全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022739206
收稿日期 :2007205214 　接受日期 :2008207208
基金项目 :“十一五”国家科技支撑计划 (2006BAK02A21)
作者简介 :刘宣兵 (19822) ,男 ,山东诸城人 ,硕士 ,主要从事兽药残留检测与食品安全研究。
通讯作者 :张改平 (19602) ,男 ,河南内黄人 ,博士生导师 ,研究员 ,主要从事动物免疫学和兽药残留研究。E2mail :zhanggaiping2003 @yahoo. com. cn
磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备
及其免疫学特性鉴定
刘宣兵1 ,2 　鲁晓翠1 ,2 　张改平1 　杨小保3 　侯玉泽2 　邓瑞广1
刘庆堂1 　职爱民1 　宋春美1 ,2
(11 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 ,河南 郑州　450002 ;21 河南科技大学食品与生物工程学院 ,河南 洛阳　471003 ;
31 河南新乡市牧野区畜牧局 ,河南 新乡　453003)
摘 　要 :用重氮化法将 SDM(磺胺二甲氧嘧啶)偶联于载体蛋白BSA 和OVA ,合成免疫原BSA2SDM 和包被
原 OVA2SDM ,并用紫外扫描 (UV) 、SDS2PAGE进行鉴定 ;用 BSA2SDM 免疫 BALBΠC小鼠 ,间接 ELISA 和阻
断 ELISA 选择细胞融合备用鼠 ;应用杂交瘤技术建立分泌 SDM mAb 细胞株 ,用体内诱生腹水法制备
SDM mAb ;对 SDM mAb 的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明 ,BSA2SDM
人工抗原制备成功 ,分子结合比约为 1∶1211 ;筛选出 1B4、3D9、4E1 共 3 株敏感特异的杂交瘤细胞 ,间接
ELISA 效价细胞培养上清分别为 1∶312 ×102 、1∶5112 ×102 、1∶811 ×102 ,腹水分别为 1∶2156 ×105 、1∶2156
×105 、1∶5112 ×105 ,4E1 亲和常数 ( Ka)为 1125 ×1010LΠmol ;4E1 株对 SDM 的 IC50为 16164ngΠml ,与磺胺 - 6
- 甲氧嘧啶交叉反应率为 5 % ,与其他磺胺类药物无交叉反应性。本试验获得了抗 SDM 高价、敏感、特
异的 mAb ,可用于 SDM 残留检测的免疫学试验。
关键词 :磺胺二甲氧嘧啶 ;单克隆抗体 ;免疫学特性
PREPARATION AND IMMUNOLOGICAL TRAIT OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR SULFADIMETHOXINE
LIU Xuan2bing1 ,2 　LU Xiao2cui1 ,2 　ZHANG Gai2ping1 　YANG Xiao2bao3 　HOU Yu2ze2
DENG Rui2guang1 　LIU Qing2tang1 　ZHI Ai2min1 　SONG Chun2mei1 ,2
(11 Henan Key Laboratory for Animal Immunology , Agricultural Academy of Henan Province , Zhengzhou , Henan 　450002 ;
21 Food and Bioengineering College , Henan University of Science and Technology , Luoyang , Henan 471003 ;
31Bureau of Husbandry , the Zone of Xinxiang Muye , Xinxiang , Henan 　453003)
Abstract :Diazotization was used to conjugate sulfadimethoxine ( SDM) to carrier protein BSA and obtained immunizing
antigen. The coating antigen OVA2SDM was obtained in the same way , ultraviolet (UV) and SDS2PAGE were used to identify
SDM artificial antigen. BALBΠC mice were immunized with BSA2SDM , the titre of polyclonal antibody (pAb) was detemined
by indirect ELISA and blocking ELISA. The hybridoma lines that secrete SDM mAb were established with using monoclonal
antibody hybridoma technology. The immunological traits such as titer , affinity , sensitivity and specificity of the mAb were
characterized. The results showed that SDM artificial antigen was synthesized successfully and its conjugation ratio of SDM to
BSA was about 1211∶1 , three hybridoma cell lines of 1B4 ,3D9 ,4E1 were screened for specificity to SDM ,the indirect ELISA
titer of the mAb were 1∶312 ×102 , 1∶5112 ×102 , 1∶8110 ×102 in supernatant ; 1∶2156 ×105 , 1∶2156 ×105 , 1∶5112 ×105
in ascites , the affinity constant ( Ka)of 4E1 was about 1125 ×1010LΠmol ,the mAb of 4E1 showed good sensitivity with the IC50
of 16164ngΠml to SDM , 5 % cross2reactivity to sulfamonomethoxine and little or no cross2reactivity to other compounds. SDM
937　核 农 学 报　2008 ,22 (5) :739～744Journal of Nuclear Agricultural Sciences
mAb of high2titer , sensitivity and specificity had been generated and made it possible to establish immunoassay of SDM
residues in feed and animal food.
