全 文 ：收稿日期 :2007203207
基金项目 :“863”计划 (2004AA214170) ;“973”项目 (2001CB108904)
作者简介 :侯胜强 (19792) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向为生物化学及分子生物学。
通讯作者 :陈明 (19622) ,男 ,广东兴宁人 ,博士 ,从事分子生物学研究。Tel :010268975038 ; E2mail :chenmingbio @hotmail . com
文章编号 :100028551 (2007) 062572205
固氮斯氏假单胞菌铵载体 amtB 基因的功能和结构分析
侯胜强1 　何　升1 ,2 　窦岳坦1 ,3 　平淑珍1 　林　敏1 　陈　明1
(11 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081 ;
21 广西大学生命科学与技术学院 ,南宁 广西　530004 ;31 中国农业大学生物学院 ,北京　100094)
摘 　要 :固氮斯氏假单胞菌 ( Pseudomonas stutzeri) A1501 是分离自水稻根际的联合固氮细菌 ,属变形细菌γ
亚族。全基因组序列分析表明该菌含有 2 个紧密连锁的的铵载体蛋白编码基因 amtB1 和 amtB2 ,位于
同一个操纵子中 glnK基因下游。铵载体蛋白 AmtB1 和 AmtB2 分别包含 12 和 11 个跨膜结构域。为研
究 amtB 的功能 ,构建了 amtB 极性双突变株 (PKOB1) 。amtB 极性双突变导致菌株生长缓慢 ;在铵浓度
分别为 313 和 10mmolΠL 条件下 ,其固氮酶活仍保持在 0101mmolΠL 的最佳固氮条件的 87 %和 74 % ,而野
生型已经基本尚失固氮能力。以硝酸盐为唯一氮源时 ,突变株细胞培养液的铵浓度可达到 314mmolΠL ,
而野生型并未检测到铵 ,表明 AmtB 可能参与了 P. stutzeri A1501 的铵离子转运 ,并与固氮酶活和氮代
谢相关。
关键词 :斯氏假单胞菌 A1501 ;铵载体 ;跨膜结构 ; amtB
MOLECULAR CLONING AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF AMMONIUM TRANSPORTER2
ENCODING GENES AMTB IN ASSOCIATIVE NITROGEN2FIXING
BACTERIUM PSEUDOMONAS STUTZERI A1501
HOU Sheng2qiang1 　HE Sheng1 ,2 　DOU Yue2tan1 ,3 　PING Shu2zhen1 　LIN Min1 　CHEN Ming
(11Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agriculture Sciences , Beijing 　100081 ;
21 College of Life Science & Technology , Guangxi University , Nanning , Guangxi 　530004 ;
31 College of Biological Science , China Agriculture University , Beijing 　100094)
Abstract : Pseudomonas stutzeri A1501 is a nitrogen2fixing bacterium associated with rice and classified into gamma subgroup of
proteo2bacteria. Analysis of the genome revealed two linked amtB genes coding for ammonium transporter just down stream of
glnK in the same operon. The AmtB1 contains 12 trans2membrane domains and the AmtB2 contains 11 trans2membrane
domains respectively. The amtB mutant was constructed and the mutant showed retard growth compared to the wild2type
strain. The optimal ammonium concentration for high nitrogen fixation by P. stutzeri wild2type and mutant strains is
0101mmolΠL. When cultured in the medium containing 313 and 10mmolΠL NH+4 , the wild type A1501 did not have any
nitrogenase activity while the amtB mutant showed 8616 % and 74 % of the maximal nitrogen activity cultured in the optimal
ammonium concentration (0101mmolΠL) . When nitrate was used as the sole nitrogen source , the ammonium concentration of
the amtB mutant in the broth reached 314mmolΠL while that of the wild2type of strain A1501 was not detected. Thus we
concluded that the AmtB is involved in the transport of ammonium and related to nitrogen fixation and metabolism.
