全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0220081205
苹果体细胞无性系变异的 RAPD 评估
达克东1 　金德敏2 　伏建民1 　王　斌2 　束怀瑞1 　李雅志1
(11 山东农业大学园艺系　山东 泰安　271018 ;21 中国科学院遗传所　北京　100101)
摘 　要 :以苹果栽培品种 Gala 试管苗叶片为材料 ,将叶片刺伤后接种于附加了 BA
1mgΠL、2 ,42D 015mgΠL 和 NAA 5mgΠL 的 MS 培养基 ,黑暗培养 7d 后转移至附加 BA
1mgΠL 的 MS 培养基 ,继续暗培养 40d ,97 %叶片发生直接类型体细胞胚胎 ,单位叶片
平均再生体细胞胚胎 25 个。对来自同一植株上的前 3 片展开叶中的 1 片叶进行组
织培养 ,再生得到 15 株直接体细胞胚胎发生、植株再生后代。应用随机扩增多态性
DNA(RAPD)分析技术 ,以供体 (原初供体)为对照进行了供体和再生体间及再生体彼
此之间体细胞无性系变异研究 ,没有观察到供体和再生体间及再生体彼此之间有
DNA 多态性 ;接着用同样的方法对上述 15 株体细胞胚胎植株随机抽取 7 个单株单叶
进行培养 ,得到二代直接体细胞胚胎植株 ,分别从 7 个单株单叶再生的二代植株中各
随机抽取 1 株 ,再次用 RAPD 方法进行原初供体和二代再生体间及二代再生体之间
体细胞无性系变异分析 ,结果二代直接体细胞胚胎植株 5 和引物 OPF206 组合中出现
一条多态带 ,其分子量约为 900bp ,命名为 OPF206900 ,重复 3 次多态性稳定。结果表
明 ,苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生途径再生植株的体细胞无性系变异率接近自
然变异率。
关键词 :苹果 ;体细胞胚胎 ;体细胞无性系变异 ;RAPD
收稿日期 :1999201227
作者简介 :达克东 (1967～) ,男 ,甘肃兰州人 ,博士 ,山东农业大学园艺系 ,主要从事植物生物技术和辐射研究
植物离体培养植株再生对于离体快繁和遗传转化具有重要意义 ,植物离体培养体细胞胚
胎发生因其发生数量大、同步化程度高和单细胞起源而受到研究者的重视。离体培养植株再
生技术应用于离体快繁和遗传转化的前提是再生体与原初供体保持遗传上的高度一致。体细
胞无性系变异是指离体培养中培养外植体在脱分化增殖和再生过程中产生的可遗传变异[5 ] 。
体细胞无性系变异在很多植物离体培养再生后代中观察到[6 ] 。传统鉴定体细胞无性系变异的
方法有 3 种 :表型鉴定、细胞学鉴定和同工酶鉴定。表型鉴定的优点是一旦鉴定出来就可直接
应用 ,缺点是鉴定变异是否发生需很长时间 ,特别是果树 ,童期一般为 5～7 年。细胞学鉴定可
以发现染色体畸变和数目及结构变化 ,但是单个基因变化不足以引起染色体表型变化 ,同时苹
果染色体型态很小 ,不易于细胞学观察。同工酶鉴定的特点是方法简便 ,但检出生化标记少和
对环境及发育阶段敏感是其缺点。近年来 ,从 DNA 水平上鉴定体细胞无性系变异的方法不断
出现 ,目前比较常用的方法有以Southern 杂交为基础的限制性片段长度多态性 (RFLP) [8 ] 和以
PCR 为基础的随机扩增多态性 DNA (RAPD) [9 ] 。RFLP 结果稳定 ,但必须经过滤膜转移和Sou2
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thern 杂交 ,费时、费力、周期长。RAPD 比 RFLP 便宜 ,方便易行 ,DNA 用量少 ,而且不需要同位
素 ,安全性好。本文报道用 RAPD 方法对两代苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生、植株再
生后代体细胞无性系变异进行评估。
1 　材料与方法
111 　材料
苹果 Malus domestica Bhorkh. 栽培品种试管苗。
112 　苹果离体叶片培养高效体细胞胚胎发生
取试管苗顶部前 3 片展开叶 ,分别在叶片 6 个亚区中心部位参照文献 [ 1 ]的方法各刺一
点 ,每片叶片共刺 6 点。然后将刺伤叶片接种于 MS + BA 1mgΠL + NAA 4mgΠL + 2 ,42D 015mgΠL
+ 蔗糖 20gΠL 培养基上 ,暗培养 7d 后 ,转接到 MS + BA 1mgΠL + 蔗糖 20gΠL 的培养基上继续暗
培养 ,40d 后刺伤口周围发生一次直接类型体细胞胚胎 ,单位叶片发生体细胞胚胎 25 个 ,转移
至光照条件下培养 10d 后随机选择 1 片发生了体细胞胚胎的叶片 ,将其上已经发绿的体细胞
胚胎随机选择 15 个接种到 MS + BA 014mgΠL 的培养基光照培养。光照培养的体细胞胚胎植株
生长到 4cm 时 ,将整个植株取材提取 DNA。在提取 DNA 之前 ,随机选择 15 株中的 7 株上的前
3 片展开叶中的 1 片 ,按照上述方法进行二次体细胞胚胎发生培养 ,当进行到光照培养 10d 时 ,
分别从 7 片叶片发生的体细胞胚胎中各随机选择 1 个 (共 7 个)进行光照培养。
113 　DNA提取
称取鲜嫩试管苗 1g ,加液氮研磨后 ,立即放入预热的 DNA 提取液中 ,加巯基乙醇 (50∶1 ,vΠ
v) ,65 ℃预热 7～10min ,加入 215ml KAc (5molΠL)冰浴 10～15min ,加 215ml 氯仿2异戊醇 (25∶1) ,
