全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042336205
抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的
建立及其免疫学特性鉴定
王自良1 　张改平2 　杨艳艳2 　张海棠1 　王选年1 　邓瑞广2
(1 河南科技学院动物科学学院 ,河南 新乡　453003 ;2 河南省动物免疫学重点实验室 ,河南 郑州　450002)
摘 　要 :苯巴比妥 (PB)经化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基 ,合成半抗原对氨基苯巴比妥 (pAPB) ,
用重氮化法将 pAPB 偶联于 BSA ,合成人工抗原 BSA2pAPB ,并用红外 ( IR) 、紫外 (UV) 、SDS2PAGE 鉴定 ;
用 BSA2pAPB 免疫 BalbΠC小鼠 ,细胞融合技术建立抗 PB 的单克隆抗体 mAb ( PB mAb) 杂交瘤细胞株 ,体
内诱生腹水法制备 PB mAb ,并鉴定其免疫学特性。结果表明 ,BSA2pAPB 偶联成功 ,偶联率为 1∶19 ;筛选
出 1B9、3C4、3F6、4E6 共 4 株杂交瘤细胞 ,其中最好的 4E6 株间接 ELISA 效价细胞培养上清为 1∶811 ×
102 ,腹水为 1∶614 ×105 ,同种型为 IgG1Πκ,亲和常数 ( Ka) 为 2108 ×1010 LΠmol ,对 PB 的半数抑制浓度
( IC50 )为 11135μgΠL ,与巴比妥的交叉反应率 (CR %)为 1214 % ,与其他化合物无 CR。本试验研制出高效
价、敏感、特异的 PB mAb ,可用于 PB 残留检测的免疫学实验。
关键词 :苯巴比妥 ; 半抗原 ; 人工抗原 ; 单克隆抗体 ; 免疫学特性
GENERATION AND IMMUNOLOGICAL TRAITS OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR PHENOBARBITAL
WANG Zi2liang1 　ZHANG Gai2ping2 　YANG Yan2yan2 　ZHANG Hai2tang1 　WANG Xuan2nian1 　DENG Rui2guang2
(1 College of Animal Science , Henan Institute of Science and Technology , Xinxiang , Henan 　453003 ;
2 Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology , Zhengzhou , Henan 　450002)
Abstract : The active group amido was introduced to phenyl of PB and formed p2amidophenobarbital (pAPB) which has hapten
structure by chemical modification. Diazotization was used to conjugate pAPB to BSA and obtained artificial antigen BSA2pAPB
identified by Infrared ( IR) , ultraviolet (UV) and SDS2PAGE. BalbΠc mice were immunized with BSA2pAPB and hybridoma
lines that secrete monoclonal antibody against PB (PB mAb) were generated with cell fusion and filtered by indirect ELISA and
blocking ELISA , the immunological traits of PB mAb were characterized. The results showed that BSA2pAPB was synthesized
successfully and its conjugation ratio of pAPB to BSA was about 19∶11 Four hybridoma lines of 1B9 , 3C4 , 3F6 and 4E6 were
filtered and the best one was 4E6 , which secrete PB mAb with indirect ELISA titers of 1∶811 ×102 in supernatant and 1∶614
×105 in ascites , the isotype of the mAb was IgG1Πκand its affinity constant ( Ka) was 2108 ×1010 LΠmol. The mAb showed
good sensitivity with an IC50 of 11135μgΠL to PB , 1214 % cross2reactivity (CR %) to Barbital and little or no CR to other
compounds. PB mAb of high2titer , sensitivity and specificity has been generated and made it possible to establish immunoassay
of PB residues in animal food.