Key words : Pseudomonas stutzeri A1501 ; ammonium transporter ; amtB
275　 核 农 学 报　2007 ,21 (6) :572～576Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　固氮斯氏假单胞菌 A1501 是分离自我国南方水稻
田的一种联合固氮菌[1 ] ,它能附着在宿主植物的根表
或侵入根内进行生长繁殖和固氮[2 ] 。但是 ,其固氮作
用受多种因素的限制 , 提供给植物的氮素很少。
Okon[3 ]等长期对巴西固氮螺菌与植物联合固氮作用的
研究表明 ,巴西固氮螺菌的联合固氮作用对植物的生
长和产量没有明显的促进作用。因此 ,认为固氮菌细
胞膜上的铵载体是主要的限制因素 ,其影响了氮素由
固氮菌向植物的转运。铵载体是一类存在于细胞膜上
主动转运 NH+4 的载体 ,普遍存在于真核生物或原核生
物细胞膜上。它可将细胞所处环境中的微量铵转运到
细胞内成为其自身的氮源 ,确保细胞内的铵库稳定和
细胞氮代谢的正常运行[4 ] 。近年来 ,已从不同的固氮
菌中克隆到 amtB 基因 ,包括棕色固氮菌 Azotobacter
vinelandii [5 ] 、巴西固氮螺菌 Azospirillum brasilense[6 ] 和根
瘤菌 Rhizobium etli [7 ] 。任何与这类 amtB 具有高同源
性的基因菌被命名为铵载体基因 ( amtB ) ,其中包括已
发表的酵母 mep1 和 mep2 ,枯草芽孢杆菌 nrgA 和 amt
等[4 ] 。对已知的 amtB 序列分析表明 ,推测的 AmtB 均
为跨膜蛋白 ,含有 10～12 个的跨膜结构域。
固氮斯氏假单胞菌 A1501 基因组序列中含有 2 个
紧密连锁的 amtB1 和 amtB2。本研究对这 2 个基因进
行了 PCR 扩增和序列分析 ,并通过相关软件分析推测
它们编码的蛋白分别含有 12 个和 11 个跨膜结构 ;进
一步通过构建 amtB 基因极性突变株研究了 amtB 基
因的生物学功能 ,以期为揭示联合固氮菌铵转运的机
制 ,提高固氮效率奠定理论基础。
1 　材料与方法
111 　菌株和质粒、培养基和生长条件
试验用的质粒、大肠杆菌 ( Escherichia coli ) 和 P.
stutzeri A1501 菌株见表 1。
E. coli 菌株于 Luria2Bertani (LB) 培养基[10 ] 中
37 ℃培养 ; P. stutzeri A1501 于限制性培养基或无氮培
养基[不含 (NH4 ) 2 SO4 的 A15 培养基 ] [11 ] 中 30 ℃培养。
固体培养基加入 15gΠL 琼脂。菌株培养时 ,抗生素用
量分别为 :四环素 (50μgΠml) 、卡那霉素 (50μgΠml) ,氨苄
霉素 (为 50μgΠml) 。试验用化学试剂均为分析纯。
112 　amtB12 基因的克隆
根据野生型 A1501 基因组序列设计 2 对 amtB 基
因特异性引物 : P amtB1 和 P amtB2 (5’2GTGAGCTCTT2
CGTGGTCAACCTGGA23 ’和 5 ’2GCAAGCTTAAGGTG2
ATCAGGGTCTG23’) , P amtB3 和 P amtB4 ( 5’2ACAGG2
ATCCTCTGTTAAGCCCAGGGCCT23’和 5’2GGGAAGCTT2
ATTGAAGTTGTTGACGCC23’) ,分别含有 Sac Ⅰ和 Hind
Ⅲ、Hind Ⅲ和 BamH Ⅲ酶切位点。以 A1501 基因组
DNA 为模板 ,分别以 2 对引物 PCR 扩增完整 amtB 基
因序列 ( amtB12) 和 amtB1 基因部分序列。PCR 反应
为 :94 ℃预变性 10min , 94 ℃变性 30s , 60 ℃退火 30s ,
72 ℃延伸 215 或 1min ,30 个循环 ,最后 72 ℃补充延伸
10min。
表 1 　菌株及质粒
Table 1 　Strains and plasmids
质粒和菌株
plasmids and
strains
特性
characteristics
来源
source
p K18mob
自 杀 性 质 粒 载 体 suicide
plasmid ; Kmr
Schafer et al ,
1994 [8 ]
pRK2013
辅助质粒 ColE1 replicon with
RK2 tra genes , helper plasmid
used for mobilizing P2and Q2group
cloning vector ; Tc r
Figurski & Helinski ,
1979 [9 ]
p K18mobAmtB
amtB1 部 分 片 段 插 入 到
p K18mob ;插入方向与复制起
点相反 ; Kmr
本研究
E. coli DH5α supE44
ΔlacU169 (ψ80 lacZ
ΔM15) hsdR17 recA endA Nx r 本实验室
P. stutuzeri
A1501 野生型 丘元盛 ,1981
[2 ]
PKOB1
(PTamtB1
极性双突变株)
amtB1 缺失突变整合到 P.