Key words :sulfadimethoxine ; monoclonal antibody ; immunological traits
　　磺胺二甲氧嘧啶 (Sulfadimethoxine ,SDM) 是一种长
效磺胺类药 ,具有较强的抗细菌及原虫感染的作用 ,常
用作饲料添加剂及畜禽疾病的治疗和预防[1 ] ,但具有
的一定毒性 ,对食品卫生、人体健康具有潜在危害性。
因此 ,磺胺二甲氧嘧啶在肉类、乳类、禽蛋等食品性动
物组织中的残留问题备受关注。我国农业部 2002 年
发布的《动物性食品中兽药最高残留量》规定了动物性
食品中磺胺类药物最大残留量为 011μgΠg[2 ] ,2005 年把
畜产品中磺胺类药物的残留作为继盐酸克伦特罗之后
的又一个监控重点。目前所用的检测 SDM 的方法存
在费时、不能现场操作 ,且所用仪器昂贵 ,样品前处理
复杂等缺陷。免疫学分析方法则因具灵敏、快速、特
异、简便等优点 ,近年来在兽药、农药残留检测领域被
广泛应用[3 ] 。本研究应用 SDM 人工抗原免疫 BALBΠC
小鼠 ,建立分泌抗 SDM 单克隆抗体 (mAb) 的杂交瘤细
胞株 ,为免疫学检测方法的建立和拥有自主知识产权
检测产品的开发奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　试剂与溶液　SDM ,Sigma 产品 ,纯度 ≥9910 % ;
牛血清蛋白 (BSA) 和鸡卵清蛋白 (OVA) , Pierce 产品 ;
弗氏完全佐剂 ( FCA) 、弗氏不完全佐剂 ( FIA) ,选择培
养基 HAT、HT , PEG21500 ,均为 Gibco 产品 ; 3 ,3′,5 ,5′2
四甲基联苯胺 ( TMB) , Sigma 产品 ;羊抗鼠酶标二抗
( GaMIgG2HRP) ,华美生物工程有限公司产品 ;试验用
水为超纯水 ,本实验室制备 ;其他试剂市售所得 ,均为
分析纯。
SDM 标准液以 0101molΠL pH714 的磷酸盐缓冲液
(PBS)为稀释液 ,根据需要配制 ;洗液 ( PBST) 为 PBS 含
0105 %Tween220 ;包被液 (CBS) 为 011molΠL pH916 的碳
酸盐缓冲液 ;间接 ELISA 和阻断 ELISA 的封闭液、稀释
液为含 5 %猪血清的 PBST;酶底物为 TMB 的磷酸 - 柠
檬酸缓冲液 ;终止液为 2molΠL 的硫酸溶液。
11112 　主要仪器 　DU2600 核酸蛋白分析仪 ,德国
BECKMAN 公司 ; 550 型酶标仪 ,美国 Bio2Rad 公司 ;
AE260 电子天平 ,德国 METTLER 公司 ;HI9321 酸度计 ,
美国 HANNA 公司 ; 3K218 高速冷冻离心机 , 德国
SIGMA 公司 ;凝胶成像系统及分析软件 ,Syngene 公司 ;
JM2250 电泳仪 ,大连捷迈科贸有限公司 ;SZ293 自动双
重纯水蒸馏器 ,9323 定时恒温双向磁力搅拌器 ,上海亚
荣生化仪器厂。
11113 　试验动物和细胞　无特定病原体 (SPF) 级 6 周
龄 BALBΠC小鼠 ,购自郑州大学医学院实验动物中心 ,
在本实验室饲养 ;小鼠骨髓瘤细胞株 NS0 由英国国家
动物健康研究院惠赠。
112 　方法
11211 　人工抗原的合成 　SDM2BSA 完全抗原的合成
参照 Fleeker 和 Lovett 的重氮化法[4 ] 并加以改进。称
SDM 62mg ( 012mmol ) 置于 10ml 螺口瓶中 ,溶于 4ml