Key words :phenobarbital ; hapten ; artificial antigen ; monoclonal antibody ;immunological traits
收稿日期 :2005211209
基金项目 :国家“863”项目 (2001AA249030)
作者简介 :王自良 (19662) , 男 , 副教授 , 博士 , 研究方向为动物性食品安全生物技术。Email : WangZL
-
2008 @Yahoo. com. cn。张改平为通讯作者。
　　苯巴比妥 ( Phenobarbital , PB) 由于具有致畸、致癌
等毒性作用[1 ] ,其在动物性食品中的残留严重危害着
人体健康 ,世界各国均严禁 PB 用于食品动物[2 ] 。免疫
学分析方法以其灵敏、特异、快速、简便等特点广泛应
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用于药物残留检测 ,德国 Dade Behring 公司等已开发
出 PB 残留检测相关产品。合格的抗体是建立免疫学
分析方法的基础 ,本研究旨在制备出高效价、敏感、特
异的 PB 单克隆抗体 (PB mAb) ,为 PB 残留免疫学检测
方法的建立奠定基础。
1 　材料与方法
111 　动物、细胞、试剂与溶液
BalbΠC小鼠购自郑州大学医学院 ;小鼠骨髓瘤细
胞株 NS0 由英国国家动物健康研究院惠赠 ; PB ,Sigma
产品 ;BSA 和 OVA ,mAb 同种型试剂盒 ,Pierce 产品 ;弗
氏佐剂 FCA、FIA ,细胞培养基 RPMI21640、HAT、HT ,
Gibco 产品 ;Sephadex G225 ,Pharmacia 产品 ;羊抗鼠酶标
二抗 ( GaMIgG2HRP) ,由本实验室制备 ;其他试剂市售 所得 , AR 级。用 0101molΠL pH714 的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释配制不同浓度的 PB 标准液 ; ELISA 所用洗液 ( PBST) 为 PBS 含 0105 % Tween220 ,包被液为 0105molΠL pH916 的碳酸盐缓冲液 (CBS) ,封闭液、稀释液为含 5 %猪血清的 PBST;酶底物为四甲基联苯胺的磷酸2柠檬酸缓冲液 ;终止液为 2molΠL 的硫酸溶液。112 　人工抗原的合成与鉴定11211 　半抗原的合成 　首先 ,硝化反应引入硝基 ,取1mmol PB ,加入 5mmol HNO3 和 5mmol H2 SO4 混酸溶液 ,55 ℃密闭反应 1h ,加入 5 倍重蒸水 ,5000rpm 离心5min ,沉淀物干燥备用 ,产物为 pNPB ;之后 ,还原反应引入氨基 ,取 1mmol pNPB 溶解于 10mL 1 molΠL HCl 中 ,加入 Zn 粉 3mmol ,65 ℃密闭反应 40min ,加入 5 倍重蒸水 ,5000rpm 离心 5min ,沉淀物干燥备用 ,产物为 pAPB。合成路线见图 1。
图 1 　半抗原 pAPB 合成路线图
Fig. 1 　Synthesis scheme of hapten pAPB by nitration and deoxidization
11212 　人工抗原的合成 　逆式重氮化法[3 ] 合成人工
抗原 BSA2pAPB。取 50mg pAPB 溶于 1ml 1molΠL NaOH
溶液 ,加入 100mg NaNO2 ,冰浴条件下用 1molΠL HCl 调
pH 为 1 ,密闭 ,避光 , 4 ℃搅拌反应 6 h ;加入预冷的
20mg BSA 0101molΠL pH714 的 PBS 溶液 ,4 ℃搅拌反应 12h。反应液用 Sephadex G225 过柱纯化 ,TLC 监测 ,收集 Rf = 0112 组分 ,制得人工抗原 BSA2pAPB , - 20 ℃保存备用。合成路线见图 2。同法制得包被抗原 OVA2pAPB。
