全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062904205
莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断
ELISA 检测方法的建立
张海棠1 　王自良1 　邓瑞广2 　钟　华1 　范国英1
(11 河南科技学院动物科学学院 ,河南 新乡　453003 ; 21 河南省动物免疫学重点实验室 ,河南 郑州　450002)
摘 　要 :用混合酸酐法将莱克多巴胺 (RAC)偶联于牛血清白蛋白 (BSA) ,合成免疫原 BSA2RAC ,并用紫外
和凝胶电泳鉴定 ;用 BSA2RAC免疫 BalbΠC小鼠 ,细胞融合技术建立抗 RAC 单克隆抗体 (mAb) 杂交瘤细
胞株 ,体内诱生腹水法制备 RAC mAb。应用 RAC mAb 研制 RAC残留快速检测阻断 ELISA 试剂盒 (RAC2
Kit) ,并测定其性能。结果表明 ,BSA2RAC 偶联成功 ,分子结合比为 1∶2415 ;筛选出 3 株杂交瘤细胞 ,其
中最好的 4D8 株的亲和常数 Ka 为 1165 ×1010LΠmol。RAC2Kit 的标准曲线呈典型的 S 型 ,符合 4 参数
logit 曲线拟合 ,线性范围为 1～170μgΠL ,灵敏度为 0152μgΠL ,检测限为 1μgΠL ,饲料样、猪尿样的平均添加
回收率分别为 9111 %和 8912 % ,平均批内和批间变异系数 < 15 % ,与多巴酚丁胺的交叉反应率为
2213 % ,与其他化合物无交叉反应 ,RAC2Kit 在 4 ℃可保存 180d。
关键词 :莱克多巴胺 ; 人工免疫原 ; 单克隆抗体 ; 阻断 ELISA ; 快速检测试剂盒
GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AND DEVELOPMENT OF BLOCKING
ELISA KIT FOR RACTOPAMINE
ZHANG Hai2Tang1 　WANG Zi2liang1 　DENG Riu2Guang2 　ZHONG Hua1 　FAN Guo2Ying1
(11 College of Animal Science , Henan Institute of Science and Technology , Xinxiang , Henan 　453003 ;
21 Henan Provincial Key Laboratory for Animal Immunology , Zhengzhou , Henan 　450002)
Abstract :Mixed anhydridewas used to conjugate ractopamine (RAC) to bovine serum albumin (BSA) and obtained artificial
immunogen BSA2RAC identified by ultraviolet and SDS2PAGE. BalbΠC mice were immunized with BSA2RAC and hybridoma
lines that secrete monoclonal antibody against RAC (RAC mAb) were generated with cell fusion. A blocking ELISA kit for
detection RAC ( RAC2Kit) was developed with RAC mAb and its traits were tested. The results showed that BSA2RAC was
synthesized successfully and its conjugation ratio of RAC to BSA was about 2415∶11 Three hybridoma lines were screened and
the best one was 4D8 , its affinity constant Ka was 1165 ×1010LΠmol. The calibration curve of RAC2Kit was typical sigmoid
curve fitted to the 42parameter logistic equation with the linear detection of 1～170μgΠL , the sensitivity of 0152μgΠL and the
detection limit of 1μgΠL. The recoveries of RAC spiked in feed were 9111 % and in swine urine were 8912 %. The precision
and accuracy of the assay as determined by inter2assay and intra2assay coefficient variation were below 15 %. RAC2Kit had
2213 % cross2reactivity to dobutamine and cross2reactivity to other compounds. The validity of RAC2Kit in 4 ℃was above
180d.