1molΠL HCl ,70 ℃水浴加热溶解 ,冰浴冷却后 ,边搅拌边
逐滴加入现配的 1molΠL NaNO2 014ml ,4 ℃反应 6h ,得重
氮化 SDM。BSA 30mg 溶于 2ml 无菌的 PBS ,边搅拌边
逐滴加入重氮化 SDM ,用 1molΠL NaOH调 pH值至 9 左
右 ,4 ℃反应过夜。反应产物 4 ℃搅拌下用 PBS 透析
3d ,每天换液 2 次 ,以除去未反应的小分子物质 SDM、
NaNO2 、Na2 CO3 、NaHCO3 等。透析后得到的 SDM2BSA
经紫外光谱扫描鉴定 ,冻干后 - 20 ℃保存供免疫用。
合成路线见图 1。同法制得包被抗原 OVA2SDM。
图 1 　重氮化法合成 BSA2SDM路线图
Fig. 1 　Synthesis scheme of BSA2SDM by diazotization
047 核　农　学　报 22 卷
11212 　人工抗原的鉴定　UV 鉴定 :用 PBS 配制 SDM
和 BSA 标准溶液 ,取一定量的 BSA2SDM 溶于 PBS ,用
Braford 法[5 ] 测定其蛋白质的浓度 ,据此浓度调节 BSA2
SDM溶液中蛋白质的浓度与 BSA 标准溶液一致 ,在波
长 200～400nm 范围内进行紫外扫描 ,参照杨利国[6 ] 所
述方法计算 BSA 与 SDM 的分子结合比。
SDS2PAGE 鉴定 :参照文献 [7 ]介绍的方法配制各
种电泳溶液 ,浓缩胶浓度为 5 % ,电压 70 V ,分离胶浓
度为 10 % ,电压 85V ,上样量为 20μl ,考马斯亮蓝染色 5
- 6h 后 ,置脱色液中过夜脱色。紫外凝胶成像系统分
析软件计算 BSA 与 SDM 的分子结合比[8 ] 。
11212 　小鼠多抗血清 (pAb)效价测定
1121211 　小鼠免疫　用 BSA2SDM 免疫 6 周龄 BALBΠC
小鼠 4 只 ,剂量 50μg·012mlΠ只 ,背部皮下分点注射。
首次免疫 ,用无菌 PBS 溶解 BSA2SDM ,与等量 FCA 混
合 ,充分乳化 ;加强免疫 ,用无菌 PBS 溶解 BSA2SDM ,
与等量 FIA 混合 ,乳化 ,首次免疫后 4 周进行 ,共免 4
次 ,每次间隔 2 - 6 周 ,最后 1 次免疫后 10d 断尾采血
分离血清 ,用间接 ELISA 检测抗 SDM 抗体效价 ,若效
价 < 116 ×10 - 3 即可用于细胞融合[9 ] ;超强免疫 ,用无
菌 PBS 溶解 BSA2SDM ,最后 1 次加强免疫后 4 - 30 周 ,
细胞融合前 3 - 5d ,尾静脉与腹腔各注射 BSA2SDM
50μg·200μlΠ只。
1121212 　小鼠抗血清效价、敏感性测定　间接 ELISA
测定 pAb 的效价 ,阻断 ELISA 测定抗血清对 SDM 的
50 %抑制浓度 ( IC50 ) ,并以 IC50作为敏感度。
11213 　杂交瘤细胞株的建立
1121311 　细胞融合 　用 RPMI - 1640 完全培养液培养
NS0 骨髓瘤细胞 ,于融合前 2d 传代培养 ;融合前 1d 制
备 BALBΠC小鼠饲养细胞 ;小鼠超强免疫后 4d ,摘除眼
球 ,眶下窦采血 ,分离阳性血清 ;脱颈致死小鼠 ,无菌取
脾脏制备脾细胞 ,在 50 %PEG - 1500 作用下与 NS0 细
胞融合 ;将融合后的细胞悬液加到已铺有饲养细胞层
的 96 孔细胞培养板中 ,用 HAT 选择培养基置于 37 ℃
5 % CO2 培养箱培养[10 ] 。
1121312 　融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克
