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此文于 1995 年 5 月 19 日收到。
γ辐照与赤霉毒素复合处理对小麦幼胚
离体培养的影响
李社荣 　李安生 　张 　敬 　徐 　武 　李 　鸣
(中国科学院遗传研究所　北京　100101)
孙光祖 　王广金 　唐凤兰 　李忠杰 　张月学
(黑龙江省农业科学院作物育种研究所　哈尔滨　150086)
　　本实验采用60 Coγ辐照与小麦赤霉菌粗毒素的多种剂量组合 ,研究复合处理对
小麦幼胚离体培养的影响。结果表明 ,γ辐照与毒素处理能降低愈伤组织诱导率 ,接
种后第 40 天 ,愈伤组织存活率及愈伤组织生长量亦降低。但 50 Gy 辐照对愈伤组织
生长有一定刺激效应。复合处理剂量效应方程多为二元多项式。100ml/ L 毒素培养
基上得到的再生植株 ,其苯丙氨酸裂解酶活性显著高于无毒培养基上得到的对照。
关键词 : 　小麦幼胚 　辐照 　赤霉菌粗毒素 　复合处理 　离体培养
前 　　　言
　　近年来 ,以作物病原菌致病毒素为选择剂 ,应用离体生物技术选择并培育抗病种质已取得
较大进展[1 ,3 ,9 —13 ] 。为提高选择效率 ,一些学者采用理化因素对上代种子、外植体或愈伤组织
进行诱变处理 ,并探讨诱变剂对细胞选择的影响[1 ,2 ,8 ] 。但前人的处理剂量组合一般较少 ,且
多侧重于直观描述。有关诱变剂与毒素复合处理对离体培养效应的报道亦少 ,尤其在小麦上。
本实验采用多种剂量组合 ,运用数理统计方法 ,研究60 Coγ射线与赤霉菌粗毒素对小麦幼胚离
体培养及再生植株苯丙氨酸裂解酶活性的影响。
材 料 与 方 法
　　供试材料 　春小麦龙辐 3 号和黑 8526497 的风干种子 ,分别以 0、50、100、150 Gy 的60 Coγ
射线辐照 ,剂量率 80 Gy/ min ,按常规方法种植。取 M1 植株开花后 13～18 天的麦穗 ,剥取中
部小穗基部两朵小花的颖果 ,用 1 ‰升汞浸泡 10min ,无菌水冲洗 4 次 ,无菌下剥取幼胚接种。
赤霉菌毒素的制备 　参照 Pather 和张树荣的镰刀菌毒素制备方法[4 ,14 ] ,将田间搜集的赤
霉病菌种 (黑龙江省农科院植保所提供)接种于已灭菌的 PSA (马铃薯2蔗糖2琼脂) 斜面培养基
上 ,待长满菌丝后 ,接种于无菌小麦粒培养基上 ,25～27 ℃下培养 3 周 ,取出培养物 ,在 100 ℃
下烘烤 24h ,按 100g 培养物 200ml 甲醇水溶液 (甲醇∶水 = 2∶1)的比例浸提、过滤 ,然后加热抽
气 ,除去甲醇 ,萃取得到毒素粗提液。根据毒素对感病品种龙辐 3 号种子萌发与生长的抑制作
551核 农 学 报　1996 ,10 (3) :155～160
Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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用 ,以及接种后第 40 天的愈伤组织存活率来确定毒素处理浓度范围。
培养基 　诱导与继代培养基为 MS 基本培养基 + 2 ,42D 2mg/ L + KT 0. 5mg/ L 。分化培
养基为 MS 基本培养基。壮苗培养基为大量元素减半的 MS 培养基 + MET 1. 5mg/ L + NAA
0. 2mg/ L 。每升培养基均加琼脂 7. 5g ,蔗糖 30g。并加入相应浓度的毒素粗提液。
培养方法 　辐照剂量分别为 0、50、100 和 150 Gy 与每升培养基为 0、50、100、150 和 200ml
的毒素液按正交方式设计处理组合。在诱导和分化阶段采用“间歇法”毒素培养 ,即在含毒素
培养基上培养两个世代后 ,在无毒素培养基上巩固 1 次。每 20 天继代 1 次。
数理统计分析 　11 常规统计愈伤组织诱导率、得苗率。接种后第 40 天统计愈伤组织存
活率及愈伤组织平均生长量。本实验 150 Gy 辐照的田间结实率极低 ,统计分析时剔除该剂量
的组合。21 剂量效应方程的建立 : 　根据正交多项式回归分析原理 ,在对各效应指标趋势比
较的基础上 ,依最小二乘法原理 ,建立γ射线 ( x1) 和毒素浓度 ( x2) 与各效应指标 (y) 的回归方
程。经逐步回归 ,依次剔除偏回归平方和不显著的项 ,求取最优多项式回归方程。最后将各变
量的值代入该方程进行 y 值拟合性测验。
苯丙氨酸裂解酶( PAL ; E·C·4·3·1·5) 活性的测定 　综合考虑不同毒素浓度的处理效应
及获得再生植株的多少 ,将 0 Gy + 0ml/ L 和 0 Gy + 100ml/ L 两处理得到的再生苗转入不加毒
素的壮苗培养基上 ,20 天后 ,称取其 1g 叶片放入盛有 2ml 硼酸缓冲液 (0105mol/ L ,p H818) 的
研钵中 ,冰冻 ,研磨至匀浆 ,在 10000r/ min 下离心 15min ,取上清液 ,按 Koukol 方法 ,用紫外分
光光度计在 290nm 处测定 OD 值[8 ] ,以 OD 值变化 0. 01 为 1 个酶活性单位。
结 果 与 分 析
(一)毒素处理浓度的确定