图 2 　重氮化法合成 BSA2pAPB 路线图
Fig. 2 　Synthesis scheme of BSA2pAPB by diazotization
11213 　人工抗原的鉴定 　(1) IR 鉴定 :取 BSA2pAPB
2mg ,加入干燥剂 KBr 约 200mg ,置于玛瑙乳钵中 ,在红
外灯照射下研磨混匀 ,装入压片模具 , 8t 压力下 10
min ,制得厚度 1 mm 的透明 KBr 样品片 ,上机测试。
(2) UV 鉴定 :用 PBS 配制 pAPB 和 BSA 标准溶液 ,取一
定量的 BSA2pAPB 溶于 PBS ,用 Braford 法[4 ] 测定 BSA
浓度 ,并调节 BSA 浓度与 BSA 标准溶液一致 ,在波长
200～350nm 进行紫外扫描 ,参照杨利国[5 ] 所述方法计
算BSA 与 pAPB 的偶联率。(3) SDS2PAGE 鉴定参照
Kammps 等[6 ]的方法。
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113 　细胞融合备用小鼠的选择
用 BSA2pAPB 免疫 6 周龄雌性 BalbΠC 小鼠 5 只 ,
剂量 50μg·012 mlΠ只 ,背部皮下分点注射。首免用无
菌 PBS 稀释 BSA2pAPB ,与等量 FCA 混合乳化 ;加强免
疫用无菌 PBS 稀释 BSA2pAPB ,与等量 FIA 混合乳化 ,
共免疫 5 次 ,每次间隔 4 周 ,最后 1 次免疫后第 10 天
断尾采血分离血清 ,间接 ELISA 检测血清抗体效价[7 ] ,
阻断 ELISA 检测其抑制效价[8 ] 。选择效价 < 1∶1600 且
抑制效价最低的小鼠用于细胞融合。
114 　细胞融合与杂交瘤细胞株的筛选
11411 　细胞融合 　融合前 2d 用 RPMI21640 传代培养
NS0 细胞 ,前 1d 用 HAT培养滋养细胞。对细胞融合备
用小鼠进行超免 ,尾静脉与腹腔各注射 BSA2pAPB 50
μg·012 mLΠ只 ,超免后第 4 天 ,摘除眼球采血 ,分离阳
性血清 ,脱颈致死小鼠 ,无菌取脾脏制备脾细胞 ,在
PEG24000 作用下与 NS0 细胞融合 ,将融合后的细胞悬
液加到已铺有滋养细胞层的 96 孔细胞培养板中 ,HAT
培养。
11412 　杂交瘤细胞株的筛选 　融合细胞共培养 14d ,
分别于第 4、7、10 天用 HAT 换液 ,第 14 天起用 RPMI2
1640 培养并用间接 ELISA 和阻断 ELISA 进行阳性杂交
瘤细胞筛选 ,选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的
孔用有限稀释法亚克隆 ,而后扩大培养、冻存并鉴定。
115 　PB mAb 的制备及免疫学特性鉴定
11511 　PB mAb 的制备 　体内诱生腹水法[9 ] 。
11512 　PB mAb 的免疫学特性鉴定 　杂交瘤核型分析
用秋水仙素阻断法[10 ] ;同种型鉴定按试剂盒说明操
作 ;间接 ELISA 法测定效价 ; Batty 饱和法[11 ] 测定亲和
力常数 ( ka) ;阻断 ELISA 测定 PB mAb 对 PB 的半数抑
制浓度 ( IC50 ) ,以 IC50 衡量敏感性 ; PB 及巴比妥类、镇
静类药物作抑制物 ,阻断 ELISA 测定其 IC50 ,以 PB mAb
对 PB 的 IC50与各抑制物的 IC50的百分比为其交叉反应
率 (CR %) 。
2 　结果与分析
211 　人工抗原鉴定
21111 　IR 鉴定 　结果见图 3。将BSA2pAPB 与BSA 的
IR 比较 ,在 2500～3200 cm- 1和 1660～1500 cm - 1 具有
相似的吸收 ,这是 BSA 中氨基酸产生的特征峰 ,说明
合成的BSA2pAPB 中含有BSA ;再将BSA2pAPB 与 pAPB