stutuzeri A1501 ;插入方向与复
制起点相反 ; Kmr
本研究
113 　含 amtB1 部分片段的自杀质粒构建
将纯化的 amtB1 基因部分片段的 PCR 产物和自
杀质粒 p K18mob 分别用 Hind Ⅲ和 BamH Ⅲ进行消化 ,
酶切产物经纯化后 ,用 T4 连接酶 ( Promega) 连接 ,并转
化到 E. coli DH5α感受态细胞中。在含有 Km (50μgΠ
ml)的LB 平板上筛选阳性克隆 ,获得的自杀性质粒命
名为 p K18mobAmtB。提取质粒 DNA , 经 Hind Ⅲ和
BamHⅢ酶切和琼脂糖凝胶电泳验证所构建的自杀性
质粒。
114 　三亲接合及 amtB 极性突变株的构建
利用三亲结合的方法[11 ] 构建 amtB 极性突变株。
以野生型 A1501 为受体菌 ,含 p K18mobAmtB 的 E. coli
DH5α菌株为供体菌 , pRK2013 为辅助质粒。3 种细胞
分别培养至 OD600 = 014～016 ,洗菌并重悬于生理盐水
中 ,各取 15μl 混合均匀 ,滴加到 LB 平板上。待菌落形
成后 ,经适当稀释涂布于含有 Km (50μgΠml) 的 A15 培
养基的平板上 ,筛选接合子。
设计 1 对 PCR 验 证 引 物 : Pp K18mobCF ( 5’2
375　6 期 固氮斯氏假单胞菌铵载体 amtB 基因的功能和结构分析
GCCGATTCATTAATGCAGCGGGCAC23’和 P amtBV ( 5’2
GCCGGGTTCGTACTTCTGG23’) ,以接合子基因组 DNA
为模板 ,进行 PCR 验证。
115 　固氮活性测定
固氮活性测定参见文献[11 ] ,主要步骤如下 :将活
化后的菌株接种于含半固体 A15 培养基的疫苗瓶中 ,
30 ℃培养培养 24 h ,真空泵抽空瓶 ,注入氩气 ,并加入
1 %的氧气及 10 %体积的乙炔。30 ℃反应 24～48 h 后 ,
用微量进样器取出 100μl 气体用气相色谱法测定乙烯
含量 (SP - 2305 型气相色谱仪) ,计算乙炔还原固氮酶
活性。
2 　结果与分析
211 　铵转运载体基因序列及推导的蛋白序列分析
从野生型 A1501 基因组 DNA 中 ,PCR 扩增到完整
的铵转运载体基因片段 (217 kb) 。序列测定的结果
(图 1)显示 ,该片段全长 2684 bp ,包含 2 个完整的铵载
体基因 ,其中 amtB1 基因序列为 1317bp , amtB2 序列
为 1176 bp ,与 P. stutzeri A1501 基因组序列比对 ,完全
一致。
图 1 　amtB1 和 amtB2 基因的 PCR 产物电泳图
Fig. 1 　PCR product of amtB1 and amtB2 genes
1～2 :以野生型菌株 A1501 总 DNA 为模板扩增获得的 amtB1
和 amtB2 基因 ;3 :以无菌水作对照进行的 PCR 扩增 (阴性对
照) ;M:DNA Marker
1～2 : PCR amplified amtB1 and amtB2 genes using total DNA of
wild - type strain A1501 as template ;3 :Negative control using water
as template ;M:DNA Marker
固氮斯氏假单胞 ( P. stutzeri ) A1501 的 amtB1 和
amtB2 基因序列在 NCBI 网站进行 BLAST 比对分析的
结果表明 : amtB1 与假单胞菌 ( P. aeruginosa PAO1) 、
巴西固氮螺菌 ( A . brasilense ) 及棕色固氮菌 ( A .
vinelandii)所编码的铵转运载体基因 amtB 高度同源 ,
同源性分别为 85 %、76 %、63 % ,而 amtB2 与古生球菌
( Archaeoglobus f ulgidus DSM 4304)同源性仅为 45 %。从
Genebank 中提取了部分具有代表性古生球菌 amtB1、
amtB2、amtB3、鸟分支杆菌 ( Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis K210) amtB1、amtB2、巴西固氮螺菌
amtB 、棕色固氮菌 amtB 、假单胞菌 PAO1 amtB 、E. coli
K12 amtB 、红假单胞菌 ( Rhodopseudomonas palustris )
CGA009 amtB 基因推导的氨基酸序列进行聚类分析 ,
构建 AmtB 同源关系树 (图 2) 。发现巴西固氮螺菌、棕
色固氮菌、假单胞菌 PAO1 的 AmtB 和固氮斯氏假单胞
A1501 的 AmtB1 聚为一大类。由于 P. stutzeri A1501
在基于 16S rDNA 序列的系统发育分类学上与 P.