Key words :ractopamine ; artificial immunogen ; monoclonal antibody ; blocking ELISA ; rapid test kit
收稿日期 :2008204204 　接受日期 :2008207208
基金项目 :“十一五”国家科技支撑计划重大项目”农药、兽药抗体库建立”资助 (2006BAK02A21Π1)
作者简介 :张海棠 (19662 ) , 女 , 河南偃师人 , 副教授 , 主要从事动物饲料卫生研究。E2mail :zhanght —1966 @yahoo. com. cn
通讯作者 :王自良 (19662) , 男 , 河南叶县人 ,博士 ,教授 ,主要从事食品安全生物技术研究。E2mail :wangzl —2008 @yahoo. com. cn　　莱克多巴胺 (Ractopamine ,RAC) 是苯乙醇胺类β22 肾上腺素受体激动剂 ,对人体具有心脏、生殖等毒性危
409　 核 农 学 报　2008 ,22 (6) :904～908 　Journal of Nuclear Agricultural Sciences
害作用[1 ] ,除美国 FDA 外 ,世界各国均禁止将 RAC 用
于动物生产。近年来 ,虽然我国政府加大了对非法使
用盐酸克伦特罗的打击力度 ,但 RAC 的非法使用现象
却日趋严重 ,加之 RAC 残留检测技术相对滞后 ,进一
步助长了 RAC 的非法使用。RAC 残留免疫学检测方
法以灵敏、准确、快速等优点替代了传统的理化分析方
法[2 ,3 ] ,美国 TCC 公司、比利时 Decov 公司已开发出相
关产品 ,国内尚未见报道。本研究应用细胞融合技术
在建立抗 RAC 单克隆抗体 (RAC mAb) 杂交瘤细胞株
的基础上 ,成功研制出 RAC 残留快速检测阻断 ELISA
试剂盒 (RAC2Kit) ,并对其性能进行了测定。
1 　材料与方法
111 　材料
BalbΠC小鼠购自郑州大学医学院。小鼠骨髓瘤细
胞株 NS0 由英国国家动物健康研究院惠赠。RAC 为
Sigma 产品 ;牛血清白蛋白 (BSA) 和卵清蛋白 (OVA) ,
Pierce 产品 ;弗氏佐剂 FCA、FIA 和细胞培养基 RPMI2
1640、HAT、HT ,Gibco 产品 ;其他试剂市售所得 ,AR 级 ;
羊抗鼠酶标二抗 ( GaRIgG2HRP) 为本课题组制备。用
0101molΠL pH714 的磷酸盐缓冲液 ( PBS) 稀释 ,配制不
同浓度的 RAC 标准液 ; ELISA 所用洗液 ( PBST) 为含
0105 % Tween220 的 PBS ,包被液为 0105molΠL pH916 的
碳酸盐缓冲液 (CBS) ,封闭液、稀释液为含 5 %猪血清
的 PBST(SPBST) ;酶底物为四甲基联苯胺的磷酸2柠檬
酸缓冲液 ;终止液为 2molΠL 的硫酸溶液。
112 　方法
11211 　免疫原的合成与鉴定 　参照 Shelver 等[4 ] 所述
的混合酸酐法合成免疫原 BSA2RAC。参照 Haasnootw
等[5 ]所述的 1 ,42丁二醚法合成包被抗原 OVA2RAC。
采用紫外和凝胶电泳进行鉴定。
11212 　细胞融合备用小鼠的选择 　BSA2RAC 免疫 6
周龄雌性 BalbΠC 小鼠 5 只 ,剂量为 50μgΠ只 (按 BSA2
RAC中 BSA 的量计算 ,体积为 012ml) ,背部皮下分点
注射 ,免疫程序参见文献[6 ] 。共免疫 5 次 ,最后 1 次免
疫后 10d 断尾采血分离血清 ,间接 ELISA 检测抗 RAC
多克隆抗体 ( RAC pAb) 效价[7 ] ,阻断 ELISA 检测 RAC
pAb 对 RAC的 50 %抑制浓度 ( IC50 ) ,挑选效价 < 1∶116
×103 且 IC50最低的小鼠 ,超免用于细胞融合。
11213 　杂交瘤细胞株的制备与亲和力测定 　细胞融
合、融合细胞培养及阳性杂交瘤筛选与克隆 ,按常规技
术操作。用体内诱生腹水法[8 ]制备 RAC mAb。用饱和
ELISA[9 ]测定其亲和常数 ( Ka) 。
11214 　RAC2Kit 的研制 　GaRIgG2HRP 和 RAC mAb 工
作浓度的确定采用方阵法[10 ] 。阻断 ELISA 方法的建
立 :第 1 步在酶标板上每孔加入 50μl 的 1μgΠml OVA2
RAC进行包被 ,37 ℃温育 2h ,PBST洗板 ;第 2 步每孔加
入 250μl 的 SPBST进行封闭 ,37 ℃温育 1h ,PBST 洗板 ;
第 3 步每孔加入 50μl 工作浓度的 RAC mAb ,同时等体
积加入 RAC 标准液 ,设阴性和空白对照 , 37 ℃温育
15min ,PBST 洗板 ;第四步每孔加入 50μl 工作浓度的
GaRIgG2HRP ,37 ℃温育 25min ,PBST 洗板 ;第 5 步每孔