室温静置 10～15min ,离心 5min ,取上清液加等体积酚2氯仿抽提 1 次 ,取上清液 ,滴入异丙醇
中 ,20min 后将丝状 DNA 挑出来 ,70 %乙醇洗盐后置于超净工作台吹干 ,溶于 TE备用。
114 　RAPD 扩增反应
扩增反应在 25μl 体积中进行 ,其中含有 10mmolΠL Tris2HCl (pH810) 、214mmolΠL MgCl2 、
dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0115mmolΠL、引物 012μmolΠL、50ng 总 DNA、1 单位 Taq 酶。扩增反应
在 Perkin2Elmer Cetus 480 型DNA 扩增仪上进行。整个反应程序为 :首先在 94 ℃预变性 4min ,然
后进行 42 个循环的扩增反应 ,每个循环包括 94 ℃245s、37 ℃21min、72 ℃2115min ;最后在 72 ℃延
伸 min ,4 ℃保存。扩增产物在 112 %琼脂糖凝胶中电泳 ,经 EB 染色后在紫外灯下观察 ,记录 ,
照相。
2 　结 　果
211 　入选引物原供体 DNA扩增实验
以原初供体 DNA 为模板 ,随机挑选 A、C、D、F、I、K、M、N、O、Q、S、U、W、Y各组中引物 200
个 ,进行扩增反应。从扩增结果看 ,不同组别引物扩增出带率不同 ,一些组的引物可以百分之
百在原供体中扩增出 RAPD 标记带 (图版 Ⅰ) ,另一些组中个别引物却不能在原供体中扩增出
RAPD 标记带 (结果未照相) 。扩增出带的碱基对长度在 300～4900bp 之间 ,基本呈正态分布 ,
集中分布在 2000bp 左右 ,不同引物扩增出的带有的亮 ,有的暗 ;有的扩增出的带多 ,有的少。
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图版 Ⅰ　以对照 DNA 为模板不同引物的 RAPD 产物
Plate Ⅰ　RAPD pattern amplified with different primers using CK DNA as template
引物 :OPN2012OPN212 ;OPO2012OPO204
Primer :OPN2012OPN212 ;OPO2012OPO204
212 　一次直接类型体细胞胚胎植株的体细胞无性系变异
根据原供体扩增的结果 ,从 200 个引物中选取 150 个扩增出带多而亮的引物 ,同时对 15
个一次直接体细胞胚胎植株和原供体样品用不同的引物进行 RAPD 扩增反应 ,总共出现 18370
条 RAPD 标记带。通过比较再生体间及再生体与供体间 RAPD 标记带 ,没有发现 DNA 多态性
差异 (图版 Ⅱ- A、B) 。RAPD 扩增结果说明苹果叶片一次直接体细胞胚胎发生、植株再生后代
没有体细胞无性系变异。
图版 Ⅱ　叶片直接体细胞胚胎发生途径再生的 15 株一次胚植株的 RAPD 产物
Plate Ⅱ　RAPD pattern amplified with OPD20F6 (A) and OPU201 (B) of 15 primary
regenerants via leaf direct somatic embryogenesis
A :引物 OPD - 06 ; B 引物 OPU - 01
213 　二次直接类型体细胞胚胎植株的体细胞无性系变异
对 7 株二次直接体细胞胚胎发生、植株再生后代进行体细胞无性系变异分析时 ,扩增用引
物是从扩增一代体细胞胚胎植株的 150 个引物中随机挑选出 100 个 ,分别用所选择的引物对 7
38　2 期 苹果体细胞无性系变异的 RAPD 评估
株二次直接体细胞胚胎植株和原供体进行 RAPD 扩增反应。结果出现了 5397 条 RAPD 标记
带 ,只在二次体细胞胚胎植株 5 和引物 OPF206 组合 RAPD 扩增中出现 1 条 DNA 多态性差异 ,
其分子量约为 900bp ,重复 3 次多态稳定 (图版 Ⅲ- C) ;其余引物均未出现 DNA 多态性差异 (图
版 Ⅲ- A ,B) 。说明同一样品多次培养再生时后代要产生体细胞无性系变异。
图版 Ⅲ　叶片直接体细胞胚胎发生途径再生的 7 株二次胚植株的 RAPD 产物
Plate Ⅲ　RAPD pattern of 7 secondary regenerants via leaf direct somatic embryogenesis
A :引物 OPC - 07 ; B :引物 :OPU - 15 ; C :引物 OPF - 06
A : primer OPC - 07 ; B :primer OPU - 15 ; C :primer OPF - 06
3 　讨 　论
植物离体再生技术应用于离体快速繁殖产业可以极大提高繁殖的速度 ,苹果离体叶片不
定芽发生技术已经应用于苹果的遗传转化 ,能否应用于离体快繁尚不确定。栽培品种无性器
官 (组织)培养体细胞胚胎发生是制造植物人工种子的基础。外植体体细胞胚胎发生依照其发
生方式可分为直接再生和间接再生 ;依照培养方式来分 ,可分为原生质体培养再生、细胞培养
再生和器官培养再生。细胞悬浮培养再生的体细胞胚胎因为具有发生数量大、同步化程度高、
适于机械化操作的特点 ,而成为制造人工种子的首选培养方式 ,但是途径愈伤组织阶段的体细