将未经γ辐照的幼胚分别接种于毒素含量为 0、50、100、150 和 200ml/ L 的培养基上 ,第
40 天调查愈伤组织存活率。结果 (表 1)表明 ,随毒素浓度增加 ,愈伤组织存活率明显降低。在
50～200ml/ L 范围内 ,中抗材料黑 8526497 的愈伤组织存活率明显高于感病材料龙辐 3 号。
当毒素浓度上升到 200ml/ L 时 ,龙辐 3 号没有存活的愈伤组织 ,黑 8526497 存活率仅为
414 %。由此确定 ,200ml/ L 为实验处理的最高浓度。
(二)γ辐照与毒素复合处理对愈伤组织诱导率的影响
图 1 表明 ,愈伤组织诱导率基本上随毒素浓度和γ辐照剂量的提高而下降 ,毒素的抑制作
用大于γ辐照。50 Gy 辐照的诱导率与对照相差无几 ,100 Gy 辐照的诱导率明显下降。培养基
中毒素浓度为 50ml/ L 时 ,诱导率降低较少 ,超过 50ml/ L ,诱导率随毒素浓度增加明显下降。
剂量效应方程与上述结论一致 (表 2) 。表明低剂量辐照对诱导愈伤组织的抑制作用较
小 ,随剂量升高 ,抑制作用迅速增加。辐照与毒素复合处理的影响大于相应的单一处理 ,两因
素在龙辐 3 号上为独立效应 ,在黑 8526497 上为负协同效应。
(三)γ辐照与毒素复合处理对接种后第 40 天愈伤组织存活率的影响
从图 2 可以看出 ,γ辐照与毒素处理均降低愈伤组织存活率 ,但γ辐照的作用远低于毒
素。对黑 8526497 ,两因素处理间为独立效应 ,而对龙辐 3 号 ,γ辐照的作用很小 ,在逐步回归
中被剔除 (表 2) 。
γ辐照与毒素复合处理的愈伤组织存活率显著低于相应处理的愈伤组织诱导率 (图 1、图
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2) ,这是由于复合处理使部分愈伤组织在筛选过程中逐渐变褐死亡所致。较高浓度 (100～
200ml/ L)下 ,龙辐 3 号的存活率显著低于黑 8526497。说明抗性材料不同 ,其愈伤组织抗毒素
的能力有差异 ,材料间耐辐射能力亦不同。
表 1 　小麦赤霉菌粗毒素对接种后第 40 天愈伤组织存活率的影响
　　Table 1 　The effect of F. gram i nearum crude toxin on survived rate of callus 40 days after
inoculation
材　料
Materials
毒　素　浓　度
Concentration of toxin (ml/ L)
0 50 100 150 200
龙辐 3 号
Longfu 3 98. 6 81. 5 13. 3 7. 6 0. 0
黑 8526497
Hei 8526497 98. 7 91. 9 33. 5 14. 6 4. 4
　　　
　表 2 　愈伤组织诱导率 ( y1) 、接种后第 40 天愈伤组织存活率 ( y2)及愈伤组织平均生长量 ( y3) 依
γ射线 ( x1) 和毒素浓度 ( x2) 的回归方程
　　　Table 2 　Regression equation for induction frequency of callus ( y1) 、survived rate ( y2)
and mean growth amount ( y3) of callus 40 days after inoculation with respect to
γ2ray ( x 1) and concentration of toxin ( x 2)
材料
Materials
回　归　方　程
Regression equation
F 测验
F test
复相关系数
Multiple correlation
coefficent
龙辐 3 号
Longfu 3
Y 1 = 101 . 65230 - 0 . 00101 x 21 - 0 . 46060 x 2 126. 8369 3 3 0. 977155
Y 2 = 98 . 79002 - 0 . 74863 x 2 77. 2182 3 3 0. 96328
Y 3 = 0 . 14147 + 0 . 00058 x 1 - 0 . 00001 x 21 - 0 . 00067 x 2 145. 4980 3 3 0. 98763
黑 8526497
Hei 8526497 Y 1 = 104 . 50170 - 0 . 00292 x 21 - 0 . 29825 x 2 - 0 . 00060 x 22+ 0 . 00001 x 21 x 2 114. 0324 3 3 0. 98922
Y 2 = 100 . 86080 - 0 . 00233 x 21 - 0 . 53640 x 2 60. 50081 3 0. 97107
Y 3 = 0 . 14911 + 0 . 00136 x 1 - 0 . 00002 x 21 - 0 . 00051 x 2 274. 8293 3 3 0. 99819
　图 1 　60 Coγ射线与赤霉菌毒素对
愈伤组织诱导率的影响
　Fig. 1 　Influence of 60 Coγ2ray com2
bined with F. graminearum
