全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052447204
绿僵菌航天诱变菌株的 DNA 变异性分析
农向群　胡　攀　张泽华
(中国农业科学院植物保护研究所 ,北京　100081)
摘 　要 :昆虫病原真菌绿僵菌 M2189 菌株经航天搭载诱变后 ,分离得到 200 多个单孢菌株。以 9 个随机
引物对 47 个诱变菌株进行 PCR 扩增 ,获得了 38 个位点的共 1381 条 DNA 片段。统计分析表明 ,47 个诱
变菌株在 DNA 水平上发生了不同程度的变异 ,变异系数在 01062～01406 之间 ,平均为 01176 , > 013 的
有 3 个菌株。由聚类分析可将 47 个诱变菌株划分为 14 个组群 ,组间变异率小于 012 ,与原始菌株相比
变异系数接近的诱变菌株无规律地分散在不同组群中 ,说明航天诱变导致 DNA 变异的位点和频率是随
机的、分散的 ,并无特定位点。航天诱变为选育生物防治优良菌株提供了新途径。
关键词 :航天诱变 ;绿僵菌 ;RAPD 分析
DNA VARIABILITY ANALYSIS OF SPACE INDUCED
METARHIZIUM ANISOPLIAE
NONG Xiang2qun 　HU Pan 　ZHANG Ze2hua
( Institute of Plant Protection , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081)
Abstract :Metarhizium anisopliae M2189 , an effective entomopathogenic fungal strain , was boarded on a spacecraft aviating at
the height of 200～350km for 18d. After landing , single spores of the strain were inoculated on PDA medium supplemented
with 1 % peptone , and more than 200 isolates were obtained. 47 isolates were analyzed in respect of DNA variability based on
PCR by 9 random primers. Results showed that 1381 DNA fragments were obtained at 38 sites. Their variant coefficients of
DNA polymorphism relative to initial strain were in the range of 01062～01406 , mostly at 011～013 and 01176 averagely.
Three mutants had over 013 variant coefficients among the mutated isolates. Cluster analysis could divide the 47 isolates into
14 groups , on 012 variant coefficients between the groups. Those isolates with less variant coefficients were distributed in
different groups. It was indicated that aerospace mutation would affect DNA at random sites. Aerospace mutation could be used
as to obtain new entomopathogenic strain for biological control .
Key words :space mutagenesis ; entomopathogenic fungi ; Metarhizium anisopliae ; DNA variability
收稿日期 :2007201210
基金项目 :国家 863 项目资助 (20032AA2241130)
作者简介 :农向群 (19642) ,女 ,广西柳州人 ,副研究员 ,从事昆虫病原真菌研究。E2mail : xqnong @sina. com　　昆虫病原真菌绿僵菌 ( Metarhizium spp . ) 能高效侵染多种农林害虫 ,是生物杀虫剂研制和应用的重要资源。为了获得毒力强、环境适应性好的菌种 ,大多需要经过菌株人工改良或改造。航天诱变已在一些农作物和微生物的育种工作以及提高微生物产酶量和产抗生素量等中取得成效[1～5 ] 。作者曾报道航天诱变导致绿僵菌菌株菌落、毒力等表型特征的大范围变异[6 ] ,本文报道航天诱变对菌株遗传物质 DNA 的影响。 1 　材料和方法111 　菌株金龟子绿僵菌 ( Metarhizium anisopliae) M2189 为对蝗虫高致病力菌株 ,由本研究所保藏。航天搭载后经分离得到单孢菌株 ,编号为在原始菌株号前加“H”、后
744　核 农 学 报　2007 ,21 (5) :447～450Journal of Nuclear Agricultural Sciences
加自然数顺序号。
112 　航天搭载
将试验菌株接种在添加 1 %蛋白胨的 PDA 培养基
上于 25 ℃培养 15d ,室温下自然干燥后收集分生孢子 ,
转移到细塑料管中 ,密封送交航天搭载。
所搭载航天器为我国第 18 颗返回式科学技术与
实验卫星 ,卫星轨道的近地点 200km ,远地点 350km ,轨
道倾角为 63°,平均周期 90min ,运行时间为 2003 年 11
月 3 - 21 日 ,共 18d。
113 　DNA 变异分析
搭载的孢子初次接种形成的单孢菌落定为航天菌
株 0 代 ,对继代转接至第 3 代进行检测。用 RAPD2PCR
方法检测诱变菌株相对于原始菌株的 DNA 变化 ,同时
分析诱变菌株之间的随机扩增 DNA 多态性。
用 CTAB 方法提取 DNA ,调整浓度为 20μgΠml。用
9 个随机引物 (华美生物工程公司 , MQ8361、MQ8362、
MQ8364、MQ8365、MQ8366、MQ8367、MQ8372、MQ8373、
MQ8374) 进行 PCR 扩增。扩增反应体系 25μl ,其中含
1215μl Premix Taq (宝生物工程大连有限公司) ,1μl 随
机引物 , 2μl DNA 模板 , 915μl 纯水。热循环程序为
94 ℃预热 4min →94 ℃变性 30sec ,36 ℃退火 1min ,72 ℃
延伸 115min ,循环 40 次 →72 ℃延伸 10min。PCR 结果
用 1 %琼脂糖凝胶电泳分离 ,在凝胶成像系统上照相
记录。用 NTSYS 统计软件进行变异性分析。
2 　结果与分析
以 9 个随机引物对随机选出的 47 个航天诱变菌
株进行 RAPD2PCR ,结果在 38 个位点获得了 1381 条
DNA 片段 ,平均每菌株 28 条 ,片断长度 500～3000bp ,
单个引物获得片段数为 1～6 个 (图 1) 。
图 1 　金龟子绿僵菌 M2189 航天诱变菌株的 RAPD 图谱
Fig 1 　RAPD patterns of Metarhizium anisopliae M2189 strain and the isolates by aerospace mutation
图中上、下部分引物分别用 MQ8366、MQ8374。M: Marker ;C : 原始菌株 ;1～47 :航天诱变菌株。
Patterns upside and downside by primer MQ8366 and MQ8374 , respectively.
