全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062473204
秋水仙素诱导兰考泡桐同源四倍体
范国强　杨志清　曹艳春　刘　飞　贾　峰
(河南农业大学泡桐研究所 ,河南 郑州　450002)
摘 　要 :在含不同浓度秋水仙素的 MS + 011mgΠL NAA + 15mgΠL BA (最适器官发生) 双层培养基上进行兰
考泡桐四倍体植株诱导试验 ,并通过变异植株根尖细胞染色体观察和叶片单细胞 DNA 含量测定进行倍
性分析。结果表明 ,预培养 12d 的兰考泡桐叶片在秋水仙素浓度为 10mgΠL 的双层培养基上预培养处理
24h 时 ,四倍体诱导率最高达到 2314 %。变异植株叶片比二倍体大 ,叶片长宽比变小 ,叶片单个气孔变
大 ,气孔密度变小。
关键词 :泡桐 ;四倍体 ;秋水仙素 ;诱导
AUTOTETRAPLOID INDUCTION OF Paulownia elongata WITH COLCHIONE
FAN Guo2qiang 　YANG Zhi2qing 　CAO Yan2chun 　LIU Fei 　J IA Feng
( Institute of Paulownia , Henan Agricultural University , Zhengzhou , Henan 　450002)
Abstract :Autotetraploids from diploidy leaves of Paulownia elongata on the double layer MS media supplemented with 0. 1
mgΠL NAA and 15 mgΠL BA (optimal organogenetic medium to the leaves of diploidy seedlings) with different colchicines
concentrations were induced ,chromosome numbering of the plant root tip cells and DNA content analysis of the leaf single cell
were used to analyse the autotetra ploids. The results indicated that the highest tetraploid induction rate could reach 23. 4 %
when the leaves precultured on the optimal organogenetic MS medium for 12d and treated with 10 mgΠL colchione on the double
layer media for 24h in vitro. Compared with diploidy seedlings of P. elongate , leaf length and stomata size of tetraploid
becomes bigger , the leaf lengthΠwidth ratio and stomata density becomes smaller.
Key words : Paulownia elongata ;autotetraploid ;induction ;colchione
收稿日期 :2006207210
基金项目 :河南省高校创新人才基金资助项目 (2002012)
作者简介 :范国强 (19642) ,男 ,河南禹州人 ,教授 ,主要从事泡桐丰产栽培理论与生物技术教学与研究工作。Tel :0371 63558077 ; Email :zlxx64 @
sohu. com
　　泡桐为玄参科泡桐属落叶乔木 ,现有 9 种 2 变种 ,
是我国重要的速生用材和绿化树种。随着科学技术的
发展和人民生活水平的提高 ,现有品种越来越不能满
足生产的需求。因此 ,泡桐新品种培育需要尝试新的
方法 ,多倍体育种即为其中一种。植物多倍体具有抗
逆性和适应性强等特点[1 ,2 ] ,现已有杨树等用材林多倍
体植株培育成功 ,并在生产实践中产生了显著的经济
和社会效益[1～4 ] 。平吉曾利用种子进行过毛泡桐多倍
体的研究工作[5 ] ,但国内外至今还未有兰考泡桐多倍
体诱导的报道。近年来 ,泡桐体外植株高效再生系统
的建立为进行其多倍体诱导提供了技术条件[6～12 ] 。为
了获得生长速度更快、抗逆境能力更强的兰考泡桐四
倍体植株 ,扩大泡桐种质资源 ,作者以叶片为试验材料
进行了兰考泡桐四倍体诱导研究 ,以为开展泡桐基因
工程和细胞工程研究奠定基础。
1 　材料和方法
111 　试验材料
河南农业大学泡桐研究所用兰考泡桐 ( Paulownia
elongata)种子培养 80d 的 6～8 对叶龄组培苗叶片。
112 　试验方法