加入 100μl 的酶底物 TMB 的磷酸 - 柠檬酸缓冲液显
色 ,室温反应 5min ,每孔加入 100μl 终止液 ,用酶标仪
读 A450值 ,记录结果。
11215 　绘制标准曲线并进行曲线拟合 　用阻断 ELISA
测定 RAC mAb 对 RAC 不同浓度标准液的抑制率 ,以
抑制率BΠB0 %(B 是 RAC不同浓度标准液的 A450值 ,B0
是 RAC零浓度标准液的 A450值)为 y 轴 ,以不同浓度标
准液的对数值 (lg[ RAC])为 x 轴 ,在半对数坐标图上绘
制标准曲线 ,推导回归方程 ,进行回归分析。
11216 　RAC2Kit 的配置 　用 OVA2RAC 包被并用
SPBST封闭的 8 ×12 孔酶标板 ,C1 液为工作浓度 RAC
mAb ,C2 液为工作浓度 GaRIgG2HRP ,C3、C4 液为底物
缓冲液 A、B ,C5 液为终止液 ,RAC不同浓度标准液 (浓
度分别为 011、013、019、217、811、2413 和 7219μgΠL) ,
PBST等。
11217 　待测样品的预处理 　饲料样品用研钵研碎 ,称
取 1010g ,加入 40ml PBS 和 5ml 1molΠL NaOH 溶液 ,充
分搅拌 30min , 4000rΠmin 离心 ,上清液用 5ml 1molΠL
HC1 调 pH值 712～714 ,加热浓缩至 10ml ,冷却至室温
后用于检测。猪尿样一般不需要特殊处理 ,可直接用
于检测 ,若浑浊不清 ,可 4000～6000rΠmin 离心 10min ,
取上清液用于检测。
113 　RAC2Kit 的性能测定
11311 　灵敏度 　按照刘智宏等[11 ] 阻断 ELISA 最低检
测限为 B0ΠB = 112 的方法 ,根据曲线回归方程计算出
RAC2Kit 的灵敏度 ,确定检测限。
11312 　准确度 　在饲料和猪尿中添加终浓度分别为
1、2、8 和 32μgΠL 的 RAC标准液 ,设 6 个重复 ,以回收率
和变异系数 (CV)确定其准确度。
11313 　精密度 　取不同批次的 6 批 RAC2Kit ,分别在 6
d 测定 RAC 浓度为 1、2、8、32μgΠL 的饲料样、猪尿样 ,
设 6 个重复 ,以批内和批间添加回收实验结果的 CV ,
确定其精密度。
11314 　特异性 　RAC2Kit 测定 RAC 与各竞争物的
IC50 ,按照 CR % = IC50 (RAC)ΠIC50 (竞争物) ×100 计算
509　6 期 莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断 ELISA 检测方法的建立
其交叉反应率 (CR %) 。
11315 　稳定性 　取同一批次的 RAC2Kit 保存于 4 ℃,
测定保存 6 个月中各月份的 A450 值、IC50 、R2 变化情
况 ,确定其稳定性。
2 　结果与分析
211 　免疫原的鉴定结果
21111 　紫外鉴定 　结果见图 1。BSA 最大吸收峰在
280nm ,RAC最大吸收峰在 272nm ,偶联后 ,其峰叠加并
位移至 276nm ,表明偶联成功 ;依据朗伯2比尔定律 ,推
算出 BSA2RAC的分子结合比为 1∶2415。
图 1 　BSA、RAC和 BSA2RAC的紫外扫描光谱
Fig. 1 　UV scanning spectrum of
BSA、RAC and BSA2RAC
21112 　凝胶电泳鉴定 　结果见图 2。BSA 的泳动速度
大于 BSA2RAC ,说明 BSA2RAC 的分子量大于 BSA ,证
明 RAC与 BSA 偶联成功 ;紫外凝胶成像系统分析软件
分析得出 ,BSA2RAC 的分子量为 7145 ×104 ,BSA 的分
子量为 6162 ×104 ,BSA 与 RAC 的分子结合比约为 1∶
2416 ,与紫外鉴定结果基本一致。
21113 　细胞融合选用小鼠的效价与 IC50 　效价测定
结果见图 3 , IC50测定结果见图 4。免疫的 5 只小鼠抗
体效价均达到了 10 - 3 ,说明获得了较好的免疫效果 ,
其中 2 号鼠最高为 1∶614 ×103 , IC50最低为 270μgΠL ,故
选择 2 号鼠用于细胞融合。
212 　杂交瘤细胞株的制备与亲和力测定
融合后 10d 观察融合效果 ,6 块细胞培养板 576 孔
中有杂交瘤细胞克隆形成的 528 孔 ,融合率为 9117 % ;
间接 ELISA 检测 ,阳性 84 孔 ,阳性率为 1416 % ;阻断
ELISA 筛选 ,3 次有限稀释法亚克隆后获得 8 株杂交瘤
细胞 ,分别测定其 IC50 ,筛选出 3 株高效价、敏感、特异
的杂交瘤 ,分别命名为 3F10、3H12、4D8。亲和力测定
图 2 　BSA2RAC的凝胶电泳图
Fig. 2 　Identification of BSA2RAC