的 IR 比较 ,它们在 1070 cm - 1具有相似的吸收 ,而 BSA
在此处无吸收 ,这是 BSA2pAPB 中 N = N 键的特征峰 ,
说明 BSA2pAPB 中有 pAPB 存在。据此确定 BSA2pAPB
偶联成功。
图 3 　BSA、pAPB 和 BSA2pAPB 的红外扫描光谱
Fig. 3 　The IR spectra of BSA2pAPB ,BSA and pAPB
21112 　UV 鉴定 　结果见图 4。BSA 与 pAPB 的最大
吸收峰分别在 280 和 264 nm ,两者偶联后 ,其峰叠加并
位移至 268 nm ,表明偶联成功 ;依据朗伯2比尔定律 ,推
算出 BSA2pAPB 的分子结合比为 1∶1917。
图 4 　BSA、pAPB 和 BSA2pAPB 的紫外扫描光谱
Fig. 4 　UV scanning spectrum of
BSA、pAPB and BSA2pAPB
21113 　SDS2PAGE 鉴定 　结果见图 5。BSA 泳动速度
大于 BSA2pAPB ,说明 BSA2pAPB 的相对分子质量 ( Mr)
大于 BSA ,证明 pAPB 与 BSA 偶联成功 ;用紫外凝胶成
像系统分析软件分析得出 ,BSA2pAPB 的 Mr 为 7109 ×
104 ,BSA 的 Mr 为 6162 ×104 ,BSA 与 pAPB 的分子结合
比约为 1∶1913 ,与 UV 鉴定结果基本一致。
212 　细胞融合备用小鼠的选择
效价测定结果见图 6 , IC50测定结果见图 7。免疫
的 5 只小鼠抗体效价均达到了 10 - 3 ,说明获得了较好
的免疫效果 ,其中 3 号鼠最高为 1∶1128 ×104 , IC50最低
为 545μgΠL ,适合用于细胞融合。
213 　杂交瘤细胞株的建立
833 核　农　学　报 20 卷
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图 5 　BSA2pAPB 偶联的 SDS2PAGE鉴定
Fig. 5 　Identification of BSA2pAPB
conjugation by SDS2PAGE
图 6 　PB pAb 效价曲线
Fig. 6 　The titers of PB pAb by indirect ELISA
图 7 　PB pAb 对 PB 的抑制曲线
Fig. 7 　Inhibitive curve of PB pAb against
PB by blocking ELISA
融合后 10 d 观察融合效果 ,4 块细胞培养板 384
孔中有杂交瘤细胞克隆形成的 346 孔 , 融合率为
9011 % ;间接 ELISA 检测 ,阳性 63 孔 ,阳性率 1812 % ;
阻断 ELISA 筛选 ,3 次有限稀释法亚克隆后获得 11 株
杂交瘤细胞 ,分别测定其 IC50 ,筛选出 4 株高效价、敏感、
特异的杂交瘤 ,分别命名为 1B9、3C4、3F6、4E6 ,经多次传
代 ,8 次冻存及复苏 ,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
214 　PB mAb 免疫学特性鉴定
21411 　杂交瘤核型鉴定 　NS0 染色体数目为 62～68
条 ,小鼠脾细胞染色体数目为 40 条 ,本试验获得的杂
交瘤染色体数目为 96～102 条 ,平均 9816 条。
21412 　同种型鉴定 　用 mAb 同种型鉴定试剂盒检
测 ,1B9、3C4、3F6、4E6 同种型分别为 IgG2aΠκ、IgG2aΠλ、
IgG1Πκ、IgG1Πκ。
21413 　效价测定 　结果见表 1。杂交瘤细胞分泌的
PB mAb 具有较高的效价 ,其中 4E6 株最高 ,细胞培养
上清和腹水分别达到了 1∶811 ×102 和 1∶614 ×105 。
表 1 　PB mAb 的间接 ELISA 效价