374　核 农 学 报　2006 ,20 (6) :473～476Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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11211 　试验设计和数据处理 　秋水仙素处理上述培
养兰考泡桐无菌苗叶片试验采用 L9 (34 ) 正交设计[13 ] 。
秋水仙素浓度为 5、10 和 20mgΠL ,叶片预培养与秋水仙
素处理时间分别是 0、6、12d 和 24、48 和 72h (表 1) 。将
兰考泡桐无菌苗叶片剪成 015 cm ×110cm 接种于其体
外器官直接发生的最适培养基上[9 ] ,分别预培养 0、6
和 12d 后 ,再放于不同秋水仙素浓度的双层培养基
[上、下层分别为 10ml 和 30ml 秋水仙素浓度相同的器
官直接发生的液体 (不加琼脂粉) 和固体培养基 (上面
铺 2 层无菌滤纸) ]上 ,然后 ,在温度为 20 ℃的黑暗条
件下处理 24、48 和 72h。处理结束后 ,先用无菌水清洗
叶片 5 次 ,再用无菌滤纸吸干叶片表面液体后转到不
含秋水仙素的上述固体培养基上 ,于温度为 25 ℃±
2 ℃、光照强度 130μmolΠm2·s1 、光照时间 16hΠd 的培养
室内培养。每处理 60 个叶片。40d 时 ,统计叶片存活
率及芽诱导率 ,并选取长约 2cm 的幼芽转入 1Π2MS +
011mgΠL NAA 中诱导生根。20d 后 ,剪 2cm 长顶芽放到
生根培养基中继代培养。每 20d 继代 1 次 ,共继代 5
次。第 5 次继代苗培养 20d 时 ,先剪其根尖制临时压
片用于染色体倍性观察 ,再用流式细胞仪确认染色体
数变化的倍性 ,并计算四倍体诱导率。每组试验重复
2 次 ,数据经反正弦转换后采用 SPSS 软件处理 ,并进
行 F 检验。
11212 　植株倍性鉴定 　染色体计数 :二倍体和诱导变
异幼苗根尖细胞染色体观察参见舒寿兰法[14 ] 。将制
成的根尖临时压片放于倒置显微镜 ( ×2000) 下 ,分别
观察其染色体条数并拍照。单细胞 DNA 含量测定 :用
Calibur 流式细胞仪对秋水仙素处理变异植株和对照植
株进行倍性分析。分别将约 20mg 的二倍体和染色体
变化的叶片在 1ml 缓冲液 I(011 molΠL 柠檬酸和 015 %
的 Tween)中用剪刀快速剪碎 ,用 30μm 尼龙网过滤至
115ml 离心管中 , 150g 室温离心 3min ,弃去上清 ,加入
100μl 新鲜的缓冲液 I ,轻微振荡摇匀后 ,再加入 500μl
缓冲液 II (014molΠL Na2 HPO4 ·12H2O + 4μgΠml 4 , 62二
氨基222苯基吲哚 + 50μgΠml RNase) ,轻微振荡 ,混匀
10min 后 ,加入仪器所带荧光染色液。染色后 ,测定上
样单细胞 DNA 相对含量 ,并用连接的电脑软件自动分
析测定结果 ,打印出 DNA 相对含量分布图。
11213 　植株形态变化 　取苗龄 60d 的二倍体和四倍
体组培苗成熟叶片 , 在 5 % KOH 溶液中煮沸 3～5min
后置于冷水中 ,先在载玻片上加一滴清水 ,用镊子小心
挑取叶片表皮置于载玻片的水滴上 ,将其展开 ,吸去多
余的水 ,加一滴 I22KI溶液 ,染色 1min ,加盖玻片后用装
有测微尺镜头的显微镜观察。每个压片至少观察 10
个视野 ,记录每个视野内单个气孔器的长度、宽度和气
孔器个数。重复 3 次 ,取平均值。此外 ,观察比较上面
生根 40d 的二倍体和四倍体幼苗叶片大小、叶色、整株
生长等差异 ,记录叶片的长和宽。每一指标测定 10 个
样品 ,求其平均值。
2 　结果与分析
211 　秋水仙素对兰考泡桐叶片的影响
秋水仙素对兰考泡桐叶片存活率、芽诱导率和四
倍体诱导率的影响存在一定的差异 (表 1) 。当秋水仙
素浓度为 5mgΠL 时 ,叶片存活率、芽诱导率和四倍体诱
导率最高分别为 5314 %、3010 %和 1117 % ; 浓度为
10mgΠL 时 ,叶片存活率、芽诱导率和四倍体诱导率最
高分别为 4510 %、2510 %和 2314 % ;浓度为 20mgΠL 时 ,
叶片存活率、芽诱导率和四倍体诱导率最高分别为
3510 %、2117 %和 2117 %。该结果表明 ,随着秋水仙素
浓度的增大 ,叶片最高存活率和芽诱导率出现下降的
表 1 　秋水仙素对兰考泡桐四倍体诱导的影响
Table 1 　The effects of colchicine treatment on tetraploid induction of Paulownia elongata plants
秋水仙素浓度
colchicine concentration (mgΠL) 处理时间treatment times(h) 预培养时间precultured time (d) 存活率survival rate ( %) 芽诱导率shooting rate ( %) 四倍体诱导率tetraploidy rate ( %)