conjugation by SDS2PAGE
图 3 　RAC pAb 效价测定曲线
Fig. 3 　The titers of RAC pAb by indirect ELISA
图 4 　RAC pAb 对 RAC的抑制曲线
Fig. 4 　Inhibitive curve of RAC pAb
against RAC by blocking ELISA
结果见图 5 ,3F10、3H12、4D8 所分泌的 mAb 与 BSA2
RAC结合达到 50 %饱和所需浓度分别为 3178、4171、
0197μgΠml , Ka 分别为 4122 ×109 、314 ×109 、1165 ×1010
LΠmol。根据 James 等[12 ] Ka 为 107 ～1012 LΠmol 为高亲
609 核　农　学　报 22 卷
和力抗体的理论 ,3 种 mAb 亲和力均较高 ,4D8 最好。
图 5 　RAC mAb 的亲和常数测定曲线
Fig. 5 　The association constant ( Ka) curve of RAC mAb
215 　阻断 ELISA 方法的建立
方阵法确定 GaRIgG2HRP 与 RAC mAb 的工作浓度
分别为 1∶10000 和 1∶1000。RAC2Kit 标准曲线见图 6 ,
曲线呈典型的 S 型 ,符合 4 参数 logit 曲线拟合 ,曲线回
归方程为 y = - 311952 x + 741171 , R2 = 019847 , IC50为
517μgΠL ,检测范围为 01159～170μgΠL。
图 6 　RAC2Kit 标准曲线
Fig. 6 　Calibration curve of RAC2Kit
216 　RAC2Kit 性能测定
21611 　灵敏度测定结果 　B0ΠB = 112 时所对应的 RAC
质量浓度为 0152μgΠL ,此为 RAC2Kit 的灵敏度 ,但考虑
到实际检测工作的需要和用户操作方面的误差 ,其检
测限确定为 1μgΠL。
21612 　准确度测定结果 　如表 1 所示 ,饲料样的 RAC
回收率在 8114 %～104 % ,平均 9111 % ,变异系数 (CV)
在 915 %～1316 % ,平均 1115 % ;猪尿样的 RAC 回收率
在 8316 %～95 % ,平均 8912 % ,CV 在 818 %～1217 % ,
平均 1016 % ;平均 CV 小于 15 % ,表明 RAC2Kit 具有较
高的准确度。
21613 　精密度测定结果 　如见表 2 所示 ,饲料样、猪
尿样的添加回收试验结果批内平均 CV 分别为
1115 %、1014 ,批间平均 CV 分别为 612 %、610 % ,批间
平均 CV 和批内平均 CV 均不超过 15 % ,表明 RAC2Kit
具有较高的精密度。
表 1 　RAC2Kit 添加回收试验
Table 1 　Recovery test of RAC added to different
samples by RAC2Kit
样品
sample
RAC添加量
amount of
RAC(μgΠL) 测定值measured value(μgΠL) 回收率recovery( %) CV( %)
110 1104 ±0118 104 ±18 1316
饲料 feed 210 1187 ±0124 9315 ±12 1212
810 6184 ±0196 8515 ±12 1017
3210 26105 ±3156 8114 ±1111 915
110 0195 ±0116 95 ±16 1217
尿液 urine 210 1182 ±0126 9112 ±13 1114
810 6196 ±1118 87 ±14175 916
3210 26175 ±4132 8316 ±1315 818
表 2 　RAC2Kit 的精密度测定( n = 6)
Table 2 　Precision of RAC measurement from different
samples by RAC2Kit
样品
sample
添加值
amount of RAC
(μgΠL) 测定值measured meanvalue (μgΠL) CV( %)批内inner batch 批间among batch
1 1102 ±0116 1315 717
饲料 feed 210 1183 ±0122 1214 615
810 6188 ±0192 1013 517
3210 2619 ±3162 918 419
015 0194 ±0115 1214 715
尿液 urine 210 1184 ±0123 1015 617
810 6183 ±1115 917 513
3210 26162 ±4141 819 416
21614 　特异性 　结果见表 3。RAC的 IC50为 517μgΠL ,