aeruginosa PAO1 亲缘关系最近 ,它们的AmtB 同源性最
接近 ,同样巴西固氮螺菌和棕色固氮菌的 AmtB 同源
性最近。而 P. stutzeri A1501 的 AmtB2 与古生球菌
AmtB2 聚为一类 ,它们的同源性最接近。由此推测 P.
stutzeri A1501 的 amtB1 在进化上较为保守 ,而 amtB2
可能来源于异源基因的转移 ,尚需进一步的深入研究。
图 2 　不同菌属中部分铵转运载体蛋白的同源性进化树
Fig. 2 　Homology tree based on amino acids of
AmtB binding protein derived from different bacterial species
212 　铵转运载体蛋白结构预测
利用 TMHMM Server v. 210 ( http :ΠΠwww. cbs. dtu.
dkΠservicesΠTMHMM2110Π) 蛋白结构预测软件[12 ] ,对固
氮斯氏假单胞菌 A1501 的 2 个铵转运载体蛋白氨基酸
序列进行结构预测的结果见图 3。
如图 3 所示 ,AmtB1 转运蛋白包含 12 个跨膜区 (图
3 - A) ,AmtB2 蛋白包含 11 个跨膜结构域 (图 3 - C) 。表
明 AmtB1 和 AmtB2 为膜蛋白 ,它们通过多个跨膜结构组
成铵转运的跨膜运输通道。同时我们采用另一个蛋白
结构预测软件[13] ( TopPred2 ( http :ΠΠbioweb. pasteur. frΠ
seqanalΠinterfacesΠtoppred. html)对 2 个铵转运载体蛋白结
构预测的结果基本一致 (图 3 - B 和图 3 - D) 。
213 　固氮斯氏假单胞 PKOB1 的构建
为了研究 amtB 基因的功能 ,采用了一种快速基
475 核　农　学　报 21 卷
　　　　　
图 3 　AmtB1 和 AmtB2 跨膜蛋白结构预测和结构示意图
Fig. 3 　Structural prediction of transmembrane regions in AmtB1 and AmtB2 protein
因突变法[14 ] 构建了 PKOB1 突变株 ( amtB1 极性突变
株) 。由于在自杀性质粒中和扩增的 amtB1 下游序列
上设计 PCR 验证引物 ( Pp K18mobCF 和 P amtBV) ,因
此 ,当含有 amtB1 基因部分片段的自杀性质粒整合到
野生型 A1501 染色体并发生重组单交换后 ,则能够从
发生交换的极性突变株中 PCR 扩增到 899 bp 特异片
段 ,而以野生型 A1501 基因组 DNA 为模板 ,不能扩增
到相应的 PCR 产物 (图 4) 。
本研究共筛选到 26 株突变株 ,从其中随机挑取的
8 株突变株中均扩增到 899 bp 特异片段 ,选择其中一
株 PKOB1 突变株 ,并命名为 PKOB1。进一步通过测序
测定和分析 ,确定该菌株发生突变的正确性。
214 　突变株 PKOB1 与野生型 P. stutzeri A1501 的生
长曲线
将 P. stutzeriA1501 和突变株 PKOB1 分别培养在
A15 限制性培养基中 ,在不同的时间测定 OD600 ,结果
如图 5 所显示 ,突变株 PKOB1 与野生型 P. stutzeri
图 4 　PKOB1 突变株的验证
Fig. 4 　Identification of PKOB1 mutant by
PCR amplification
M:DNA marker ;1～2 :以极性突变株 PKOB1 总 DNA 作为模板
扩增的 PCR 产物 ;3 : 以野生型菌株 A1501 总 DNA 作为模板
扩增的 PCR 产物 (阴性对照) ;4 :以水作为模板扩增的 PCR
产物 (阴性对照)
M: DNA marker ; 1 ～ 2 : PCR products amplified from mutant
PKOB1 ; 3 : PCR products amplified from wild2type strain A1501 as
negative control ;4 : PCR products amplified from water as negative
control
575　6 期 固氮斯氏假单胞菌铵载体 amtB 基因的功能和结构分析
A1501 生长趋势相似 ,但是突变株 PKOB1 生长受到了
影响 ,推测 PKOB1 的铵转运系统发生了突变 ,NH+4 不
能正常转运到胞内 ,影响到的细胞氮源供给 ,其生长略
