全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2003) 012062205
用点杂交方法定量检测植物
病毒 RNA 负荷量
柴立红1 　徐步进1 　陈集双2
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江大学生命科学院 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :用 RNA 点杂交与用放射性成像仪直接读取放射性活度相结合的方法定量测
定植物病毒 RNA 相对负荷量 ,检测了 01001～10ppm 浓度范围内二氢茉莉酸丙酯
(PDJ)对烟草组织中烟草花叶病毒 (TMV) RNA 的影响。结果表明 :在 PDJ 处理 3d 时 ,
与对照相比低浓度 (01001ppm) PDJ 处理的 TMV RNA 病毒负荷量无明显差异 ,但随着
浓度的升高 ,PDJ 对 TMV RNA 的复制和积累具有促进作用 ;浓度越高 ,促进作用越显
著。同时用传统的枯斑接种法验证了上述结果。两种方法相比 ,点杂交结合放射性
成像仪读取放射性活度的方法所受的人为误差干扰较小 ,能够相对精确地定量测定
植物组织中病毒 RNA 负荷量。
关键词 :点杂交 ; 放射性成像仪 ; 二氢茉莉酸丙酯 ; 烟草花叶病毒
收稿日期 :2001208221
基金项目 :国家自然科学基金资助 (399880028)
作者简介 :柴立红 (1967～) ,女 ,杭州人 ,硕士 ,从事生物物理学和植物病毒的研究工作
目前常用的植物病毒的定量检测方法有侵染性测定法、血清学测定方法 (包括 ELISA 方
法) 、核酸杂交方法等。但是 ,这些方法都具有一定的局限性[1 ] 。本研究采用点杂交方法将α2
32 P 标记的烟草花叶病毒 ( TMV) DNA 探针与感染植株中总 RNA 进行点杂交 ,用放射性成像仪
(又称激光磷屏分析仪)直接定量读取杂交斑点的相对放射性活度 ,从而快速测定病毒 RNA 的
相对负荷量。在方法学研究的基础上 ,用此方法测定了一种新型植物激素类物质对烟草组织
中病毒 RNA 负荷量的影响规律。
茉莉酸 (Jasmonate acid ,简称 JA)是植物内源性环戊烷类化合物[2 ] 。JA 及其衍生物广泛存
在于植物中 (包括藻类) ,在代谢上具有激素作用的特点 ,具有广谱的生理效应 ,被认为是一种
潜在的植物生长调节剂[3 ,8 ] 。二氢茉莉酸丙酯 (n2Propyl dihydro2jasmonate ,简称 PDJ)是一种人工
合成的茉莉酸衍生物 ,目前已经可以大量生产 ,为研究 JA 类似物对植物病毒作用的规律提供
了条件。茉莉酸使用浓度不同其效应有很大差异[4 ] 。本研究用不同浓度 PDJ 处理接种 TMV
的烟草 ,然后用点杂交方法定量检测经不同浓度 PDJ 处理后烟草中病毒 RNA 的负荷量 ,并用
枯斑法测定病毒的侵染性验证此方法的可靠性。
1 　材料和方法
111 　放射性活度与放射性成像仪的显影曝光度的相关性测定
26　 核 农 学 报　2003 ,17 (1) :62～66Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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FUJ IFILM BAS21800 放射性成像仪为放射自显影成像系统 ,配有特制的磷屏。测量时 ,放
射性核素发出的射线照射到磷屏上产生潜在的对应影象 ,影象经扫描和光电信号转换后可存
贮并显现在计算机中[5 ] 。放射性成像仪与 X光胶片自显影相比 ,成像速度可加快 10～100 倍 ,
且可定量测定成像板上影像的放射性活度。
将放射性浓度为 1733、1155、770、513、342、228、152、105、70BqΠμl 的 5’2α232 P 标记的 dCTP 各
取 5μl 分别点样在尼龙膜上 ,各浓度点两个重复 ,彻底晾干用保鲜膜包裹后 ,压膜 3h ,在 FUJ IF2
ILM BAS21800 放射性成像仪上显影后用仪器所带的软件读取斑点的曝光度 PSL 值 ,作放射性
活度与曝光度 PSL 的相关曲线。
112 　病毒毒原和试剂
TMV2AU7 分离自非洲食叶茄子 ( Solanum macrocarpon L. ) [7 ] ,病毒分离物接种保存于烟草
( Nicotiana tobaccum)上 ,接种前在普通烟上活化 (Chen et al . 2001) ;RNA 提取缓冲液、探针标记
试剂盒 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 购自宝生物工程大连有限公司 ; PRF3 质粒 (含