隆 　融合细胞于第 7 天用 HAT培养液半量换液 ,第 14
天用 HT培养液培养 ;用间接 ELISA 和阻断 ELISA 进行
阳性孔筛选 ,选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的
孔进行有限稀释克隆化 ,而后扩大培养、冻存、鉴定和
建株。
1121313 　mAb 生产 　体内诱生腹水法生产 mAb[11 ] 。
将建株后的细胞扩大培养至数量达 1 ×106 个Πml ,收集
并测定细胞 ELISA 效价 ;将灭菌液体石蜡注入 8 周龄
BALBΠC小鼠腹腔 015mlΠ只 ,10d 后注入克隆化阳性细
胞 3～6 ×106 个Π只 ,10d 后抽取腹水 ,用饱和硫酸铵盐
析法纯化 mAb ,DU - 600 核酸 - 蛋白分析仪测定 mAb
含量。
11214 　mAb 免疫学特性鉴定
1121411 　效价测定　间接 ELISA 测定其效价。
1121412 　亲和性鉴定　参照 Batty[12 ] 所述方法测定亲
和常数 ( Ka) 。浓度分别为 2μgΠml 和 1μgΠml 的 BSA2
SDM用 CBS 液稀释后 ,每孔 50μl 加到酶标板上 ,加入
倍比稀释的 mAb ,再加入 HRP 标记的抗鼠 IgG,TMB 显
色测 OD450 值 ,以 mAb 浓度为横坐标 ,OD450 值为纵坐
标 ,绘出相应的 2 条间接 ELISA 反应曲线 ,以每条曲线
上部平坦段的 OD450值作为 100 % ,在曲线上算出 50 %
OD450值时对应的 mAb 浓度 ,按照公式 Kaff = ( n - 1)Π2
( n[Ab’] t - [ Ab ] t) 计算亲和常数 ,其中 n = [ Ag ] tΠ
[Ag’]t ,[Ag]t、[Ag’]t 为 2 个不同的包被原浓度 , [Ab ]
t、[Ab’]t 为包被原浓度对应的抗体浓度。
1121413 　敏感性鉴定　用阻断 ELISA 测定 4E1mAb 对
不同浓度 SDM 的抑制率 ,以吸光值比值 BΠB0 (B 是
SDM不同标准浓度的 OD450 值 ,B0 是不含 SDM 时的
OD450值)为纵坐标 ,不同浓度 SDM 的对数值为横坐标 ,
绘制标准抑制曲线 ,进行相关回归分析 ,计算 mAb 对
SDM 的 IC50 。
1121414 　特异性鉴定　SDM 及其同系磺胺类药物、结
构相似物作为抑制剂 ,用阻断 ELISA 测定各抑制物的
IC50 ,以 mAb 对 SDM 的 IC50与各抑制物的 IC50之比的百
分数为其交叉反应率 (CR %) 。
2 　结果
211 　人工抗原鉴定结果
UV 鉴定结果见图 2。图 2 表明 ,BSA 的特征峰在
278nm ,SDM 的最大吸收峰在 266nm ,BSA 与 SDM 偶联
后 ,两者的峰叠加并位移至 267nm ,表明偶联成功 ;依
据朗伯 - 比尔定律 ,推算出 BSA 与 SDM 的分子结合比
为 1∶1211。
SDS2PAGE鉴定结果见图 3。图 3 表明 ,BSA 的泳
动速度大于 BSA2SDM ,说明 BSA2SDM 的分子量大于
BSA ,证明偶联成功 ;用紫外凝胶成像系统分析软件分
析得出 ,BSA2SDM 的分子量为 7102 ×104 ,BSA 的分子
量为 6162 ×104 ,BSA 与 SDM 的分子结合比约为 1∶
1218 ,与 UV 鉴定结果基本一致。
212 　小鼠血清效价敏感性测定结果