5 24 0 5314 3010 117
5 48 6 2314 314 117
5 72 12 3814 2117 1117
10 24 12 4510 2510 2314
10 48 0 4117 1314 510
10 72 6 1813 0 0
20 24 6 1617 314 314
20 48 12 3510 2117 2117
20 72 0 3510 1510 1117
474 核　农　学　报 20 卷
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趋势 ,四倍体最高诱导率的变化则是先上升后下降。
秋水仙素浓度对叶片存活率和四倍体诱导率的影响表
现出极显著和显著差异 ,而对芽诱导率的影响则差异
不显著 ;在秋水仙素中的处理时间只对叶片存活率和
芽诱导率的作用明显 ,对四倍体诱导率的影响差异不
明显 ,叶片预培养时间对三者的影响则均达到极显著
水平 (表 2) 。因此 ,我们认为在进行兰考泡桐四倍体
诱导时要充分考虑叶片预培养时间这一重要因子。本
试验中 ,选择第 4 组合即将预培养与培养 12d 的叶片
在浓度为 10mgΠL 秋水仙素的双层培养基上处理 24h
的四倍体诱导率最高。
表 2 　秋水仙素诱导兰考泡桐四倍体的方差分析( F值)
Table 2 　Anova of tetraploid induction from P1 elongata
leaves by colchione (F values)
方差来源
sources
存活率
survived
rates
芽诱导率
shoot induction
rates
四倍体诱
导率
tetraploid rates
备注
Note
秋水仙素浓度
olchione concentrations 916233 3159 4184 3
处理时间
treatment times 6155 3 6122 3 0134 P0105 = 3198P011 = 7121
预培养时间
precultured times 818933 4617033 2910633
注 : 3 0101 ≤P < 0105 ,3301001 ≤P < 0101
212 　变异植株的倍性鉴定
21211 　根尖细胞染色体观察 　将秋水仙素处理后再
生的变异植株组培苗根尖制成临时压片 ,在显微镜下
观察发现 ,诱变的幼苗根尖细胞染色体条数为 2n = 4x
= 80 ,正常二倍体兰考泡桐组培苗根尖细胞染色体为
2n = 2x = 40 (图 1) 。即发生诱变的植株细胞染色体条
　　　
数为二倍体的 2 倍。
图 1 　二倍体和四倍体兰考泡桐细胞染色体
Fig. 1 　Chromosome numbers of the diploid and
tetraploid of P1 elongata
A :四倍体 tetraploid (2n = 4x = 80) 　B : 二倍体 diploid (2n = 2x = 40)
21212 　叶片细胞 DNA 含量测定 　测定继代 5 次的秋
水仙素处理后染色体发生变化植株和二倍体植株叶片
的单细胞 DNA 相对含量。由其 DNA 含量分布图 (图
2)可以看出 ,二倍体对照植株仅在相对荧光强度值为
50 的位置上出现 1 个单峰 ,诱导变异植株在接近 100
的位置上出现 1 个单峰 ,未发现其他任何峰。因此 ,我
们可以得出 ,秋水仙素处理后获得的变异植株均为四
倍体植株 ,没有嵌合体和八倍体植株的产生。
213 　植株形态变化
通过比较细胞学和鉴定继代 5 次变异植株与二倍
体植株的形态发现 ,四倍体幼苗比对照 (二倍体) 幼苗
生长健壮 (图 3 - A、B) ,幼苗叶片增大、增厚 (图 3 - C、
D) 。二倍体叶片长宽比大于四倍体叶片的 (图 3 - C、
D ,表 3) 。此外 , 四倍体植株叶片气孔器长、宽均大于
相应二倍体叶片 ,但四倍体气孔密度较小 (图 3 - E 和
F ,表 3) 。
图 2 　二倍体和四倍体兰考泡桐植株 DNA 含量分布图
Fig. 2 　The DNA distribution histogram of diploid and tetraploid plants
574　6 期 秋水仙素诱导兰考泡桐同源四倍体
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图 3 　二倍体和四倍体兰考泡桐的幼苗、叶片和气孔
Fig. 3 　Seedlings , leaves and stomata of diploid and tetraploid of P1 elongate plants
A :四倍体幼苗 ;B : 二倍体幼苗 ; C :四倍体叶片 ;D :二倍体叶片 ; E :四倍体气孔 ;F :二倍体气孔
A : tetraploid seedling ;B :diploid seedling ;C : tetraploid leaf ;D :diploid leaf ; E :tetraploid stomata ;F :diploid stomata