TMV 的全序列 cDNA)由美国 Wisconsin2Madison 大学分子病毒研究所陈剑波博士提供 ;引物由
本校周雪平教授提供。
113 　试验植物和病毒接种
在防虫、控温、控光条件下 ,培养生长基本一致的烟草 16 盆 (2 株Π盆 ,培养温度 12～20 ℃,
光照 12hΠd) 。在 4～5 片真叶期 ,用常规汁液磨擦接种方法接种 TMV2AU7。
114 　PDJ 处理
PDJ 乳剂由日本 ZEON 公司生产 (生产批号 W000427) 。用灭菌的蒸馏水配制 10、0101、
01001ppm的 PDJ 稀释液。在烟草接种病毒 7d 后 ,喷施不同浓度的 PDJ ,每个浓度设 4 个重复 ,
以蒸馏水作为空白对照。
115 　点杂交测定 TMV基因组 RAN
11511 　病毒侵染植株中总 RNA 的提取 　在 PDJ 处理 3d 后 ,将新鲜病叶各 012g 在液氮中研
碎 ,加 1ml Trizol 提取液碾磨成匀浆 ,加入 015ml 三氯甲烷于 4 ℃下 12000rpm 离心 10min ,上清液
加等体积的三氯甲烷 , 12000rpm 离心 10min ,吸取上清液 ,加 015ml 异丙醇 , 12000rpm 离心
10min ,沉淀用 75 %乙醇洗后 ,溶于经 DEPC处理过的 milli2Q 水中。
11512 　RNA 样品的变性和点样 　在 40μl RNA 溶液中加入 100 %甲酰胺 80μl ,37 %甲醛 28μl ,20
×SSC 8μl ,68 ℃水浴 15min ,迅速置冰上。加等体积的 20 ×SSC ,各 RNA 样品分 3 个重复 ,手工
点样到尼龙膜上 ,每次点样 5μl。自然风干尼龙膜 ,80 ℃干燥 115h。
11513 　PCR 扩增制备DNA 探针模板 　以 PRF3 质粒 (含 TMV 的全序列 cDNA)为模板扩增 TMV
基因组中段 cDNA 片断 (约 800bp) 。上游引物和下游引物序列分别为 :
P83 ( Primer F) : 5’2GTGGCGCTTTTGGAATATGA23’; P84 ( Primer R ) : 5’2CAATGATGGAGACT2
GGTGTA23’。PCR 扩增条件 :94 ℃30s ,55 ℃45s ,72 ℃90s ,36 次循环。用琼脂糖凝胶电泳和透
析袋回收法回收 DNA ,电泳确定回收 DNA 探外模板的浓度。
11514 　探针制备和杂交反应 ,按照探针试剂盒所述标记方法标记探针 ,在 42 ℃预杂交 4～5h
后 ,加入适量探针 ,42 ℃杂交反应 16～20h。用 50ml 2 ×SSC ,011 %SDS 溶液 42 ℃洗膜 15min 两
次 ;50ml 1 ×SSC , 011 %SDS 42 ℃溶液洗膜 15min ; 50ml 011 ×SSC , 011 %SDS 溶液 42 ℃洗膜
30min。
11515 　病毒 RNA 负荷量数据的采集和分析 　在暗盒内将保鲜膜包裹的尼龙膜与感光屏紧贴
36　1 期 用点杂交方法定量检测植物病毒 RNA 负荷量
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曝光 4h ,用 FUJ IFILM BAS21800 放射性成像仪所带软件定量读取杂交斑点的曝光度 PSL 值。
此曝光度即对应于各处理的 TMV RNA 的相对浓度。用DPS 软件处理数据 ,对不同浓度 PDI处
理的烟草中的 TMV RNA 负荷量进行差异显著性分析[6 ] 。
116 　PDJ 处理后 TMV的侵染性定量
参照常规半叶法进行[1 ] 。枯斑指示植物为心叶烟。选用苗龄、生长状况和大小基本一致
的 5～6 叶期心叶烟 ,在喷施 PDJ 后 3d 进行 RNA 点杂交的同时 ,分别取各处理 PDJ 浓度的烟草
叶片各 013g(作为 1 份接种体) ,用半叶法汁液磨擦接种到心叶烟上 ,在左半片叶片上接种对
照 ,对应的右半片叶片上接种经 PDJ 处理的普通烟汁液 ,各浓度设置 4 个重复 ,6d 后统计接种
叶片上左右半片的枯斑数并计算其比值。
2 　结果和分析
211 　放射性活度与放射性成像仪的显影曝光度的相关性曲线
图 1 　放射性成像仪测定的不同
放射性活度所对应的曝光强度
Fig. 1 　Exposure of different radioactivity by
FUJ IFILM BAS21800 BIO2Imaging Analyzer放射性成像仪测定的不同放射性活度所对应的曝光强度见图 1。用仪器所带的软件按斑点大小圈定各斑点 ,读取其面积内的曝光强度 PSL 值 ,根据单位面积的曝光本底数减去相应各斑点的本底 ,所得各斑点实际 PSL 值数据见表 1。结果显示 :放射性成像仪读取相同放射性活度的曝光度PSL 值误差较小 ,实验重复性较好。图 2 显示 ,放射性活度与所读曝光度数值成良好的线性关系。因此 ,用此仪器定量相对放