胞胚胎发生易产生体细胞无性系变异 ,所以研究者希望不经愈伤组织直接从外植体细胞诱导
体细胞胚胎发生 ,但是再生频率低和再生数量少是其限制因素[2 ] ,同时外植体直接再生的体细
胞胚胎的体细胞无性系变异情况也缺少具体研究。我们已经报道了以苹果栽培品种无性器官
叶片为外植体 ,经创伤后进行直接体细胞胚胎发生培养 ,可有效提高直接体细胞胚胎发生频率
和发生数量[1 ] 。本实验应用 RAPD 标记 ,通过对两代苹果叶片直接体细胞胚胎发生、植株再生
后代体细胞无性系变异研究 ,总共扩增得到 23867 (18470 + 5397) 条 RAPD 标记 ,其中出现一条
多态性差异带 ,体细胞无性系变异率为 01004 %(1Π23867) ,接近于自然变异率。
RAPD 标记应用于鉴定体细胞胚胎途径再生植株体细胞无性系变异已有一些报道 , Isabel
等[4 ]和 Fourre 等[3 ]在云杉组织培养体细胞胚胎发生研究中 ,应用 RAPD 标记分析了供体和再
生体间体细胞无性系变异情况 ,结果未发生两者间有 DNA 多态性差异 ;Shoyama 等[7 ] 在人参花
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器官培养体细胞胚胎发生后代体细胞无性系变异 RAPD 分析中 ,也未发现供体和再生体间有
DNA 多态性差异 ,并且认为花器官培养体细胞胚胎发生技术可以应用于人参快速繁殖。
苹果叶片直接体细胞胚胎发生途径再生植株的大田表现正在观察鉴定中。
参考文献 :
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～6535
RAPD AS AN AID TO EVALUATE SOMACLONAL VARIATION OF APPLE
DA Ke2dong1 　J IN De2ming2 　FU Jian2min1 　WANG Bin2 　SHU Huai2rui1 　LI Ya2zhi1
(1 Shandong Agricultural University , Taian , Shandong prov. 　271018 ;2 Institute of Genetics Academia Sinica , Beijing 　100101)
ABSTRACT :Plantlets were regenerated by direct somatic embryogenesis in leaf culture of apple
( Malus X domestica Borkh. cv. Gala) . The leaf was pricked before cultured on MS + BA 1mgΠL +
2142D 015mgΠL + NAA 5mgΠL medium for embryonic cell induction ,and was transfered 7 days
later to MS + BA 1mgΠL medium for somatic embryo regeneration. After 40 days ,97 % of leaves
regenerated direct somatic embryos and mean number of somatic embryos regenerated per leaf
were 25. 15 plantlets were selected from regenerants of the first three open leaves of an in vitro
plant. Somaclonal variation in the 15 regenerants and CK were studied using RAPD. No DNA
polymorphism was found among them. 7 secondary regenerants were obtained respectively from
randomly selected 7 leaves of f irst three open leaves of above 15 regenerants. RAPD analysis again
was applied to study somaclonal variations in secondary regenerants and CK, one DNA polymor2
phism was found in No. 5 secondary regenerants with primer OPF - 06 , the MW of the band is
about 900bp and named OPF - 06900 ,and the DNA polymorphism was stable after three times of
repetition. The results suggested that somaclonal variation in apple was lower than natural varia2
tion.
Key words :apple ; somatic embryo ; somaclonal variation ; RAPD
58Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (2) :81～85