M: marker ; C : initial strain ; 1～47 : mutated isolates
　　变异性分析表明 ,47 个诱变菌株与原始菌株相比
的变异系数在 01062～01406 之间 ,7817 %的菌株变异
程度在 011～013 ,平均变异系数为 01176 ;有 3 个菌株
的变异系数在 013 以上 , 即 HM218928 为 01406 ,
HM2189225 为 01394 和 HM2189238 为 01303 ,变异最小
菌株 HM2189242 (表 1) 。
3 次重复的 PCR 图谱显示 ,有 18 个位点的谱带稳
定且清晰 ,其中有 5 个位点即 4、5、18、25 和 35 号位点
没有发生变异 ,其他 13 个位点各有不同频率的变异 ,
最高频率变异发生在 8 号位点 ,达 1218 % ,平均变异频 率为 4149 %(表 2) 。由聚类分析 (图 2) 可将 47 个诱变菌株划分为 14个组群 ,组间的相似系数为 018 ,变异率小于 012。很明显 ,第 1 组群中的 2 号和 42 号菌株与原始菌株最为相似 ,而 8 号菌株的变异最大 ,相似性系数只有 01594 ,而且与其他诱变菌株的相似性程度也很低。从图中可以看到 ,与原始菌株相比 ,变异系数接近的诱变菌株被无规律地划分在不同的组群中 ,说明航天诱变导致DNA 变异的位点和频率是随机的、分散的 ,并无特定位点。
844 核　农　学　报 21 卷
表 1 　航天诱变导致金龟子绿僵菌菌株 DNA 突变的几率
Table 1 　Probability of Metarhizium anisopliae DNA variation by aerospace mutation
项目
item
变异系数范围 variant coefficients
01001～01100 01101～01200 01201～01300 01301～01400 01401～01500
株数
number of isolates
6 27 11 2 1
几率
probability( %) 1218 5714 2113 614 211
表 2 　金龟子绿僵菌航天诱变菌株在 RAPD 18 个位点的变异频率
Table 2 　Frequency of Metarhizium anisopliae DNA variation at 18 RAPD sites induced by aerospace mutation
项目
item
谱带位点 site number
1 3 4 5 6 8 9 11 14 18 23 24 25 30 31 32 35 36
变异数 variant count 1 4 0 0 1 6 4 5 3 0 2 1 0 3 3 3 0 2
变异频率 variation frequency( %) 2112 8151 0100 0100 2112 1218 8151 1016 6138 0100 2125 2112 0100 6138 6138 6138 0100 4125
平均变异频率
average variation frequency( %) 4149
图 2 　金龟子绿僵菌 M2189 原始菌株与航天诱变菌株 RAPD 聚类分析图
Fig 2 　Cluster analysis of RAPD from Metarhizium anisopliae M2189 strain and the isolates by aerospace mutation
C: 原始菌株 ;1～47 : 航天诱变菌株。C: initial strain , 1～47 : mutated isolates
3 　讨论
生物种质经航天搭载受到太空环境中强辐射、微
重力等因素的复合作用 ,会引起生理变异、遗传变异甚
至失去生命力[7 - 9 ] 。航天搭载后 ,需要对种质各项生
物学特性的变异进行检测和评估 ,工作量大而且繁琐。
DNA 指纹技术在遗传性状变异的检测方面显示出通
用、快捷、准确的优点 ,蒲志刚、王丰等分别用 AFLP 和
SSR 分子标记检测分析了水稻经空间诱变的遗传变异
及突变体[10 ,11 ] 。本试验一同交送航天搭载的还有 5 个
菌株 ,其中 3 菌株完全死亡 , 2 菌株的存活率只有
944　5 期 绿僵菌航天诱变菌株的 DNA 变异性分析
10 - 6 。本研究中绿僵菌 M2189 菌株的存活率达到
2118 % ,表现出很强的诱变抵抗力 ;存活的孢子所形成
菌落形态、生长特性均有很大分化[6 ] ,该菌株航天诱变
后在 DNA 水平上发生了多位点、大幅度变异。在所有
诱变存活菌株中 ,根据 RAPD 分析表明 DNA 的变异系
数均未超过 01406 ,或许可以推测 ,当 DNA 变异达到一
定程度如 40 %以上 (变异系数 > 014) 就可能导致不可
修复的损伤 , 致使菌株死亡。菌株 HM218928 和
HM2189225 菌株变异系数达到 01406 和 01394 ,明显的
高于其他的菌株 ,如此强烈的变异必定反映到其生物
学表型特征上 ,已测定证明这两个菌株的产孢量和杀
虫毒力明显低于原始菌株[6 ] ,由航天诱变导致的 DNA
变异与生物学特性变异关系值得进一步研究。另外 ,
从 PCR 扩增图谱可清晰辨别出一些扩增位点有明显
缺失 ,可能是因为这些位点核苷酸发生了丢失或变异 ,
无法与相应引物序列结合。个别位点出现片断重叠 ,
可能是在引物结合位点附近区域有重复序列或有相似
序列插入所至。可将这些变异的片断回收纯化后 ,进
行 Southern 杂交或核苷酸测序 ,与原始菌株相应片段
比较 ,确定 DNA 变异类型及核苷酸差异 ,以进一步研
究其对应的生物学功能变化。
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2007 ,21 (5) :447～450