全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042259204
氮离子束注入谷子种子后代基因组的 RAPD 分析
任　　1 　牛西午2 　王世研3 　韩美清4
(11 山西农业大学农学院 ,山西 太谷　030801 ;21 山西省农业科学院 ,山西 太原　030006 ;
31 中国药科大学生命科学与技术学院 ,江苏 南京　210009 ;41 河北省环境科学研究院 ,河北 石家庄　050051)
摘 　要 :本试验应用 RAPD 标记技术对氮离子注入和γ射线辐射谷子种子引起的后代个体基因组 DNA
变异进行检测并作比较。145 份材料在经筛选后的 10 个具多态性的随机引物上扩增得到 94 个多态性
位点 ,145 份材料之间的平均遗传距离为 011978。结果表明低能氮离子注入谷子种子可以引起体内基
因组 DNA 发生突变 ,经氮离子束注入的后代遗传差异大于γ射线处理引起的后代遗传差异。其中剂量
为 215 ×1016N + Πcm2 的氮离子束处理引起的后代遗传差异最大 ,平均遗传距离为 011920 ,表明离子束注
入应用于谷子诱变育种可以引起较丰富的遗传变异 ,是一种有效的生物品种改良新技术。
关键词 :谷子 ;离子注入 ;γ辐照 ;RAPD 分析
GENOME RAPD ANALYSIS OF MILLET MUTANTS BY N+ ION IMPLANTATION
REN Yi1 　NIU Xi2wu2 　WANG Shi2yan3 　HAN Mei2qing4
(11Shanxi Agriculture University , Taigu , Shanxi 　030801 ;21Shanxi Academy of Agricultural Sciences , Taiyuan , Shanxi 　030006 ;
31 China Pharmaceutical University , Nanjing , Jiangsu 　210009 ;41 Hebei Provincial Academy of Environmental Science , Shijiazhuang , Hebei 　050051)
Abstract :A study of the genomic variation of millet offspring from treatment of implanting N+ ions and 60 Coγ2rays by using
RAPD analysis was carried out . 94 polymorphic DNA fragments were amplified from 10 selected random oligonucleotide
primers in 145 mutants. The results showed that genetic distances ( GD) among the 145 mutants are ranged from 011 to 015
with a mean of 011978. The results suggested that N+ ions implantation could induce genomic variation , which was more
effective than that of 60 Coγ2rays. The ion beam of 215 ×1016 N + Πcm2 made a great genetic variation , its mean genetic
distance was 011920. Ion implantation is an useful technique for plant breeding.
Key words :millet ; ion implantation ;γ2irradiation ; RAPD analysis
收稿日期 :2005209220
基金项目 :国家科技攻关项目 (2001DA508D09)
作者简介 :任　 (19722) ,女 ,山西临汾人 ,讲师 ,在读博士 ,研究方向为生物工程技术育种。Email :renyi45 @hotmail . com　　低能离子束在农作物诱变育种中的作用已显见端倪[1～7 ] 。虽然辐射育种在作物品种改良中取得了很大的成就[8～10 ] ,但是人们对辐射处理及后代选育过程中基因组发生的变化却了解很少 ,常规的育种方法主要依据后代基因的表型加以判断 ,但是表型往往易受环境条件的干扰 ,使选育工作带有随机性。DNA 分子水平的遗传标记为此开辟了一条新途径[11 ,12 ] 。本试验以不同剂量的氮离子束注入和不同剂量的60 Coγ射线照射晋谷 28 号干种子 ,用 RAPD 技术检测后代基因组DNA 的变化 ,为谷子分子水平的种质资源遗传多态性 的研究提供基础理论依据。1 　材料和方法111 　材料晋谷 28 号种子由山西省农业科学院牛西午研究员提供。本试验方法遵循唯一差异的原则 ,即将同一谷穗种子的 1Π3 进行氮离子注入处理 ,1Π3 进行60 Coγ射线辐照处理 ,未经处理的 1Π3 作为对照。随机引物和 Taq 酶 , dNTP 等购自上海 Sangon 公