弱于野生型菌株 (注 : PKOB1210 是极性突变株中代表
性的菌株) 。
图 5 　野生型 P. stutzeri A1501 和突变株 PKOB1 生长曲线
Fig. 5 　Growth curve of wild type P. stutzeri
A1501and polar mutant PKOB1
图 6 　不同铵浓度下突变株 PKOB1 和野生型
A1501 菌株的固氮活性
Fig. 6 　Nitrogenase acitivity of polar mutant PKOB1and
wild2type A1501 in different NH+4 concentration
215 　不同铵浓度对 PKOB1 突变株与野生型 A1501 固
氮能力的影响
测定不同铵浓度下 PKOB1 突变株与野生型 A1501
的固氮酶活性的结果如图 6。当培养基中的 NH+4 为
0101mmolΠL 的最佳固氮条件下 ,我们设定其固氮酶活
比为 100 % , 在培养基中的 NH+4 为 313mmolΠL 和
10mmolΠL 下 ,PKOB1 菌株的固氮酶活保持在 0101mmolΠ
L 的最佳固氮条件的 87 %和 74 %。但是 , 野生型
A1501 的固氮酶活分别为其在 0101mmolΠL 的最佳固氮
条件下的 2173 %和 2145 %。这一结果说明突变株在
含高浓度 NH+4 的培养基中仍能保持一定的固氮能力 ,
而野生型菌株基本丧失了固氮能力 ,因此 ,可以初步推
测 amtB 极性双突变影响到细胞的铵转运。
216 　硝酸盐对突变株 PKOB1 对生长的影响
以利用硝酸盐作为唯一氮源研究突变株 PKOB1
对硝酸盐的利用。在 A15 培养基中含 10mmolΠL 的硝
酸盐条件下 ,测定 PKOB1 细胞培养到对数生长后期的
培养液中的 NH+4 浓度 ,发现在 12、18h 的 PKOB1 培养
基中 NH+4 分别达 112 和 314mmolΠL。而野生型 A1501
的培养基中均未能检测到 NH+4 。有报道 A . brasilense
和 Enterobacter gergoviae 中铵载体突变株也有类似的现
象[15 , 16 ] 。因此 ,我们认为 PKOB1 中铵蛋白的极性双突
变导致细胞将硝酸盐的 N 转化形成的 NH+4 通过自由
扩散到细胞外 ,而不能通过铵载体吸收利用的 NH+4 则
保持在细胞内。表明铵载体对氮库平衡起到重要的作
用。
3 　讨 　论
联合固氮菌的主要联合对象是与人类密切相关的
粮食作物。利用联合固氮菌作为田间作物接种剂的研
究已在世界各国广泛开展 ,在一些国家已形成商业产
品。联合固氮的效率受许多因素的影响。其中结合态
氮 (氨等)是影响联合固氮效率的主要因素之一 ,能阻
遏固氮 酶 的 合 成 , 抑 制 固 氮 酶 的 活 性。在 K.
pneumoniae 中 ,铵通过直接调控 nifLA 操纵元的表达及
NifA 的活性抑制固氮酶活性[17 ] 。由于胞内的 NH+4 浓
度直接影响到固氮酶活性 ,而铵载体影响到细胞氮库
平衡。本研究所构建 amtB 极性双突变株 ( PKOB1) 中
amtB 的突变为极性双突变 ,即与其连锁的下游基因
amtB2 也不能正常转录 , 因此 , PKOB1 为 amtB1 和
amtB2 双缺失菌株。由于 amtB 极性双突变株
(PKOB1)在 NH+4 存在下细胞生长缓慢 (图 5) ,以及在
含 10mmolΠL 的硝酸盐 A15 培养基中细胞通过硝酸还
原酶的催化产生 NH+4 ,并部分扩散到胞外。我们推测
amtB 极性双突变导致细胞内氮库的 NH+4 含量下降 ,
影响到细胞的 NH+4 转运和氮代谢。而突变株在含
313mmolΠL 和 10mmolΠL NH+4 的培养基中仍能保持一
定的固氮能力 ,而野生型菌株基本丧失固氮能力 (图
6) ,其试验结果也说明这一点。尽管 amtB 极性双突
变导致细胞在硝酸盐存在下部分 NH+4 扩散到胞外 ,以
及在野生型菌株不能固氮的 NH+4 条件下 PKOB1 仍能
保持一定的固氮作用 ,但 amtB 突变对细胞的氮代谢
以及固氮作用的机制有待于进一步深入的研究。
参考文献 :
(下转第 566 页)
675 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (6) :572～576
群体合理的光合冠层分布 ,以截获更多光能 ,获取高产
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