toxin on induction frequency
of callus
　　　　　A :龙辐 3 号　Longfu 3 　
B. 黑 8526497 　Hei 8526497
(四)γ辐照与毒素复合处理对愈伤组织平均生长量的影响
50 Gy 辐照促进愈伤组织生长。有人认为 ,这是由于低剂量辐照引起植物体内修复机制过
分活动的结果[6 ] 。100 Gy 辐照 ,愈伤组织生长量低于未辐照处理。毒素抑制愈伤组织生长 ,浓
度越高 ,抑制作用越大。在γ辐照与毒素的互作效应上 ,无论两者处理水平如何 ,各处理的生
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长量显著低于对照 (图 3) 。随着毒素浓度的提高 ,在同一毒素的浓度下 ,各辐照剂量间愈伤组
织生长量的差异逐渐缩小 (仅龙辐 3 号 100 Gy + 100ml/ L 处理的略有增大) ,说明较高浓度下 ,
毒素是抑制生长的主要因素。二元多项式回归方程也表明 ,低剂量辐照刺激愈伤组织生长 ,高
剂量有抑制作用。辐照与毒素间互作效应在逐步回归中被剔除 ,两者之间为独立效应 (表 2) 。
图 2 　60 Coγ射线与赤霉菌毒素对接
种后第 40 天愈伤组织存活率
的影响
Fig. 2 　Influence of 　60 Coγ2ray com2
bined with F. graminearum
toxin on survived rate of callus
40 days after inoculation
　　　　A :龙辐 3 号　Longfu 3
B. 黑 8526497 　Hei 8526497
图 3 　60 Coγ射线与赤霉菌毒素对愈
伤组织平均生长量的影响
Fig. 3 　　Influence of 60Coγ2ray com2
bined with F. gramin2
earum toxin on mean
growth amount of callus
　　　　　A :龙辐 3 号　Longfu 3 　
B. 黑 8526497 　Hei 8526497
(五)γ辐照与毒素复合处理对得苗率的影响
从图 4 可以看出 ,毒素浓度增加 ,得苗率下降。不论辐照与否 ,50ml/ L 毒素处理对其影响
不大。超过 50ml/ L ,得苗率随毒素浓度增加而迅速降低 ,到 200ml/ L 时 ,很难得到再生植株
(龙辐 3 号得苗率均为 0 ,黑 8526497 为 0. 0～2. 9 %) 。说明本实验适宜毒素浓度应为 100～
150ml/ L 。
图 4 　60Coγ射线与赤霉菌毒素对得苗率的
影响
Fig. 4 　Influence of 60 Coγ2ray combined with
F. graminearum toxin on rate of re2
generated plantlets
　　　　A :龙辐 3 号　Longfu 3 　
B. 黑 8526497 　Hei 8526497
1 :0 + 0 　2 :0 + 50 　3 :0 + 100 　4 :50 + 0
5 :10 + 10 　6 :50 + 100 　7 :100 + 0
8 :100 + 50 　9 :100 + 100 　10 :150 + 0
11 :150 + 50 　12 :150 + 100 　13 :200 + 0
14 :200 + 50 　15 :200 + 100
50 Gy 辐照和未辐照的各相应毒素水平间得苗率差异不大。100 Gy 辐照 ,在 0～50ml/ L
毒素浓度范围内 ,其得苗率显著低于同一毒素下 50 Gy 辐照或未经辐照的处理。超过 100ml/ L
则相反 , 100 Gy 辐照的得苗率显著高于后两种辐照剂量的处理组合。考虑毒素在细胞水平上
的选择效果及本实验的适宜浓度范围 ,可以认为 ,100 Gy 辐照有利于诱发抗 (耐)毒性变异体。
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(六)毒素处理对再生植株苯丙氨酸裂解酶活性的影响
由表 3 看出 ,未经毒素处理的再生植株 ,苯丙氨酸裂解酶活性与原品种 (系)赤霉病抗性强
弱呈一致趋势 ,中抗品系黑 8526497 明显高于感病品种龙辐 3 号。100ml/ L 毒素处理的再生
植株 ,酶活性显著高于对照。感病材料提高的辐度大于中抗材料 (分别为 60. 2 和 42. 7) 。不
同抗性材料的再生植株酶活性差异 ,以未经毒素处理的为大 (28. 9) ,处理后差异明显减小
(1114) 。
表 3 　再生植株苯丙氨酸裂解酶活性
　　　　Table 3 　Activity of phenylalanine aminolyase of regenerated plantlets
材　　料
Materials
毒　素　浓　度
Concentration of toxin (ml/ L)
0
(x1)
100
(x2)
差　　值
Difference
x2 - x1
龙辐 3 号
Longfu 3 (a)
25. 6 85. 8 60. 2
黑 8526497
Hei 8526497 (b) 54. 5 97. 2 42. 7
差　值