952　核 农 学 报　2006 ,20 (4) :259～262Journal of Nuclear Agricultural Sciences
司。PCR 扩增仪为 MJ Research Inc 公司的 PTC2100 型
产品。
112 　方法
11211 　离子注入处理 　于 2000 年 3 月在中国科学院
等离子体研究所经能量为 30keV 的氮离子注入干种子 ,
剂量分别为 0、215 ×1016 、310 ×1016 、315 ×1016N + Πcm2 。
11212 　60 Coγ射线辐照 　材料在山西省农业科学院
经60 Coγ射线辐照 ,剂量为 0、100、150 和 200Gy。
113 　随机扩增多态性 DNA 分析处理后代基因组的变
化
11311 　变异个体基因组总 DNA 的提取 　随机抽取经
过形态学调查的两种处理的 M2 代 145 份材料 ,取 5～
10g 的幼嫩叶片 ,在液氮冷冻下研成细粉末状 ,装入离
心管中 ,加入 DNA 提取缓冲液 , (DNA 提取缓冲液 :
100mmolΠL Tris. HCl , pH815 ;100mmolΠL NaCl ;50mmolΠL
EDTA , pH810 ,2 %SDS) 65 ℃水浴 1～2h ,水浴过程中温
和混匀几次。加入 5ml 5molΠL 醋酸钾溶液小心混匀。
取出后加入等体积的氯仿∶异丙醇 (24∶1) 小心混匀 ,冰
浴 20min 后 ,每分钟 2500 转离心 20min。然后取上清
液加入 016 体积的异丙醇 ,轻轻摇动至絮状 DNA 沉淀
出来 ,置于冰上 30min 后 , 6000rpm 离心 5min。取出
DNA 至干净的离心管 ,用 70 %的乙醇换洗 2～3 次 ,倒
去乙醇室温下晾干到无乙醇味 ,加入适当体积的 1 ×
TE(10mmolΠL Tris - HCl 和 1 mmolΠL EDTA) ,置于 4 ℃
下溶解DNA。取少量DNA 用 018 %琼脂糖凝胶电泳检
测。DNA 浓度的测定 :用 752 型紫外分光光度计以
OD260 (260 nm 的吸光值) 测定 DNA 浓度 ,用 OD260Π
OD280 比值检测核酸纯度 ,电泳检测 DNA 的质量是否
完整。
11312 　引物筛选 　随机抽取 80 个引物应用于本试
验 ,初步筛选到其中带型清晰、重复性强、多态性丰富
且具有个体间差异的引物 10 条 ,分析辐射后代基因组
DNA 的多态性。
11313 　PCR 扩增及凝胶电泳 　在 PTC2100 型 PCR 仪
上进行扩增 , PCR 反应体积为 25μl ,内含 10 ×Buffer
215μl ,dNTP 015μl ,引物1μl ,Taq 聚合酶012μl ,DNA 1μl ,
剩余由超净水补充 ,并上覆 20μl 左右石蜡油以防扩增
过程中的高温损失。反应条件为 :94 ℃下变性 3min ,
50 ℃复性 115min , 72 ℃延伸 2min , 1 个循环 ,而后在
94 ℃变性 1min ,36 ℃退火 1min ,72 ℃延伸 2min ,共循环
45 次 ,最后在 72 ℃下维持 10min ,整个过程约需 515h。
取扩增产物在含 EB (溴化乙锭)的 110 %琼脂糖凝胶中
电泳 , (1 ×TAE 缓冲液中 ,90V 稳压 110～115h) ,BIO2
RAD 凝胶扫描仪检测分析。
11314 　谱带记录及数据分析 　各引物的 PCR 反应分
别进行 2～3 次 ,将大部分可重复的带型列入统计范
围 ,对少数不能重复者则于统计时忽略不计 ,根据其扩
增条带的有无分别记载为 1 或 0 ,根据 Nei &Li 的公式 ,
计算各材料 RAPD 标记的片段共享度 ( F) : F = 2NxyΠ
(Nx + Ny) , 遗传距离指数 ①Distance2D = 1 - F , ②
Distance2LN = - LnF。
2 　结果与分析
211 　谷子 RAPD 反应体系的优化
在本试验中 Mg2 + 为 210mmolΠL 时为反应最佳浓
度。 Taq 酶 的 浓 度 为 0175UΠ25μl , dNTP 浓 度 为
0115mmolΠL ,引物浓度为 1615ngΠml 时扩增结果清楚 ,
谱带数目较多。退火温度一般为 35 ℃～37 ℃,本试验
中 ,在 PTC2100 上采用扩增程序见 11313 ,该程序可以
获得较多清晰的谱带。
212 　谷子种子处理后M2 代的 RAPD 分析
在本试验所建立的反应条件下 ,所用的 80 个引物
对材料可以扩增出 2～11 条带 ,筛选出的 10 个引物
S6、S8、S18、S19、S39、S112、S462、S464、S465、S467 均能
在晋谷 28 号两种处理后代 145 份个体材料 ( G1～G150)
总DNA 中获得清晰、重复性好、多态性丰富的差异片
段 ,其中引物 S19 的扩增产物最多 ,带型清晰。在氮离
子注入 3 个处理和γ射线辐照 3 个 (其中剂量为 200Gy
的处理出苗率为零)处理的 RAPD 分析结果见图 1。
10 个引物共扩增出 94 条多态性带 ,平均每个引
物可以扩增出 914 条 ,多态性位点为 94 个 ,用两种方