147　5 期 磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定
图 2 　BSA、SDM和 BSA2SDM的紫外扫描光谱
Fig. 2 　UV scanning spectrum of
BSA ,SDM and BSA2SDM
图 3 　BSA2SDM偶联的 SDS2PAGE鉴定
Fig. 3 　Identification of BSA2SDM
conjugation by SDS2PAGE
间接 ELISA 效价如图 4 所示 ,免疫的 4 只小鼠血
清抗体效价均达到了 10 - 3 ,说明获得了较好的免疫效
果 ,其中 3 号鼠血清效价最高。同时由图 5 可知 ,3 号
小鼠的线性回归直线方程为 y = - 012954 x + 01859 ,
从方程可以计算出 3 号小鼠多抗的 IC50为 1164μgΠml ,
均低于其他小鼠。3 号小鼠的效价最高且 IC50最低 ,选
作细胞融合备用鼠。
213 　杂交瘤细胞株的建立
细胞融合后 10d 观察融合效果 ,4 块细胞培养板
384 孔中有杂交瘤克隆形成的有 334 孔 ,融合率为
87 % ;间接 ELISA 检测 ,阳性 55 孔 ,阳性率为 1615 % ;3
次亚克隆后获得 11 株杂交瘤 ,分别测定其 IC50 ,筛选
出 3 株杂交瘤 ,分别命名为 1B4、3D9、4E1 ,经多次传
代、冻存及复苏 ,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
214 　mAb 免疫学特性鉴定结果
21411 　效价测定结果　由表 1 可知 ,杂交瘤分泌的抗
图 4 　小鼠血清效价
Fig. 4 　Titer curve of BALBΠC mice antisera
图 5 　间接抑制 ELISA 检测小鼠血清对 SDM的抑制曲线
Fig. 5 　Inhibition curve of mice
sera to SDM by indirect ELISA
SDM mAb 具有较高的效价 ,其中 4E1 株效价最高 ,细
胞培养上清和腹水效价分别达到了 1∶8110 ×102 和
1∶5112 ×105 。
表 1 　SDM mAb 的间接 ELISA 效价
Table 1 　The indirect ELISA titer of anti2SDM mAb
单克隆抗体
mAb
细胞培养上清
supernatant
腹水
astices
1B4 1∶312 ×102 1∶2156 ×105
3D9 1∶5112 ×102 1∶2156 ×105
4E1 1∶8110 ×102 1∶5112 ×105
21412 　亲和力鉴定结果 　由图 6 可知 ,4E1 mAb 与 2
种不同浓度的包被抗原结合达到饱和的 50 %所需
mAb 的浓度分别为 1160、0183μgΠml ,其 Ka 为 1125 ×
1010LΠmol。依据 James 等[13 ] 的结论 ,亲和常数为 107～
1012LΠmol 抗体亲和力高 ,结果表明本试验制备的 mAb
亲和力较高 ,适合于 ELISA 方法检测。
247 核　农　学　报 22 卷
图 6 　SDM mAb 的亲和常数测定曲线
Fig. 6 　The association constant (ka) curve of SDM mAb
21413 　敏感性鉴定结果 　4E1 mAb 标准抑制曲线的
线性回归方程为 y = - 013876 x + 019733 ,根据回归方
程计算出 4E1 mAb 对 SDM 的 IC50 为 16164ngΠml ,本试
