全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 012001205
质子对小麦的诱变效应及作用机理研究
Ⅱ1 质子处理对小麦种胚 DNA 损伤修复的影响
施巾帼　孙国庆　胡　萍　肖京城　李桂英　唐掌雄
(中国农业科学院原子能利用研究所 ,北京　100094)
摘 　要 :用3 H2TdR 标记小麦种胚 ,研究了质子处理的种胚萌发早期 DNA 合成动态 ,并
与γ射线辐照进行对比。表明质子处理能引起肿胚 DNA 损伤修复合成 ,即 DNA 非
按期合成 ,京 411 与原冬 977 的修复复制峰期分别出现在正常的 DNA 合成峰期前 4h
与 2h。以京 411 为例 ,比较质子处理与γ射线辐照的种胚 DNA 损伤修复特点的差
异 ,质子的 DNA 非按期合成峰期出现时间早于γ射线处理的 2h ,正常的 DNA 合成峰
期晚于γ射线处理的 4h ,且在 DNA 非按期合成峰期后的 DNA 合成量明显低于γ射
线。
关键词 :质子 ;3 H2TdR 标记 ;小麦 ;损伤修复 ;DNA 合成
收稿日期 :2001212231
基金项目 :本研究由国家自然科学基金项目 (39870445)资助
作者简介 :施巾帼 (1941～) ,女 ,江苏启东人 ,研究员 ,从事小麦诱变遗传育种研究
很多研究表明 ,物理诱变源对生物体的作用是一个非常复杂的辐射物理、化学、生物等过
程 ,辐射可以造成 DNA 大分子单链断裂、双链断裂及碱基损伤等 ,但生物体内存在着很强的修
复系统 ,DNA 损伤可以得到修复。Yamaguchi 等[2 ] 曾在γ辐照大麦种胚中观察到 DNA 的损伤
修复合成 ,即 DNA 非按期合成 ;丘泉发等[3 ] 在γ射线辐照花生、水稻种子 ,王崇英等[4 ] 在低能
N + 处理小麦种子 ,汪丽虹等[5 ]在电子束和 Ar + 处理枸杞种子及曹雪芸等[6 ] 在同步辐射处理小
麦种子的研究上均观察到相似结果。这些结果表明 DNA 的损伤修复是生物的基本属性 ,如果
DNA 结构得到正确的修复 ,则细胞功能趋于正常 ;如果修复不成功或不完全 ,则细胞可能发生
死亡或遗传信息变化 ,从而引发突变。因此 DNA 损伤修复的研究 ,对了解突变机理有十分重
要的意义。本文将研究质子处理小麦种子对 DNA 损伤修复的影响 ,为质子应用于诱变育种提
供理论依据。
1 　材料和方法
111 　材料
选用纯系品种原冬 977 和京 411 小麦风干种子。
112 　辐射处理
质子辐照处理在北京大学重离子物理研究所进行 ,采用 EN 型 12MeV 串列加速器装置 ,实
1　核 农 学 报　2003 ,17 (1) :1～5Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
验用能量为 4MeV ,注入剂量为 40C、80C(1C = 416 ×108 PΠcm2 ) 。60 Coγ辐照在本所钴室进行 ,辐
照剂量为 300Gy ,剂量率为 111GyΠmin。
113 　3 H胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 H2TdR)的标记及种胚 DNA合成活性的测定
将辐照后的种子置于培养皿内吸水纸上 ,于 25 ℃培养箱内发芽 ,分别在培养后 2、4、6、8、
10 ⋯18h 取出种子 ,剥离出种胚 ,每次 4 粒 ,重复 2 次 ,称重后投入小瓶中 ,加入 2ml 放射性浓度
为 015μCiΠml 的3 H2TdR(购于中国原子能研究院)溶液中 ,于 25 ℃标记培养 3h ,以沸水杀死的种
胚为本底。标记后的种胚用蒸馏水清洗 ,转入闪烁杯 ,用玻棒捣碎 ,加 4ml 闪烁液摇匀。24h
后置于 FJ22100 双道液闪计数器上测定放射性强度 (dpm) 。放射性测量效率为 30 %。整个试
验重复 3 次。
2 　结果和分析
211 　正常肿胚内的 DNA合成动态
用3 H2TdR 标记京 411 和原冬 977 小麦种胚 ,种胚萌发早期3 H2TdR 掺入量列于表 1。结果
表明 ,两个品种在浸种 2h 后种胚内就有3 H2TdR 的掺入 ,随着萌发时间延长3 H2TdR 掺入量增
加 ,并在一定萌发时期出现3 H2TdR 的掺入峰 ,即 DNA 合成峰 ,说明种胚早期萌发过程存在
DNA 合成高峰。两个品种在同一萌发时间的 DNA 合成量及合成峰出现时间有所差异 ,京 411
的 DNA 合成峰出现在种子萌发后 12h ,而原冬 977 有两个 DNA 合成峰 ,第 1 个峰的 DNA 合成
量较小 ,第 2 个峰的 DNA 合成量较大 ,分别出现在 12h 与 16h ;整个萌发过程中 ,京 411 的 DNA
合成量大于原冬 977 (图 1) 。
表 1 　质子辐照小麦种胚萌发过程中3 H2TdR的掺入量
Table 1 　The incorporation of 3 H2TdR into the seeds embryo with proton during germination
(dpmΠ100mg embryo)
品种
variety
处理
treatment
