伤
组织 10 块。见光培养 30d 调查植株再生情况。
2 　结果与分析
211 　不同激素、肌醇及庶糖对愈伤组织诱导的影响
诱导培养基中暗培养 1 周后 ,在少数胚切口处形成愈伤组织 ,随培养时间的延长 ,愈伤组织大量形
成 ,3～4 周达诱导高峰期。继续培养至 40d ,调查愈伤组织诱导率 ,结果见表 1。
由表 1 极差分析结果可看出 ,不同 2 ,42D 浓度下愈伤组织平均诱导率极差达 2912 ,明显高于其他因
素 ,是愈伤组织诱导培养阶段的最主要影响因子。在 2 ,42D 015～315mgΠL 浓度范围内 ,随浓度的增加诱
导率明显提高 ,2 ,42D 浓度为 315mgΠL 时愈伤组织平均诱导率为 3912 % ;当浓度增至 5mgΠL 时 ,愈伤组织
诱导率下降 ,平均为 3416 % ;方差分析及多重比较表明 ,在 2 ,42D 2～5mgΠL 浓度范围内 ,对愈伤组织诱
导无显著差别 ,但结合愈伤组织的生长质量 ,以 2～315mgΠL 为佳。NAA、IAA、肌醇及蔗糖等因素对愈伤
组织诱导影响较小 ,浓度间极差最高仅为 712 ,方差分析表明 ,各因素之间及各因素浓度间均无显著差
异。由于高浓度的 2 ,42D 能抑制愈伤组织后期分化能力 ,因此试验选用 MS(1Π2MS无机物 + 3Π2MS有机物 ,其
它不变) + 2 ,42D 2mgΠL 为愈伤组织适宜诱导培养基。
212 　培养基营养成分对愈伤组织继代影响
将相同培养条件 (改良MS + 2 ,42D 210mgΠL)诱导出的生长质量基本一致的愈伤组织 ,接种到不同营
养成分的培养基中 ,培养基中均添加 2 ,42D 215mgΠL。培养 3 周后 ,各培养基中愈伤组织均有明显的生
长 (见表 2) ,多数愈伤组织呈白色 ,且有稀疏不规则突起。
734　6 期 中华结缕草成熟胚再生影响因素研究
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表 1 　不同处理对愈伤组织诱导率影响
Table 1 　Effect of different treatments on callus induction rate
处理
treatments
2 ,42D
(mgΠL) NAA(mgΠL) IAA(mgΠL) 肌醇inositol (mgΠL) 蔗糖sucrose (gΠL) 愈伤组织诱导率rate of callus induction ( %)
Ⅰ Ⅱ
平均诱导率
mean of callus
induction rate ( %)
1 015 0 0 100 10 010 617 313
2 015 015 015 200 30 1010 1010 10
3 015 1 1 300 50 617 1617 1117
4 015 2 2 400 70 1313 1617 1510
5 2 0 015 300 70 3313 2313 2813
6 2 015 0 400 50 3617 3617 3617
7 2 1 2 100 30 4313 4010 4117
8 2 2 1 200 10 3010 4010 3510
9 315 0 1 400 30 4617 3010 3813
10 315 015 2 300 10 4010 3313 3617
11 315 1 0 200 70 4313 4010 4117
12 315 2 015 100 50 4313 3617 4010
13 5 0 2 200 50 3313 3313 3313
14 5 015 1 100 70 3010 3617 3313
15 5 1 015 400 10 3617 3617 3617
16 5 2 0 300 30 2617 4313 3510
X1 1010B 2518 2719 2916 2719
X2 3515A 2912 2818 30 3113
X3 3912A 3310 2916 2719 3014
X4 3416A 3113 3117 3117 2916
极差 R 2912A 712B 318B 318B 215B
注 :小写及大写字母表示不同处理分别在 0105 及 0101 水平上差异显著 ; X1、X2、X3、X4 分别表示各因素不同浓度条件下愈伤组织平均诱
导率。下表同。
Note : small letters and capital letters mean significant difference at 0105 and 0101 level , respectively ;X1 ,X2 ,X3 and X4 mean the callus induction rate at
different concentrations of various factors. The same are as following tables.