法计 算 个 体 两 两 间 的 遗 传 距 离 : ①Distance2D
gendistance = 1 - 2NxyΠ( Nx + Ny ) , ②Distance2LN
gendistance = - Ln[2NxyΠ(Nx + Ny) ] ,相似系数 F = 1 -
D ,遗传距离矩阵由于过大而未列出。145 份材料之间
的平均成对相似系数为 018022 , 59132 %的个体间的
相似系数大于 01800 , 23165 %个体间的相似系数分布
在数值较大的 [ 01700 ,01800 ]区间内 ,即有 82197 %的
个体在遗传上相似性较大。相似系数在较小区间
[01400 ,01500 ]之内的则占 1143 % ,总体来说 ,辐射后
M2 代个体之间的相似性程度较高 ,但小于未经处理的
晋谷 28 号种内 018658 的相似系数。
213 　离子注入和辐照处理间的遗传距离分析
根据 RAPD 分析结果 ,氮离子注入和γ射线辐照
共 5 个处理两两之间遗传距离的平均值见表 1 ,为方
便分析 ,表 1 中 3 个氮离子注入依剂量从低到高分别
为处理 1、2 和 3 , 100 和 150Gy 辐照为处理 4 和 5。
062 核　农　学　报 20 卷
　　　　
图 1 　引物 S19 对处理后 M2 材料 G1～G145 以及 CK的 RAPD 扩增产物
Fig. 1 　The RAPD bands of S19 for M2 material G1～G145 and CK
G1～G29、G30～G58 和 G59～G87 分别为 215 ×1016 、310 ×1016和 315 ×1016 N + Πcm2 氮离子注入的 M2 材料 ;
G88～G116 和 G117～G145 分别为 100 和 150Gyγ辐照处理的 M2 材料。
G1～G29 ,G30～G58 and G59～G87 are M2 materials from 215 ×1016 ,310 ×1016 and 315 ×1016 N + Πcm2 ion implantation treatment ,
respectively ; G88～116 and G117～G145 are M2 materials from 100 and 150 Gyγ2irradiation treatment , respectively.
两种计算方法得出的结果都是对照个体间的平均遗传
距离最小 ,处理 1 内的平均遗传距离最大 ,为 011920 ,
即氮离子注入谷子在 215 ×1016N + Πcm2 剂量下后代个
体间的遗传差异最大。从整体上看 ,氮离子注入所引
起的后代遗传差异比γ射线辐照所诱发的遗传差异要
大 ,且随着氮离子注入剂量和γ射线辐射剂量的增加 ,
辐射后代个体间遗传差异有减小的趋势。
162　4 期 氮离子束注入谷子种子后代基因组的 RAPD 分析
表 1 　两种处理个体间平均遗传距离
Table 1 　The mean genetic distance within the treatments
处理
treatment
编号
code
剂量
dose
遗传距离 genetic distance
D LN
CK 0 0 0. 1342 0. 1506
N + 离子注入 1 2. 5 ×10
16N + Πcm2 0. 1646 0. 1920
N + ion implatation 2 3. 0 ×10
16N + Πcm2 0. 1596 0. 1758
3 3. 5 ×1016N + Πcm2 0. 1467 0. 1610
γ辐照 4 100Gy 0. 1532 0. 1704
γ2irradiation 5 150Gy 0. 1499 0. 1649
214 　各处理间的遗传距离分析
计算来自两个不同处理的两两个体之间的平均遗
传距离 ,结果见表 2。由表 2 可知 ,处理 1、2 与处理 4、
5 之间的遗传距离较大 ;处理 1 与处理 2、3 之间 ,处理
2 与处理 3 之间 ,处理 4 与处理 5 之间的遗传距离较
小 ,即氮离子注入与γ射线辐照两种方法诱变效应的
差异较大 ,而在每种诱变方法内不同剂量间的诱变效
应存在的差异较小。
表 2 　各处理间的平均遗传距离
Table 2 　The mean genetic distance between the treatments
处理间
between treatments
遗传距离 genetic distance
LN D
1 - 2 0. 2089 0. 1839
1 - 3 0. 2125 0. 1865
1 - 4 0. 2299 0. 1905
1 - 5 0. 2277 0. 1901
2 - 3 0. 1945 0. 1753
2 - 4 0. 2255 0. 1992
2 - 5 0. 2233 0. 1985
3 - 4 0. 1831 0. 1641
3 - 5 0. 1906 0. 1716
4 - 5 0. 1975 0. 1720
注 :处理间编号与表 1“编号”相同。
Note : The numbers in first colomn are same treatment as code in Table 1.
