全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　文章编号 :100028551 (2001) 0620345206
L . fendleri 与 B . napus 原生质体融合
改良野生优质工业用油植物研究
虞秋成　严建民
(江苏省农业科学院原子能所 ,江苏 南京　210014)
摘要 :为了把野生优质工业用油植物基因导入到普通栽培油菜品种中 ,本文报道了野
生优质工业用油植物 L . fendleri 的原生质体培养及其原生质体与普通栽培油菜品种
原生质体融合。结果表明 :L . fendleri 原生质体及两种植物融合原生质体在 P8 培养
基上诱导出愈率高 ;来源于下胚轴的原生质体出愈率高于子叶原生质体 ;低剂量γ射
线辐照处理更有利于促进原生质体融合 ;子叶原生质体间细胞融合频率高于下胚轴
原生质体间细胞融合频率 ;B5 培养基 + 2mgZTΠL 对提高融合原生质体细胞愈伤组织
再分化最适宜 ;原生质体融合细胞再生植株高度 60～70cm ,叶片形状偏向 L . fendleri ,
叶片大小、茎秆粗细、花药大小介于双亲之间 ,花型、花色偏于 B . napus ,花药空瘪 ,无
花粉粒 ,自交不能结实。
关键词 :愈伤组织 ;原生质体融合 ;再生植株
收稿日期 :2001207210
作者简介 :虞秋成 (1953～) ,江苏金坛人 ,江苏农业科学院原子能所副研究员 ,从事水稻细胞离体培养诱变和辐射育种
研究工作
L . fendleri 是野生油料植物 Lesquerella 属的一个品种 ,一年生 ,自花授粉。Lesquerelic 酸与
蓖麻油在羟基脂肪酸的分子结构上都与有重要用途的 Ricinoleic 酸化学结构类似[2、3 ] ,即都有 1
个双键和与末端甲基间隔距离相等的 CO2 H 基团。Lesquerelic 酸及其衍生物能与铅、锡、锌等
金属在一定条件下起反应 ,形成一种金属油脂皂膜 ,具有较好的润滑作用和热稳定性。
由于 Lesquerella 属种子油在工业、国防上的广泛用途 ,1986 年美国农业部开始立专项对该
属内品种的栽培、系统选育、油料成分分析及深加工进行研究[7 ] ,经过 5 年对 Lesquerella 属中
23 个品种的农艺性状综合评价和油分分析 ,确定 L . fendleri 品种最有利用价值[3 —5 ] ,把其列为
工业用油的作物种质资源改良对象[7 ] ,其种子含油量超过 25 % ,油中 Lesquerelic 酸含量超过
55 % ,还含有 20 %～30 %的亚油酸和亚麻酸等[8 ] 。这些羟基脂肪酸可用于制造松香、蜡、尼龙、
高能润滑剂、防爆抑制剂和化妆品等原料[1 ] 。
近年来 ,科学家对 L . fendleri 的农艺性状、栽培措施、系统选育及油料分析和深加工进行
了较为深入的研究[1 ] ,但由于其植株略匍伏矮小 ,不适宜机械化收获 ,且其种子偏小 ,产量较
低[8 ] ,含油量不高等 ,美国农业部从 1991 年起每年增拨 80 万美元用于利用遗传工程、细胞工
程等高新技术来改良 L . fendleri 品种[1 ] ,以便提高其实用价值和经济价值。
针对 L . fendleri 与 B . napus 栽培品种属间杂交不育 ,从 1994 年起 ,我们与美国科罗拉多州
543　核 农 学 报　2001 ,15 (6) :345～350Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
立大学的Duane L.Johnson 博士合作 ,开展了利用 L . fendleri 与普通B . napus 栽培品种远缘属间
原生质体融合及离体诱变等高新技术来探讨改良 L . fendleri 农艺性状、克服远缘属间杂交不
育的研究 ,以期建立优质工业用油的植物细胞育种体系 ,促进该植物向对人类有益的方向发
展。
1 　材料与方法
供试材料为 L . fendleri 和 B . napus 属内普通栽培品种 ,将其种子经 20 %次氯酸钠消毒
15min ,再用无菌水冲洗 4 次 ,接种在含 2 %蔗糖、015 %琼脂的无刺激 MS 基本培养基上。在
25 ℃恒温箱中培养 5～7d ,取下胚轴和子叶制备原生质体 ,其方法参照文献[8、9 ] 。
提取的下胚轴原生质体按 6 ×105Πml、子叶原生质体按 3 ×105Πml 的浓度培养在含有 0115M
山梨醇、0103MCaCl2·2H2O 和 015M Tris2HCl 的处理液中。用吸管滴 7 滴混合原生质体移入直
径为 5cm 的培养器中 ,加入由 013M 葡萄糖、50MCaCl2 ·2H2O 配置成的 40 %PEG(聚乙二醇) 2
滴 ,静置 5min 后 ,用由 011M 葡萄糖、01067M 山梨醇、01067MCaCl2·2H2O 配置的 1313 %PEG和
0105M葡萄糖、01083M 山梨醇、01083MCaCl2·2H2O 的洗液洗 2 次 ,每次 5min ,最后用培养液再
洗 2 次。
表 1 　不同培养基对不同来源原生质体出愈率的影响
Table 1 　Effects on induction of calli from different
tissue protoplast cultured in P8 and B5 medium
培养基
medium
原生质体来源
source of protoplast
出愈率