Table 1 　The indirect ELISA titer of anti2PB mAb
杂交瘤细胞
hybridoma
细胞培养上清
supernatant
腹水
astices
1B9 1∶217 ×102 1∶2156 ×105
3C4 1∶5112 ×102 1∶614 ×104
3F6 1∶312 ×102 1∶312 ×105
4E6 1∶811 ×102 1∶614 ×105
21414 　亲和力鉴定 　结果见图 8。1B9、3C4、3F6、4E6
所分泌的 mAb 与抗原结合达到 50 %饱和所需浓度分
别为 5197、1148、4104、01731μgΠml , Ka 分别为 2155 ×
109 、1103 ×1010 、3176 ×109 、2108 ×1010 LΠmol。根据
James 等[12 ] Ka 为 107～1012LΠmol 为高亲和力抗体的理
论 ,4 种 mAb 亲和力均较高 ,4E6 最好。
图 8 　PB mAb 的亲和常数测定曲线
Fig. 8 　The association constant (ka) curve of PB mAb
21415 　敏感性鉴定 　结果见图 9。曲线回归方程为 y
= - 331942 x + 851794 , R2 = 019901 , IC50 为 11135μgΠL ,
线性范围为 210～128μgΠL ,检测限为 2μgΠL ,表明 PB
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mAb 对 PB 具有较高的敏感性。
图 9 　阻断 ELISA 检测 PB IC50
Fig. 9 　IC50 inhibitive curve of PB
mAb by competitive ELISA
21416 　特异性鉴定 　结果见表 2。PB 的 IC50为 11135
μgΠL ,说明 PB 与其 mAb 能够特异性结合 ;与巴比妥的
交驻反应率为 1214 % ,与其他化合物的交叉反应率小
于 015 %。
表 2 　PB pAb 与 PB 类似化合物的交叉反应
Table 2 　The percent cross2reactivity of PB pAb
with PB analogous compounds
化合物 compounds IC50(μgΠL) 交叉反应率cross2reactivity( %)
苯巴比妥 Phenobarbital 11135 100
巴比妥 Barbital 9115 1214
戊巴比妥 Pentobarbital > 312 ×103 < 015
异戊巴比妥 Amobarbital > 312 ×103 < 015
司可巴比妥 Secobarbital > 312 ×103 < 015
环己巴比妥 Cyclobarbital > 312 ×103 < 015
海索比妥 Hexobarbital > 312 ×103 < 015
苯妥英 Phenytoin > 312 ×103 < 015
安定 Diazepam > 312 ×103 < 015
羟基安定 Temazepam > 312 ×103 < 015
卡马西平 Carbamazepine > 312 ×103 < 015
3 　讨论
根据 Mitchison[13 ]半抗原2载体效应理论 ,遵循偶联
位点恰当 (抗体特异) 、间隔臂长度适宜 (避免桥抗) 、化
学反应简单 (易于操作) 三个原则设计 PB 半抗原。由
于不同偶联位点合成的抗原所产生抗体特异性不同 ,
本试验旨在研制 PB 的特异性抗体 , 参照 Haasnoot
等[14 ]利用苯环设计半抗原的方法 ,选择 PB 苯环对位
作为偶联位点 ,经硝化和还原反应 ,引入活性基团氨
基 ,合成半抗原 pAPB ,用重氮化法和戊二醛 ( GA) 法进
行偶联 ,结果表明重氮化法优于 GA 法 ,进一步证实了
重氮化法适用于芳香胺而 GA 法适合于脂肪胺的报