3 　讨论
311 　氮离子注入与γ射线辐照两种方法的诱变效应
比较
初步研究结果表明 ,氮离子注入谷子的诱变效应
是十分显著的。余增亮等[13 ] 和李兴林等[1 ] 曾报道 ,氮
离子注入水稻 M1 代生理损伤较轻 ,M2 代突变频率高 ,
突变频谱广 ,以及碳离子注入小麦胚乳诱导后代突变
的初步结果。程汝宏等[5 ]对谷子氮离子注入的诱变效
应进行了研究 ,发现该诱变效果显著 ,突出表现为株
高、穗长、生育期等性状的变幅大、变异率高。与前人
的研究结果相比较 ,本试验从 RAPD 多态性分析结果
看 ,氮离子注入比γ射线辐射引起的后代的基因组
DNA 变异要大 ,且氮离子注入谷子不同剂量间存在一
定差异。RAPD 多样性分析表明 ,不同剂量的氮离子
注入后代的平均遗传距离不同 ,随着氮离子注入剂量
的增加 ,平均遗传距离有减小的趋势。
312 　辐射后代遗传多样性
相似系数 F 是衡量个体间遗传变异程度的可靠参
数 ,F 值越大 ,个体间共有的片段数越多 ,遗传变异性
就越小。RAPD 分析结果表明 ,两种处理后代个体之
间存在遗传差异 ,平均相似性系数为 018022 ,与对照个
体间的平均相似性系数 018658 相比较 ,其个体之间的
遗传多样性较广 ,从分子水平表明氮离子注入和γ射
线辐射诱变技术可以扩大遗传变异 ,丰富遗传的多样
性。
参考文献 :
[ 1 ] 　郑冬官 ,方其英 ,黄德祥 ,刘贯莲. 离子注入在棉花诱变育种中的
诱变功效. 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :315～317
[ 2 ] 　吴跃进 ,王学栋 ,等. 离子束注入水稻诱变效应的研究. 安徽农业
科学 ,1989 ,2 :10～13
[ 3 ] 　王彩莲 ,慎　玫 ,陈秋方 ,徐刚. 氮离子注入对水稻诱变效应的初
步研究. 核农学报 ,1995 ,9 (1) :13～19
[ 4 ] 　王彩莲 ,慎　玫 ,陈秋方. 离子注入水稻的细胞学效应和诱变效
应. 核农学报 ,1997 ,11 (1) :15～20
[ 5 ] 　程汝宏 ,杜瑞恒. 谷子氮离子注入诱变育种初步研究. 安徽农业
大学学报 ,1994 ,21 (3) :310～314
[ 6 ] 　舒世珍 ,朱凤绥 ,等. 离子注入甜菜种子效应初报. 安徽农业大学
学报 ,1994 ,21 (3) :299～302
[ 7 ] 　Burton G W , et al . Effects of recurrent mutagen seed treatments on
mutation frequency and comlining ability for forage yield in pearl millet .
Radiation Botany. 1971 ,14 (4) :323～335
[ 8 ] 　Hanna W W , et al . Early mutations in pearl millet . Mutation Breeding.
Newsletter ,1978 (11) :2
[ 9 ] 　Mahishi D W. A comparison of mutagenic effectiveness and efficency of
gamma rays and chemical mutagens in finger millet . Mysore Journal of
Agriculture Sciences ,1977 ,11 (2) :258～259
[10 ] 　伊虎英 ,鱼红斌 ,等. 谷子 ( Setaria italica Beauv)辐射诱变效应的研
究. 核农学报 ,1995 ,9 (4) :207～221
[11 ] 　陈若雷 ,宋道军 ,李玉峰等. 低能 N + 离子束注入香瓜种子引起的
变异及后代基因组的 RAPD 分析. 激光生物学报 ,2002 ,11 (1) :75
～78
[12 ] 　丁　亮 ,陈睦传 ,沈明山 ,等. RAPD 分析氮离子注入甜菜种子后
的幼苗基因组 DNA 变异. 生物物理学报 ,1999 ,15 (4) :798～803
[13 ] 　Yu ZL. Ion Beam Application Genetic Modification. IEEE Transaction on
Plasma Science ,2000 ,1 (28) :128～132
[14 ] 　Li X L , Wei Z Q ,Wang X J , et al . Preliminary Study on Mutation of
Wheat Eudoeperm Implanted By 12 C6 + . J Lanzhou University (Natural
Sciences) ,2000 , 36 (Supp) :127～130
262 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (4) :259～262