全 文 ：文章编号 :100028551(2003) 042304204
血清雌二醇放射免疫试剂盒的研制
张丁联　潘家荣　王　斌
(中国农业科学院原子能利用研究所 ,农业部农业核技术与航天育种重点开放实验室 ,北京　100094)
摘　要 :制备了雌二醇抗体 (抗 E2262CMO2BSA)和125 I放射配体 E2262CMO2histamine2125 I ,建
立了血清雌二醇放射免疫分析方法 ,其特点是通过微量标记法提高标记物比活度 ,不用
乙醚萃取直接测定血清样本 ,简化了测量步骤 ,缩短了测量时间 , 且试剂稳定时间可延
长至 2 个月以上。应用本法可以快速测量动物及人的血清样本 ,215～3h 即可得出结
果。
关键词 : 雌二醇 ; 抗体 ; 125 I放射配体 ; 小体积标记 ; 放射免疫分析
收稿日期 :2002205215
作者简介 :张丁联(1970～) ,男 ,工程师 ,从事免疫分析方面研究。
雌二醇 (E2 )是天然雌激素的重要成分 ,并且是女性月经周期中分泌的主要雌性激素。测定
血清中 E2 的含量具有重要的医学意义 ,而监测动物血清中 E2 的含量对研究动物内分泌、发育和
繁殖也十分必要。在食品安全方面 ,为防止少女性早熟等问题 ,农产品和食品中的雌二醇的监测
也是不容忽视的[1 ,2 ] 。
雌二醇的测定多采用放射免疫分析、酶联免疫分析或化学发光免疫分析 ,其中放射免疫分析
成本低而且结果准确[3 ] 。由于 E2 的含量很低 ,测定时要求标记物有较高的比活度 ,而 1 个月后
标记物比活度下降灵敏度可能达不到要求 ,所以试剂盒一般需每月制备。本研究试图通过采取
微量小体积标记法 ,提高标记物比活度 ,同时配合其他措施 ,研制不用乙醚萃取而可直接测定血
清样本雌二醇的放射免疫试剂盒 ,并延长试剂盒的稳定期。
1 　材料与方法
111 　试剂
雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、孕酮、醛固酮、DHEA、E2262CMO 及 histamine 购自 SIGMA 公司 ,
其他化学试剂购自北京化学试剂公司 ,Na 125 I购自中国原子能研究院。
112 　研制方法
11211 　抗 E2262CMO2BSA 的制备[4 ] 　取 E2262CMO 512mg 溶于 200μl 二氧六环中 ,在 10 ℃下加入
2μl 三正丁胺和 1μl 氯甲酸异丁酯 ,搅拌 30min。然后滴加到含 2513mg BSA 的 50 %二氧六环水溶
液 (pH8)中。自来水透析 1d 后 ,再用双蒸水透析 2h ,得到免疫原 E2262CMO2BSA。经紫外吸收测
量计算 E2 与BSA 的摩尔比值为 17∶1。1mg 免疫原与 215ml 福氏完全佐剂乳化后免疫每只家兔 ,
之后改用福氏不完全佐剂每月加强一次 ,剂量减半 ,免疫 4 次经检验合格后 ,动脉取血并分离血
403　 核 农 学 报　2003 ,17(4) :304～307Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
清 ,冻干保存。其中的 9 号兔的各项指标较优 ,在 B0ΠT = 50 %时稀释度为 1∶8000 ,经 Scatchard 法
计算其亲和常数为 714 ×109LΠM ,与 Estriol 交叉反应 016 %。
11212 　125 I2E2262CMO2His 的制备[5 ] 　取 E2262CMO 312mg 溶于 100μl 二氧六环中 ,在 10 ℃下加入
1μl 三正丁胺和 015μl 氯甲酸异丁酯 ,搅拌 30min。然后滴加到含 313mg histamine 的 80 % 二氧六
环水溶液 (pH = 8)中 ,4 ℃反应过夜后在日立LC2635 HPLC上层析 ,用 20 %～85 %甲醇梯度溶液洗
脱 ,采用紫外监测 ,得标记前体 E2262CMO2His (图 1) 。
图 1 　标记前体 E2262CMO2His经 HPLC
纯化的紫外监测图
Fig. 1 　UV curve of E2262CMO2His
with HPLC purification
图 2 　125 I2E2262CMO2His经 HPLC
层析后的放射性监测图
Fig. 2 　Radioactivity curve of 125 I2E2262CMO2His
with HPLC purification
　　取 012μg(1μl) E2262CMO2His 于尖底标记瓶中 ,加 0105M PB (pH = 714) 10μl ,加入 Na 125 I 1mCi
(215μl) ,氯胺 T50μg(5μl) ,在混合器上混匀反应 1min。加入偏重亚硫酸钠 100μgΠ50μl 终止反应。