萌发时间 time of germination (h)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
京 411 质子
Beijing proton
411γ2ray
原冬 977 质子
Yuandong proton
977γ2ray CK 22770714 28180915 37824515 39778917 44617413 64727711 62611416 56093916 371483114MeV240C 23073813 26042911 36854313 47751119 42740417 17954410 42590519 50410111 565000174Mev280C 23322914 22757816 37201416 45794515 33376013 20460210 39469517 44308310 53608019300Gy 22364719 28780513 34708615 44105419 47999219 36730817 58919319 47891913 32566518CK 18381315 28760017 26401811 32287611 33166715 43810412 29222318 67145014 546776134MeV240C 19576415 29852715 30717815 33836514 41534819 40891013 36287812 27369914 435160134MeV280C 23823313 32785218 40695617 44676711 51156115 45711911 43139217 40728016 38459419300Gy 19215219 30839312 40527813 51226417 45480213 59764911 25244510 41873819 42544611
　　注 :1C = 416 ×108 质子Πcm2 ;
Note :1C = 416 ×108 protonsΠcm2
212 　质子处理种胚内的 DNA合成动态
经 4MeV240C、4MeV280C质子处理的种胚在浸种后 2h ,3 H2TdR 的掺入量就高于对照 ,随着
2 核　农　学　报 17 卷
种子萌发时间的延长 ,种胚内 DNA 合成量急剧上升 ,京 411 在浸种后 8h ,原冬 977 在浸种后
10h ,也就是在其正常的 DNA 合成峰期前 4h 及 2h ,出现一个额外的 DNA 合成峰 ,峰值明显低
于正常 DNA 合成峰值 ,以后 DNA 合成量下降 ,两个品种分别在 12h、16h 后又开始上升 ,18h 后
出现正常的 DNA 复制高峰 ,但低于对照组 (见表 1、图 2) 。从图 2 (以京 411 为例) 可见 ,京 411
种胚内 DNA 合成在正常的峰期到来之前 4h ,有一额外的3 H2TdR 掺入高峰 ,说明质子处理后小
麦种胚内 DNA 非按期合成 ,即 DNA 损伤的修复复制存在。如果把正常种胚不同浸种时间下
的3 H2TdR 掺入量作基数 (100 %) ,而把各处理的种胚在相应时间内3 H2TdR 的掺入量与其比较 ,
可求出相对掺入率 (见图 3) ,由图 3 可更清楚看到 ,质子处理的各组种胚在浸种后 8h 有一明显
的3 H2TdR 掺入高峰 ,即 DNA 损伤修复复制峰。从图 2、图 3 还可看出 ,本试验所用的二个剂量
的 DNA 合成曲线基本相似 ,但在不同萌发时期的3 H2TdR 掺入量及相对掺入率有差别 ,表明剂
量间的 DNA 损伤修复程度有差异。
图 1 　未辐照种子种胚早期萌发过程中
3 H2TdR 的掺入
Fig. 1 　The incorporation of 3 H2TdR during the
early period of germination in CK seed embryos
图 2 　质子辐照种胚早期萌发过程中
3 H2TdR 的掺入 (京 411)
Fig. 2 　The incorporation of 3 H2TdR during the
early period of germination in seed embroys
with proton radiation (Jing411)
213 　质子与γ射线辐照的 DNA合成动态比较
γ射线辐照京 411 与原冬 977 小麦种子 ,种胚萌发早期均出现了 DNA 非按期合成 (表 1) 。
以京 411 为例将质子与γ射线处理后种胚的掺入动态绘制成曲线进行比较 (图 4)可发现 ,质子
与γ射线均有 DNA 损伤修复复制峰 ,即 DNA 非按期合成 ,但 DNA 非按期合成峰期及正常合成
峰期出现的时间及 DNA 合成量有明显差异。质子的 DNA 非按期合成峰期出现时间早于γ射
线处理的 2h ,正常的 DNA 合成峰期晚于γ射线处理的 4h ,且在 DNA 非按期合成峰期后 ,DNA
的合成量明显低于γ射线处理的 ,表明本试验采用的质子剂量引起的 DNA 损伤大于 300Gyγ
射线处理的。
3　1 期 质子对小麦的诱变效应及作用机理研究
图 3 　质子辐照种胚早期萌发过程中
3 H2TdR 相对掺入率
Fig. 3 　The relative incorporation rate of