验所获 mAb 对 SDM 具有较高的敏感性 (图 7) 。
图 7 　阻断 ELISA 检测 SDM IC50
Fig. 7 　IC50 inhibitive curve of SDM
mAb by competitive ELISA
21414 　交叉反应试验结果　由表 2 可知 ,SDM 的 IC50
为 16164ngΠml ,说明 SDM 对其 mAb 结合反应的特异性
很强 ;除与磺胺 - 6 - 甲氧嘧啶交叉反应率为 5 %外 ,
与其他磺胺类、链霉素交叉反应率均小于 015 %。结
果表明 ,SDM mAb 对 SDM 及其同系物有较好的特异
性。
3 　讨论
311 　关于 BSA2SDM 完全抗原的设计
SDM 属于小分子物质 ,分子量为 31013 ,不具备 2
种抗原表位 ,即 T 细胞表位和 B 细胞表位 ,而诱导机
体产生免疫反应 ,必须同时具备 2 种表位[14 ] 。针对以
上情况 ,在制备药物抗原免疫动物制备抗血清中 ,必须
将药物与载体偶联 ,这样免疫动物才会产生针对药物
的抗体。由于 SDM 存在活性基团伯氨基 ,通过重氮化
反应 ,与 BSA 相连 ,偶联合成完全抗原 BSA2SDM。
表 2 　SDM mAb 与 SDM类似化合物的交叉反应
Table 2 　The cross2reactivity of SDM
mAb with SDM analogous
化合物
compound
半数抑制浓
度 IC50 (ngΠml) 交叉反应性cross2reactivity( %)
磺胺二甲氧嘧啶 sulfadimethoxine (SDM) 16164 100
磺胺间甲氧嘧啶 sulfamonomethoxine (SMM) 300 5
磺胺嘧啶 sulfadiazine (SD) > 312 ×103 < 015
磺胺二甲基嘧啶 sulfamethazine (SM2) > 312 ×103 < 015
磺胺甲　唑 sulfamethoxazole (SMZ) > 312 ×103 < 015
磺胺一甲基嘧啶 sulfamerazine (SM1) > 312 ×103 < 015
链霉素 streptomycin (STM) > 312 ×103 < 015
磺胺喹　啉 sulfaquinoxaline (SQ) > 312 ×103 < 015
312 　关于单克隆抗体的大量制备
一般的单克隆抗体 ,多采用动物体内诱生法制备。
在接种杂交瘤细胞的前 10d ,给小鼠注射灭菌液体石
蜡、降植烷或弗氏不完全佐剂 ,其原理是液体石蜡等腹
水刺激剂能有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫
功能 ,使小鼠能更好地接纳腹腔中具有恶性生长特性
的杂交瘤。在这种环境中 ,杂交瘤将逐步增殖 ,并分泌
抗体于腹水中。本试验采用无菌液体石蜡预处理小
鼠 ,10d 后注射杂交瘤 ,10d 后收集腹水 , 获得较好的
效果[15 ] 。
本研究成功合成了 SDM 人工抗原 ,经 4 次免疫
BALBΠC小鼠后获得了高效价的 pAb ,通过杂交瘤技术
获得 3 株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞 ,经多次
传代、冻存与复苏 ,杂交瘤分泌抗体稳定 ,经鉴定制备
出的 SDM mAb 高价、敏感、特异 ,可以用于 SDM 残留
检测的免疫学试验。
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2008 ,22 (5) :739～744