混匀后溶液用日立LC2635HPLC 分离 ,洗脱液为 20 %～85 %的甲醇溶液 ,第 1 放射性峰位为游离
125 I ,第 2 强放射性峰位为125 I2 E2262CMO2His ,第 3 强放射性峰位为副产物 (图 2) 。
11213 　标准品的配制　取 E2 113mg 溶于无水 100ml 乙醇中 ,此为母液 ,以经透析处理过的小牛血
清为基质 ,倍比稀释配制系列标准 3670、1830、918、459、230、115 和 5715pmolΠL。用本标准测定中国
药品生物制品检定所的质量控制血清 L、M、H 值分别为 273、613、1370 pmolΠL ,与靶值 282、564、
1320 pmolΠL 的偏差均在 5 %之内 ,说明本标准是准确。
11214 　放免操作步骤　(1)标记物的配制 :125 I2E2262CMO2His 以 0102M 磷酸盐缓冲液 (pH = 714)配
制成约 30000～40000cpm ,并加入 015 %BSA、012 %阻断剂A、0101 %阻断剂B 和 011 %NaN3 ,该试剂
4 ℃下至少稳定 60d。
(2)抗体的配制 : 抗体按 1∶8000 稀释倍数稀释 ,稀释液为 0102MPB。并加入 015 %BSA 和
011 %NaN3 。该试剂 4 ℃下至少稳定 60d。
(3)分离剂的配制 :0102M Tris 缓冲液 (pH815)含 3 %PEG6000、2 %羊抗兔二抗、011 %正常兔血
清和 011 %NaN3 。该试剂 4 ℃下至少稳定 60d。
(4)测定步骤 :按表 1 加样和操作后充分混匀 ,室温放置 15min ,以 1500g 离心 15min ,吸去上
清 ,在 XH26020γ2计数器测沉淀计数 ,在程序中采用放免程序 ,4 参数回归方式进行测量。125 I2E2放
免试剂盒加样顺序如表 1 所示。
503　4 期 血清雌二醇放免试剂盒的研制
表 1 　E2 放射免疫分析步骤
Table 1 　Procedure for E2 radioimmunoassay
NSB S0 S12S7 样品 sample
蒸馏水 H2O 100μl — — —
标准 standard 50(S0)μl 50μl 50μl —
样品 sample — — — 50μl
125 I2E2 100μl 100μl 100μl 100μl
抗体 antibody — 100μl 100μl 100μl
充分振摇 ,37 ℃放置 2h 　vortex and incubate at 37 ℃for 2hours
分离剂(PR)
seperation reagent (PR) 500μl 500μl 500μl 500μl
2 　结果与分析
211 　抗 E2262CMO2BSA血清
图 3 　雌二醇放免试剂盒测定标准曲线的稳定性 (60d)
Fig. 3 　Stability of the standard curve of the
E2 RIA kit within 60 days
本实验用自制免疫原免疫家兔。第 1 次免疫了 5 只兔子并未得到合适的抗体 ,第 2 次才得
到 1 只抗体较好的 9 号兔子 ,滴度达 1∶8000 。其与雌三醇的交叉反应仅为 016 %。雌二醇的免疫
测定对抗体要求较高 ,由于动物个体之间的免疫应答能力存在显著差异 ,因此 ,免疫动物时必须
较大数量地免疫 ,从中筛选出亲和常数高、特异性好的抗体。
212 　E2262CMO2His 的125 I标记
图 1 为合成的标记前体 E2262CMO2His 的 HPLC 纯化图。本实验采取了微量小体积标记法 ,
仅标记 012μg 的底物 ,氧化反应体积仅为 1715μl ,产物 E2262CMO2His2125 I比活度达到 3550μliΠμg ,灵
敏度 (95 %可信度)提高 3 倍。从图 2 可以看出 ,第 1 放射性峰位—游离125 I 和第 3 放射性峰位—
副产物含量较少 ,产物比活度较高 ,标记率也较高。标记物的比活度是影响免疫测定的重要因
素 ,为提高标记物的比活度 ,采取微量体积标记法是可行的。
213 　试剂盒测定结果
本试验研制的雌二醇放免试剂盒的
一个标准曲线结果 (图 3) :B0ΠT = 4918 %;
NSBΠT = 312 %; 4 参数线性回归 r =2
01999 ;灵敏度为 519pmolΠl ;抗体交叉反
应 : estriol < 016 %; estrone < 112 %; testos2
terone < 011 %; progesterone < 011 %; aldo2
sterone < 011 %;DHEA < 011 %。