3 H2TdR during the early period of germination
in seed embryos with proton radiation (Jing411)
图 4 　质子与γ射线辐照种胚3 H2TdR 掺入比较
Fig. 4 　The comparison of incorporation
3 H2TdR in seed embryos with proton and
γ2ray radiation
3 　讨 　论
Yamaguchi 等[2 ]曾经指出 ,受γ射线辐照的大麦种胚第一叶分生组织细胞在染色体复制前
若干小时 ,3 H2TdR 掺入量有特殊增多 ,并用咖啡因等 DNA 合成抑制剂证实3 H2TdR 的特殊增多
是辐射损伤细胞中 DNA 修复复制的结果。本试验所得结果与 Yamaguchi 等研究结果相似 ,质
子处理与γ射线辐照小麦种胚 ,在正常 DNA 合成峰期到来之前一定时间内 (质子处理的在 4h ,
γ射线处理的在 2h) ,3 H2TdR 掺入量异常增多 ,与种胚内DNA 合成的正常峰值时的大量复制引
起的掺入增加有明显区别 ,表明质子处理小麦种胚有 DNA 损伤修复复制 ,即 DNA 非按期合成
存在 ,修复复制期在种胚萌发后 8h。既然质子处理后种胚内有 DNA 修复复制存在 ,那么质子
必然引起了受辐照种胚内 DNA 链的断裂或碱基损伤。损伤修复中如果修复不完全或修复错
误 ,就会在 DNA 复制时出现差错 ,引起细胞内一系列大分子和细胞结构变化而导致突变 ,这为
质子诱变提供了分子遗传学依据。
Gudkev[7 ]等指出 ,当豌豆种胚 DNA 损伤较严重时 ,DNA 复制发生的时间较早 ,DNA 非按期
合成峰出现时种胚内3 H2TdR 的掺入量较高。本试验中质子处理的种胚 DNA 损伤修复复制峰
出现时间早于γ射线处理的 2h ,正常的 DNA 合成峰期晚于γ射线处理的 4h ,说明本试验采用
的质子剂量对小麦的损伤大于γ射线处理的 ,M1 代的生物损伤实际确实符合这一结果。质子
与γ射线辐照后的种胚 ,在非按期合成峰期后 ,3 H2TdR 掺入量降低 ,DNA 的合成能力低于未辐
照对照组 ,似乎 DNA 损伤修复抑制了正常的 DNA 合成。丘泉发等[3 ] 认为 ,修复复制可能不是
在一次细胞周期内完成 ,而未完全修复的损伤可能影响以后的 DNA 复制。
4 核　农　学　报 17 卷
参考文献 :
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种胚 DNA 非按期合成的研究. 核农学报 ,2000 ,14 (6) :321～328
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462
STUDIES ON MUTAGENIC EFFECTS AND MECHANISM OF WINTER WHEAT
IRRADIATED BY PROTON
Ⅱ. Unscheduled DNA Synthesis of Irradiated Wheat seeds
SHI Jing2guo 　SUN Guo2qing 　HU Ping 　XIAO Jing2cheng 　LI Gui2ying 　TANG Zhang2xiong
( The Institute for Application of Atomic Energy , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 　100094)
ABSTRACT :By 3 H2TdR incorporation the changes of DNA synthesis in the early period of wheat
seeds germination irradiated with proton were studied. The results showed that proton was able to
induce an unscheduled DNA synthesis( UDS) in seed embryos of wheat. The UDS occurred earlier
than the normal DNA synthesis ,2h and 4h in Yuandong 977 and Jing411 respectively. Compared
withγ2ray treatment , the UDS in seed embryos by proton appeared 2h earlier and the normal
DNA synthesis 4h later. Also the level of DNA synthesis was signif icantly lower than that treated
byγ2ray irradiation after UDS.
Key words :proton ; 3 H2TdR incorporation ; wheat ; DNA synthesis
5Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (1) :1～5