射性活度具有很高的可信度。
表 1 　各斑点的曝光度对应的 PSL 值
Table 1 　The exposure PSL value subtracting the background of the dot of different radiation
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PSL 值减本底
PSL value subtracting
the background
A 96259 58509 41808 20541 14181 8096 5175 3641 2126
B 97730 63009 47249 24071 16871 8440 5400 3836 2108
平均 mean 96995 60759 44529 22081 15526 8268 5288 3739 2117
放射性活度 radioactivity(Bq) 1733 1155 770 513 342 228 152 105 70
212 　PDJ 处理对烟草中 TMV RNA含量的影响
在 PDJ 处理 3d 时 ,RNA 点杂交所得结果如图 3 所示。各处理的 PSL 值对应 TMV RNA 相
对含量如表 2 所示。显著性差异分析结果表明 :在 PDJ 处理 3d 时 ,不同浓度的 PDJ 处理对烟
草中 TMV RNA 负荷量有显著影响 , PDJ 在 01001～10ppm 浓度范围内随浓度的升高对 TMV
RNA 的复制和积累有明显的促进作用 ,浓度越高促进作用越明显 ,低浓度 (01001ppm)的 PDJ 处
理与对照相比没有显著性差异。
46 核　农　学　报 17 卷
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图 2 　放射性活度与放射性成像仪
测得的曝光度 PSL 值的相关曲线
Fig. 2 　Curve of correction between
radioactivity and PSL value
图 3 　PDJ 处理 3d 烟草中 TMV RNA 点
杂交结果
Fig. 3 　TMV RNA dot blot at 3d post PDJ
treatment with different consistencies
表 2 　PDJ 处理 3d 各杂交斑点的曝光度及差异显著性分析
Table 2 　The PLS value and variance analysis of RNA dot blot at 3d post PDJ treatment
1 2 3
均值
mean
误差
error
显著性差异分析
significant variance analysis
α= 0101
PDJ 处理
PDJ treatment
CK 136 128 155 140 10 C
01001pm 126 113 164 120 5 C
0101ppm 180 164 198 181 12 B
10ppm 330 326 300 319 12 A
213 　汁液磨擦接种法检验 PDJ 对烟草中 TMV侵染力的影响
用半叶法将烟草上的 TMV 接种心叶烟 ,统计接种叶片左右半片上的枯斑数 ,结果见表 3 ,
随 PDJ 浓度增高枯斑数与对照之比值逐步增大 ,其中 011pm 和 10ppm 的对应比值大于 1 ,说明
这两个浓度处理对 TMV RNA 的复制累积有促进作用 ;而 01001ppm 浓度的 PDJ 处理所对应的
枯斑数与对照之比明显小于 1 ,即低浓度 PDJ 处理抑制烟草中 TMV RNA 的复制和积累。
表 3 　PDJ 处理 3d 时接种于心叶烟上的枯斑数之比
Table 3 　The ratio of local2lesions presented on Nicotiana glutionosa 3d post PDJ treatment
枯斑数之比
ratio of local2lesions 处理 1treatment 1 处理 2treatment 2 处理 3treatment 3 处理 4treatment 4 平均值mean 标准差SD
01001ΠCK 0171 0170 0168 0183 0173 0107
0101ΠCK 1103 1111 1110 1130 1114 0112
10ΠCK 1167 115 1155 1170 1161 0110
3 　讨 　论
311 　传统的用枯斑数定量测定病毒侵染体含量的方法虽然操作简单 ,但是受人为因素 (如汁