表 3 　四倍体和二倍体兰考泡桐叶片及气孔大小
Table 3 　Differences of leaves and stomata between diploid and tetraploid of P1 elongate plants
倍性
ploidy
叶片长
leaf length
(cm)
叶片宽
leaf width
(cm)
叶片长Π宽
leaf lengthΠ
width
气孔器长
stomata length
(μm)
气孔器宽
stomata width
(μm)
气孔器长Π宽
stomata lengthΠ
width
气孔密度Π
个Πmm2
stomata density
气孔密度比
rate of stomata
density
二倍体 diploid 3156 3107 1113 18178 16131 1115 630106 1187
四倍体 tetraploid 3192 3167 1116 20103 19139 1114 350104
3 　讨论
311 　秋水仙素对叶片的伤害　秋水仙素作为一种剧
毒化学诱变剂 ,在对细胞染色体加倍的同时 ,还对细胞
产生伤害 ,浓度越大造成的伤害越重 ,过重时使处理的
叶片在培养过程中褐化死亡[15 ,16 ] 。本试验中 ,随着秋
水仙素浓度的增加 ,叶片的最高存活率和芽诱导率逐
渐下降 ,但是处理叶片的最高四倍体诱导率则不呈现
这种规律。该结果出现的原因可能与叶片在其体外器
官直接发生的培养基上进行不同时间的预培养存在一
定的关系。叶片预培养的时间不同 ,细胞脱分化的程
度则存在差异 ,而这些处于不同脱分化状态的细胞 ,一
方面对秋水仙素反应的敏感程度不同 ,另一方面处于
分裂中期的细胞个数也存在较大的差异。最后导致预
培养 12d 的叶片在秋水仙素浓度为 10mgΠL 的双层培
养基上预培养处理 24h 时 ,四倍体诱导率达到最高的
结果出现。至于秋水仙素处理后 ,兰考泡桐叶片愈伤
组织上芽的分化途径还有待于进一步研究。
312 　四倍体的鉴定方法 　植物多倍性鉴定方法是确
定植物多倍体水平的重要手段。目前鉴定植物多倍体
的方法多种多样[16 ,17 ] ,其中 ,染色体计数是鉴定植物多
倍体最常用的方法之一 ,然而 ,逐株进行染色体鉴定是
一项费时费力的工作 ,并且要将诱变植株根尖染色体
数目与花粉染色体数目鉴定结合起来才能完全排除诱
导结果中存在嵌合体的可能性。近年来 ,流式细胞仪
的出现为诱变植株倍性鉴定提供了新的手段[18 ,19 ] 。但
是 ,后来的研究结果表明 ,植物叶片细胞 DNA 含量加
倍并非就一定是染色体数目发生变化[18 ] 。在我们的
试验中采用根尖染色体计数与流式细胞仪测定成熟叶
片单细胞 DNA 含量相结合的方法鉴定植株倍性 ,虽然
工作量相对较大 ,但经过较短时间的工作即可获得可
靠的试验结果。
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674 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (6) :473～476
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表 2 　玉米和棉花 Bt Cry 1Ac 晶体蛋白测定结果
Table 2 　Determination of Bt Cry 1Ac protein in corn and
cotton by ELISA and RIA (ngΠml)
普通玉米
Non2transgenic
corn
转 Bt 玉米
Bt2transgenic
corn
普通棉花
Non2transgenic
cotton
转 Bt 棉花
Bt2transgenic
cotton
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
酶联免疫 ELISA - - 15Aa 67Aa - - 34Aa 102Aa
建立的方法
RIA established
- - 13Aa 75Aa - - 28Aa 96Aa
注 :表中相同字母表示无显著性差异。
Note :the same letter in table means no significant different .
　　利用磁性微粒连接 IgG制备免疫分离剂 ,在磁场
的作用下 ,抗原抗体复合物自动沉淀 ,不需离心即可分
离 ,具有使用方便 ,制样简单 ,不用离心分离等优点 ,且
种子样品不用去酚和脱脂 ,灵敏度即可达到 100pgΠml ,
说明本方法在上述方面优于酶联免疫法。Bt Cry 1Ac
放射免疫检测方法快速准确测定的特点 ,为育种、转基
因植物的虫害管理和基因标识提供了另外一种检测手
段。
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