道[15 ] ,BSA2pAPB 免疫动物后产生了针对 PB 的特异性
抗体。
影响人工抗原免疫原性的因素有多种 ,如载体蛋
白的性质、间隔臂的长度和分子结合比等。由于 BSA
性质稳定 ,价廉易得 ,分子内含自由氨基多 ,在较大 pH
值范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度 ,易
于操作 ,因此 ,本研究选用 BSA 作载体蛋白。Sionf
等[16 ]认为 ,一定长度间隔臂的介入 ,有助于半抗原结
构的暴露和特异性抗体的产生 ,间隔臂过长可形成新
的抗原表位 ,易被细胞识别而产生“桥抗”,间隔臂过短
则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别 ,
不产生特异性抗体 ,最好的间隔臂是 3～6 个直链碳 ,
长度以 5～8! 为宜 ,本研究以 - N = N - 作间隔臂 ,长
度适宜 ,既产生了针对 PB 的特异性抗体 ,又避免了桥
抗的产生。关于半抗原与载体蛋白的最佳分子结合比
目前尚未形成定论 , Eilange [17 ] 提出 5～25∶1 最佳 ,
Schneider 等[18 ]认为 10～20∶1 为好 ,本试验 PB 与 BSA
的分子结合比为 19∶1 ,并取得了较好的免疫效果 ,笔
者认为 ,不同半抗原其分子构象、电子分布、结构复杂
性、基团极性、亲水性等性质不同 ,最佳分子结合比也
不尽相同。
抗体的免疫学特性主要体现于抗原抗体反应的结
合容量、亲和力和特异性三方面 ,结合容量以效价表
示 ,用间接 ELISA 测定 ,4E6 株腹水效价最高 ,达到 1∶
614 ×105 ; 测定亲和力 Ka 的方法有平衡透析法、
Scatchard plot 法和 Batty 饱和法等 ,本试验对三种方法
进行了比较 ,结果基本一致 ,饱和法更为简单适用 ,制
备的 PB mAb 的 Ka 为 2108 ×1010LΠmol ,为高亲和力抗
体。采用交叉反应实验鉴定其特异性 ,本试验制备的
PB mAb 对 PB 具有较强的识别能力 ,与巴比妥的 CR %
为 1214 % ,与其他化合物无 CR。本试验制备出了高
价、敏感、特异的 PB mAb ,可以用于 PB 残留检测的免
疫学实验。
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伏。氮、磷、钾科学搭配施用 ,其比例大致为 1∶015∶1 ,
视不同地区土壤肥力因素情况而适当调整。“粤航 1
号”大田表现较抗稻瘟病 ,未发现有稻瘟病危害减产情
况 ,但省区试抗性鉴定该品种的抗性频率不高 ,因此引
种试种时要特别注意防治稻瘟病。此外 ,“粤航 1 号”
穗上少部分谷粒有谷壳胀裂现象 ,如早造种植雨水较
多 ,容易浸入而影响质量 ,晚造种植更佳。
3 　水稻航天育种的体会
311 　航天搭载材料的选择
航天育种不同于辐射诱变育种 ,如不存在致死的
问题 ,其变异频率高 ,变幅大 ,正向变异较多。在水稻
航天诱变后代材料中 ,较易出现的变异是株高、熟期、
穗大小、有效穗、粒型、直链淀粉含量等[5～8 ] ,有单独某
个性状变异的 ,也有多个性状综合变异的。但总的来
说 ,其变幅符合诱变育种的特点和规律 ,因此 ,在考虑
搭载材料的时候 ,应选择那些综合性状良好但具有某
一两个性状需要改进提高的材料进行搭载诱变处理 ,
以更易于选育出新的品种。
312 　香味突变
在 1996 年搭载的 7 个材料中 ,“长丝占”的诱变后
代材料出现香味突变 ,育成籼型香稻新品种“粤航 1
号”。在搭载“神舟”四号的 10 个材料中 ,“南丰糯”的
诱变后代材料出现香味突变 (同时有粒型变异) ,育成
新品系航香糯。这是否意味着在水稻航天育种中 ,香
味突变是比较容易诱变出现的性状变异 ,还值得我们
作进一步探索研究。
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