液摩擦时轻重) 、环境因素 (如气温、光照等)和接种植物个体差异的影响较大。本文用 RNA 点
杂交结合放射性成像仪测定病毒 RNA 含量 ,结果显示其人为误差和仪器误差均较小 ,而且避
免了放射自显影这一费时繁琐的步骤 ,可在几小时甚至几十分钟内读取杂交后的图形并进行
56　1 期 用点杂交方法定量检测植物病毒 RNA 负荷量
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放射性活度定量分析 ,可以相对精确地定量病毒 RNA。
312 　将此方法应用于检测 PDJ 对烟草中 TMV RNA 含量的影响 ,得出如下结论 :01001ppm 低浓
度 PDJ 处理对烟草中的 TMV RNA 含量没有显著影响 ;但随浓度的增高 PDJ 促进 TMV RNA 的
复制和积累 ,与对照相比具有极显著的促进病毒 RNA 的效果。用传统的枯斑半叶法测定所得
的结果显示 :01001ppm 低浓度 PDJ 处理抑制烟草的 TMV RNA 含量 ;高浓度的 PDJ 处理验证了
点杂交结果的正确性。
313 　JA 作为一类新型植物生长调节剂 ,对于植物生理生化反应具有多种调节作用。一般认
为 JA 能够诱导植物抗病。根据本试验研究结果 : PDJ 使用早期对 TMV RNA 具有促进作用。
因此 ,还需要进一步研究在不同处理时间的影响。以便为应用 PDJ 及其它 JA 类似物提供科学
依据。JA 类似物等生长调节剂对植物病毒的影响可能是通过影响寄主植物的生理生化过程
来实现的。
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QUANTITATIVE DETECTION FOR PLANT VIRUS’S RNA2LOADING BY DOT2BLOT
CHAI Li2hong1 　XU Bu2jin1 　CHEN Ji2shuang2
(1. Institute of Nuclear2Agricultural Sciences ;2. College of Life Science , Zhe jiang Univ . , Hangzhou , Zhejiang prov . 310029)
ABSTRACT :A new method , RNA dot blot combined with direct determination of the radioactivity
by BIO2Imaging Analyzer( dRH2dBIA) was used for detecting RNA of plant virus in infected plant
tissue. This method was used for the influence of RNA2loading level of tobacco mosaic virus
( TMV) in tobacco leave tissues after treatment of a plant hormone relatives( n2Propyl dihydro2jas2
monate , PDJ) in the concentration range of 01001～10ppm. The results indicate that after PDJ ap2
plication onto tobacco leaves for 3days all PDJ treatments cause increase of TMV RNA2loading
level except 01001ppm treatment ,and the higher the concentration ,the more obvious increase was
observed. . This phenomenon was confirmed with semi2leaf lesion spot on Nicotiana glutinosa as a
local lesion host. The dRH2dBIA mehtod is applicable in quantitative determination of RNA with2
out obvious artif icatial influence.
Key words : new RNA detection method ; BIO2Imaging Analyzer ; n2Propyl dihydro2jasmonate ; tobacco
mosaic virus
66 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (1) :62～66