回收率 :1 份样品加入 185 pmolΠL 和
1350pmolΠL 回收率为 10215 %和 9314 %。
样品稀释实验 :1 份样品测定值 840
pmolΠl ,经 1Π2、1Π4、1Π8、1Π16 稀释 ,线性回
归 r =201996。
本试剂盒正常值 : 人 : 青春期前
32pmolΠL (1 例) ;男性成年 39～373pmolΠL
603 核　农　学　报 17 卷
(10 例) ;女性成年 51～1796pmolΠL (10 例) 。
动物 :羊 39～175pmolΠL (20 例) ;牛 5～83pmolΠL (5 例) ;鸡 42～213pmolΠL (6 例) ;马 26～
118pmolΠL (6 例) 。
214 　直接测定血清样品时干扰因素的排除
放射免疫分析直接测定血清样品时 ,由于血清中存在多种结合蛋白 ,需要加入阻断剂使 E2
从结合蛋白中剥离出来。在对比多种阻断剂的效果后 ,发现 012 %阻断剂 A 与 0101 %阻断剂 B
联合使用效果较好。虽然由于各种动物的血清中蛋白种类和浓度不同而造成各种类的动物血清
中测定 E2 的回收率不完全相同 ,但是对于同一种动物的血清 ,测定的准确性是有保证的。
215 　雌二醇放射免疫试剂盒的稳定性
为方便用户测定 ,将各种试剂配制成为能直接使用的液体 ,组成试剂盒 ,该试剂盒在 4 ℃下
存放 60d ,标准曲线无较大变化 ,仅 S1 下降 3 % ,S7 上升 2 % ,零结合率下降 910 % ,试剂盒仍十分
可靠 (图 3) 。
致谢 :参加本实验的还有张利增、张文功等同志 ,在此致谢。
参考文献 :
[ 1 ] 　李振甲 ,等 1 激素的放射免疫分析 1北京 : 科学技术文献出版社 , 1984 , 393～399
[ 2 ] 　郭大智 ,等 1 应用同位素技术测定山羊血浆和乳中孕酮、雌二醇浓度及甲状腺功能 1 原子能农业应用 1986 , 2 ,61～64
[ 3 ] 　Frank Z , et al1 Use of 125 I2histamine2labeled steroid derivatives as radioligands for radioimmunoassay of natural and synthetic steroids1
J Steroid Biochem1 1981 , 14 : 53～62
[ 4 ] 　田美容 ,等 ,类固醇2蛋白质结合物 1 北京师范大学学报 , 1979 :38～46
[ 5 ] 　纪弟等 ,雌二醇262碘代组胺的制备 1 原子能科学技术 1989 , 33～36
RADIOIMMUNOASSAY FOR ESTRADIOL IN SERUM
ZHANG Ding2lian 　PAN Jia2rong 　WANG Bin
( Institute for Application of Atomic Energy , CAAS , Key Lab of Agricultural Nuclear Technology and Aerospace
Breeding , Ministry of Agriculture , Beijing 　100094)
Abstract :A sensitive radioimmunoassay for estradiol was set up without extraction1 The antisera
were rabbits anti2estradiol262CMO2BSA with a cross2reaction ratio of 016 % against estriol1 Pre2
synthesized estradiol262CMO2His was labeled with 125 I in a tiny volume ( 1715μl) 1 Highly purified
radioactive ( 3550μCiΠμg) estradiol262CMO2His2125 I was obtained1 This estradiol radioimmunoassay
kit is stable for at least two months1 It can be used for studying animal endocrinology and clinical
endocrinology1
Key words :estradiol ; radioimmunoassay; antibody; 125 I2radio ligand ;tiny volume labeling
703Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17(4) :304～307