表 2 　培养基营养成分对愈伤组织生长量的影响
Table 2 　Effect of the different media on callus subculture
处理
treatments
MS(无机)
MS(mineral)
MS(有机)
MS(organism)
CH
(gΠL) LH(gΠL) α2酮戊二酸 (mgΠL)α2ketoglutaric acid 增重率increment rate ( %)
1 1 1 0 0 0 10219
2 1 5Π4 015 011 50 6115
3 1 3Π2 1 012 100 5319
4 1 2 2 014 200 2216
5 3Π4 1 015 2 200 8212
6 3Π4 5Π4 0 3 100 6019
7 3Π4 3Π2 2 0 0 8012
8 3Π4 2 1 1 50 9413
9 1Π2 1 1 3 50 7712
10 1Π2 5Π4 2 2 0 4616
11 1Π2 3Π2 0 1 200 4417
12 1Π2 2 015 0 100 18019
13 1Π4 1 2 1 100 3916
14 1Π4 5Π4 1 0 200 6419
15 1Π4 3Π2 015 3 0 6816
16 1Π4 2 0 2 50 6519
X1 6012 7515 6816 10713 7811
X2 7914 5815 9813 6010 7112
X3 8714 9418 7216 6212 8319
X4 5918 9110 4713 5713 5316
极差 R 2716 3613 5110 5010 3013
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　　极差分析可得出 ,水解酪蛋白对愈伤组织生长速度影响最大 ,其次为 MS 有机物质用量 ,而 MS 无机
成分影响最小。方差分析表明各因素间及各因素浓度间差异未达显著水平 ,但以 1Π2MS 无机、3Π2MS 有
机、CH 500 mgΠL、α2酮戊二酸 100 mgΠL 组合最利于愈伤组织生长。调查过程还发现 ,在同一培养基中偶
有呈白色、极疏松的糊状愈伤组织 ,其生长迅速为其它正常愈伤组织生长速度的 3～5 倍 ,显微观察发
现 ,其细胞内有异常大液泡 ,内容物稀薄 ,植株再生诱导试验证明这类愈伤组织很容易褐化 ,几乎无植株
再生能力。这说明愈伤组织的生长质量受多种因素影响 ,而与生长速度无直接关系 ,甚至当愈伤组织生
长速度过快时 ,再生能力受到抑制。由此可初步确定 ,愈伤组织继代培养阶段适宜的培养基为改良 MS
(1Π2MS无机物 + 3Π2MS有机物 ,其它不变) + 2 ,42D 215mgΠL + CH 500mgΠL +α2酮戊二酸 100mgΠL。
213 　植物生长调节物质对愈伤组织分化及植株再生的影响
图 1 　2 ,42D 对愈伤组织褐化及植株再生的影响
Fig. 1 　Effect of the concentraion of 2 ,42D on
callus browning and plant regeneration
接入分化培养基中的愈伤组织培养至 2 周
后 ,愈伤组织开始出现褐化 ,并有个别愈伤组织出
现根状突起。继续培养 15d ,调查愈伤组织分化
情况。由图 1 可看出 ,以不加 2 ,42D 的处理 ,愈伤
组织植株再生率最高 ,为 2114 % ,随 2 ,42D 浓度的
增加 ,植株再生率及愈伤组织褐化率逐渐下降。
调查中还发现 ,随 2 ,42D 浓度的增加 ,愈伤组织不
再分化或只进行非胚性愈伤组织无序增殖。这说
明 2 , 42D 对胚性愈伤组织的形成有一定抑制
作用。
214 　继代次数对愈伤组织分化与植株再生的影响
利用前述试验筛选出的诱导、继代培养基 ,诱
导一批愈伤组织 ,按不同的继代次数 ,分别接种到
不同分化培养基中 ,培养 30d ,调查愈伤组织分化情况 ,见表 3。
表 3 　继代次数及激素对愈伤组织分化影响
Table 3 　Effect of subculture cycles and plant regulators on the regeneration
愈伤组织继代次数
times of callus subculture
分化培养基 medium for regeneration
MS MS + KT011 MS + BA011 MS + ZT011
再生率 regeneration rate ( %) 2811 2313 3412 2414