Difference
b - a
28. 9 11. 4
讨 　　论
　　从本实验结果看出 ,γ辐照与毒素处理引起诱导率与得苗率下降 ,并在一定程度上抑制愈
伤组织的生长与存活。复合处理的效应不是两因素单一处理效应的简单相加。因此 ,在运用
人工诱变技术进行抗病突变体离体筛选时 ,应根据所用外植体种类、材料基因型及毒素效价等
因素 ,综合考虑细胞水平的选择效应 ,以及抗性鉴定所需群体的大小来选用适宜的剂量组合 ,
才能获得较理想的结果。与感病材料相比 ,中抗材料再生植株的苯丙氨酸裂解酶活性较高 ,木
质素合成较快 ,可能是其抗性较强的生化机制之一。这与王敬文等抗马铃薯晚疫病研究中的
结果一致[7 ] 。100ml/ L 毒素培养基上得到的再生植株 ,其酶活性显著高于无毒素培养基上得
到的对照 ,并且再生植株中该酶活性的大小与原材料田间赤霉病抗性的强弱呈现一致的趋势 ,
因而该酶活性的变化可以作为毒素处理效应的一个生化参考指标。
北京中软计算机研究所谢炜同志完成数据处理 ,特此致谢。
参 　考 　文 　献
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2 　郭丽娟等. 通过组织培养筛选小麦抗赤霉病突变体的研究. 遗传学报 ,1992 ,19 (3) :259～265
3 　陆维忠等. 抗小麦赤霉病体细胞无性系变异的选育. 植物体细胞无性系变异与育种 ,南京 :江苏科学技术出版社 ,1991 ,
112～116
4 　张树荣等. 镰刀菌毒素的研究. 真菌学报 ,1985 ,4 (4) :255～259
5 　莫惠栋. 农业试验设计. 上海 :上海科学技术出版社 ,1984
6 　顾瑞奇 1 辐射对植物细胞的伤害及其修复 1 植物生理学通讯 ,1981 ,5 :1～6
9513 期 γ辐照与赤霉毒素复合处理对小麦幼胚离体培养的影响 　
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1978 ,5 :992～994
EFFECTS OFγ2RAY IRRADIATION COMBINED WITH CRUDE TOXIN PROD UCED BY
Fusa rium graminea rum ON WHEAT IMMATURE EMBRYO in vit ro CULTURE
Li Sherong 　Li Ansheng 　Zhang Jing 　Xu Wu 　Li Ming
( Instit ute of Genetics , Academia Sinica , Beiji ng 100101)
Sun Guangzu 　wang Guangjin 　Tang Fenglan 　Li Zhongjie 　Zhang Yuexue
( Instit ute of Crops B reeding , Heilongjiang Academy of A gricult ure Sciences , Harbin 150086)
ABSTRACT
　　Dry seeds of spring wheat were exposed to 0 , 50 , 100 , 150 Gyγ2ray and grown into M1
plants. The immature embryos were respectively cultured in the media containing 0 ,50 ,100 ,150
or 200 ml/ L of crude toxin of Fusa rium graminea rum. The results showed that the induction
frequency of callus , survival rate and the mean growth amount of callus 40 days after inocula2
tion were reduced with the increase of dose ofγ2ray or concentration of toxin. Most of dosage ef2
fects of combined treatment(γ2ray + toxin) tally with quadratic multinomial regression equa2
tion . The activity of phenylalainine aminolyase in regenerated plantlets from 100ml/ L toxin was
signif icantly higher than that of plantlets from no2toxin media.
Key words : Wheat immature embryo , irradiation , toxin of Fusari um gram i nearum , com2
bined treatment , i n vit ro culture
061 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1996 ,10 (3) :155～160