说明 RAC与其 mAb 能够特异性结合 ;与多巴酚丁胺的
CR %为 2213 % ,这是由于 RAC 与多巴酚丁胺结构非
常相似 ,具有相似的抗原识别位点 ,所以存在较高的
表 3 　RAC mAb 与 RAC类似化合物的交叉反应
Table 3 　The percent cross2reactivity of RAC mAb
with RAC analogous compounds
化合物
compounds
IC50
(μgΠL) 交叉反应率cross2reactivity( %)
莱克多巴胺 ractopamine 517 100
多巴酚丁胺 dobutamine 2516 2213
克伦特罗 clenbuterol > 614 ×103 < 0101
沙丁胺醇 salbutamol > 614 ×103 < 0101
肾上腺素 adrenalin > 614 ×103 < 0101
去甲肾上腺素 norepinephrine > 614 ×103 < 0101
异丙肾上腺素 isoprenaline > 614 ×103 < 0101
709　6 期 莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断 ELISA 检测方法的建立
交叉反应率 (CR %) ,但不影响试剂盒对 RAC 的特异
性。与其他化合物的 CR %小于 0101 %。
21615 　稳定性测定结果 　如表 4 ,随着 RAC2Kit 保存
期延长 ,各标准液的 A450值有所减小 ,但其 IC50 、R2 变
化不大 ,曲线拟合良好 ,说明 RAC2Kit 在 4 ℃180 d 保存
期内质量稳定。
表 4 　RAC2Kit 的保存期
Table 4 　Validity of RAC2Kit
保存时间 (d)
conservation days
IC50
(μgΠL) R2 最大吸光值Amax
1 5171 019845 01975
30 5174 019846 01956
60 6125 019821 01921
90 6158 019762 01874
120 7132 019745 01825
150 7171 019733 01783
180 7186 019738 01736
3 　讨论
311 　RAC人工免疫原的制备
自 Haasnootw 等 1994 年制备出 RAC 抗体以来 ,已
证实 RAC的抗原决定簇是两个苯酚中的酚羟基和亚
氨基结构 ,两个苯酚中的酚羟基之一可作为偶联位点 ,
因此 ,RAC人工免疫原的合成可采用两种方法 ,一是
1 ,42丁二醚法 ,碱性条件下 (pH1018) ,1 ,42丁二醚上游
离的环氧基团与酚羟基反应即可偶联 ;二是混合酸酐
法 ,RAC与戊二酸酐反应引入活性基团羧基 ,再与氯
甲酸异丁酯反应通过单酰胺键将其偶联起来。笔者进
行了对比试验[13 ] ,前者引入的间隔臂较长 ,为 13 个碳
原子位 ,容易产生桥抗体 ,后者以单酰胺键间隔臂 ,为
2 个碳原子位 ,长度适宜 ,效果更好 ,因此本试验采用
混合酸酐法。
312 　RAC mAb 的制备
抗体的免疫学特性主要体现于抗原抗体反应的结
合容量、亲和力和特异性三方面 ,结合容量以效价表
示 ,用间接 ELISA 测定 ,4D8 株腹水效价最高 ,达到 1∶
614 ×105 ;亲和力以 Ka 表示 ,测定 Ka 的方法有平衡
透析法、Scatchard plot 法和 Batty 饱和法等 ,本试验对 3
种方法进行了比较 ,结果基本一致 ,饱和法更为简单适
用 ,制备的 RAC mAb 的 Ka 为 1165 ×1010LΠmol ,为高亲
和力抗体。采用交叉反应试验鉴定其特异性 ,本试验
制备的 RAC mAb 对 RAC 具有较强的识别能力 ,与多
巴酚丁胺的 CR %为 2213 % ,与其他化合物无 CR ,具有
高价、敏感、特异的特点 ,可用于 RAC 残留检测的免疫
学实验。
313 　阻断 ELISA 方法的建立
本试验采用非均相间接竞争 ELISA 模式 ,可表示
为 :Ag + Ag 3 + mAb = AgmAb + Ag 3 mAb + Ag + Ag 3 +
mAb ,式中 Ag 为待测游离半抗原 ,Ag3 为包被抗原 ,
mAb 为半抗原单克隆抗体 ,AgmAb 为游离半抗原与特
异性抗体复合物 ,Ag3 mAb 为包被抗原与特异性抗体
复合物。将 Ag 3 包被于固相载体 ,Ag3 与 Ag 共同竞争
mAb 上的有限位点 ,反应达到平衡后洗脱多余的Ag 与
Ag 3 ,用 HRP 及其底物显色系统显示 AgmAb、Ag3 mAb
的结合情况 ,进而定量检测。经反复试验证实 ,本试验
系统准确度高、重复性好、特异性强 ,可用于 RAC 残留
检测。
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