0 褐化率 callus browning rate ( %) 4014 3915 4211 3411
发根愈伤 callus rooting rate ( %) 2613 2719 3412 2413
再生率 regeneration rate ( %) 2916 1815 2313 1815
1 褐化率 callus browning rate ( %) 1111 4017 4414 5516
发根愈伤 callus rooting rate ( %) 4414 2212 1815 1418
再生率 regeneration rate ( %) 1617 2010 1111 1010
2 褐化率 callus browning rate ( %) 4313 5010 4617 6617
发根愈伤 callus rooting rate ( %) 4010 3010 3010 2313
再生率 regeneration rate ( %) 313 617 1010 010
3 褐化率 callus browning rate ( %) 6617 7010 7617 8313
发根愈伤 callus rooting rate ( %) 1617 1313 1010 1010
　　由表 3 可看出 ,不经继代培养的愈伤组织转入分化培养时 ,植株再生率最高为 3412 % ,随继代次数
的增加 ,再生率呈下降趋势 ,而愈伤褐化率呈明显上升趋势。进一步方差分析结果表明 ,继代次数对愈
伤组织再生率影响达显著水平。不同植物生长调节剂对愈伤组织分化及植株再生也有明显影响 ,以附
加 BA 011mgΠL 对植株再生最有利 ,与其它处理间差异也达显著水平。
3 　讨论
近年来 ,国内外学者对结缕草 ,特别是日本结缕草胚性愈伤组织形成及植株再生的影响因素进行了
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深入研究[3～7 ,8～10 ] 。结缕草属植物诱导愈伤组织时 ,2 ,42D 浓度一般为 1～5mgΠL ,通常为 2mgΠL[12 ] 。本实
验结果也证实了这一点 ,在 015～5mgΠL 浓度范围内 ,均可诱导出愈伤组织 ,以 2～315mgΠL 用量最佳。
NAA 及 IAA 用量为 015～2mgΠL 对愈伤组织诱导作用不明显 ,但极差分析结果可看出其作用要稍好于肌
醇与蔗糖 ,说明植物生长调节物质在中华结缕草成熟胚愈伤组织诱导过程起关键作用。
一般认为 ,初诱导产生的胚性愈伤组织或经过短期培养的胚性愈伤组织较易诱导产生体细胞胚 ,但
随着培养时间的延长和继代次数的增多 ,体细胞胚发生能力会降低。水稻一般继代 3 个月以上再生能
力丧失 ,即使有分化能力 ,也只能分化出芽点或绿点 ,不能成苗[13 ,14 ] 。本实验表明 ,当结缕草愈伤组织不
经继代培养 ,直接转入分化培养 ,再生率高达 3412 % ,而继代培养 3 次后 ,再生能力明显降低。
植物生长调节剂对胚性愈伤组织诱导及植株再生有重要作用。分化培养基添加低浓度细胞分裂素
类物质利于胚性愈伤组织的诱导及其植株再生[15 ] 。本试验表明 ,当培养基中 KT浓度在 011mgΠL ,2 ,42D
浓度在 0～014mgΠL 范围内 ,随浓度增加 ,愈伤组织再生能力下降 ,且根发生途径愈伤组织明显增加 ,说
明在分化培养过程中 ,添加 2 ,42D 不利于愈伤组织的再分化。去除 2 ,42D ,在分化培养基中分别添加
011mgΠL 的 KT或BA 或 ZT ,发现在添加BA 011mgΠL 的分化培养基中 ,植株再生率最高。而 62BA 的活性
比 KT活性高[15 ] ,ZT活性要高于 62BA ,由此可推测 ,植株再生率与细胞分裂素的调控强度有关 ,过低或
过高均不利于再生培养。
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更正声明
　　由于工作人员的疏忽 ,我刊 2005 年第 5 期第 375 页 ,孙桂莲 ,等“水稻对14 CO2 -3 的吸收和积累动态”
的作者简介有误 ,原“山西禹城人”应为“山东禹城人”;“史建军”应为“史建君”。在此特向作者和广大读
者深表歉意 !
《核农学报》编辑部
044 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (6) :436～440
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net