percentage of callus( %)
P8
下胚轴
hypocotyls
0184
子叶
cotyledon
0162
B5
下胚轴
hypocotyls
0156
子叶
cotyledon
0148
将混合原生质体置入盛有 0115M 的山梨醇、0103MCaCl2 ·2H2O、01075MKCl 和 0105Mtris2
HCl 溶液的试管中 ,用 2、5、10、15Gy 的60 Coγ射线进行辐照处理。
经 PEG和γ射线处理的混合原生质体置入 P8 大量元素、微量元素和维生素且附加 115mg
2 ,42D、015mgNAA 和 011mgKT的 B5 培养基上 ,在 25 ℃暗光下培养 48h 后 ,用微操仪选取 100 个
融合原生质体转移到 10ml 新鲜的 P8 培养基上 ,3d 后再加 3ml P8 培养基。
融合原生质体愈伤组织再分化培养分别用 B5 和 MS 两种培养基 ,另外分别附加 2mgKTΠL、
2mgZTΠL、2mgBAΠL、1mgZT + 1mgKTΠL、1mgZT + 1mgBAΠL 和 1mgKT + 1mgBAΠL。
2 　结果
211 　不同培养基对 L . fendleri 不同组织原生质体诱导率的影响
为探讨 L . fendleri 原生质体的诱导
率 ,选用下胚轴和子叶来制备原生质体 ,在
P8 和 B5 基本培养基附加 115mg 2 , 42D、
015mgNAA 和 011mgKT进行培养 ,在同一种
培养基上 ,下胚轴原生质体比子叶原生质
体诱导出的愈伤组织出愈率高 (表 1) 。而
来源同一组织的原生质体在不同的培养基
上培养 , P8 培养基比 B5 培养基诱导的出
愈率高 (表 1) 。
212 　辐照和 PEG处理不同组织制备的原
生质体对融合频率的影响
643 核　农　学　报 15 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 1 显示了经不同辐照剂量和 PEG处理 L . fendleri 和B . napus 下胚轴、子叶制备的原生质
体相互融合的结果。从图中可以看到 ,不论是来源下胚轴、子叶原生质体交叉混合处理 ,还是
分别来源下胚轴、子叶原生质体对原生质体的混合处理 ,两种处理均比对照的原生质体融合频
率高。而处理剂量相同时 ,L . fendleri 下胚轴原生质体与 N . napus 子叶原生质体融合的细胞频
率比不同来源的下胚轴原生质体、子叶原生质体间融合的细胞频率低 ;来源于下胚轴间的原生
质体融合细胞频率低于来源于子叶间的原生质体融合频率 ;经低剂量γ射线 (2～5Gy) 处理不
同亲本来源的混合原生质体 ,其融合原生质体细胞数比 PEG处理的高 ,说明低剂量辐照处理
对原生质体融合有一定促进作用 ,其适宜剂量为 5Gy 以下 ,反之则随着剂量增高而原生质体融
合细胞数目减少 ,处理剂量达 15Gy 时 ,融合的原生质体数接近于零 (图 1) 。
图 1 　不同处理对原生质体融合的影响
Fig. 1 　Effect on percentage of protoplast fusion treated withγ rays and PEG
213 　不同培养基及激素配比对融合原生质体愈伤组织再分化的影响
L . fendleri 下胚轴、子叶原生质体以及融合原生质体愈伤组织分别转移到含有 2mgZTΠL、
2mgBAΠL、2mgKTΠL、1mgZT + 1mgKTΠL、1mgZT + 1mgBAΠL、1mgBA + 1mgKTΠL 不同配比生长激素的
B5 和 P8 培养基上 ,原生质体愈伤组织在分化频率上存在差异。单从 L . fendleri 原生质体愈伤
组织再分化的情况来看 ,来源于下胚轴的原生质体产生的愈伤组织在培养基条件完全相同的
情况下 ,比来源于子叶的原生质体愈伤组织再分化频率高 ;基本培养基不同 ,在附加激素水平
相同的条件下 ,P8 培养基诱导融合原生质体愈伤组织的出愈率要优于 B5 培养基。而在诱导
愈伤组织再分化方面 ,B5 培养基优于 P8 (图 2) ,而且 B5 培养基对诱导融合原生质体的出愈率
最高。另外 ,2～5Gy 辐照处理原生质体有助于提高其原生质体再分化能力。
214 　原生质体植株及原生质体融合杂种植株农艺性状表现。
L . fendleri 原生质体再生植株的株型、叶型、花类型、育性完全保持了原来亲本性状 ,只是
743　6 期 L . fendleri 与 B . napus 原生质体融合改良野生优质工业用油植物研究
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 2 　不同培养基及激素配比对愈伤组织再分化的影响
Fig. 2 　Effects on regeneration of callus in different
medium with different rate of kinetin
奇数为 B5 培养基上愈伤组织再分化数 ;偶数为 P8 培养基上愈伤组织的再分化数。
The odd numbers showed that the regeneration number of callus cultured in B5 medium (series 1) ;
The even numbers showed that the regeneration number of callus cultured in P8 medium (series 2)
图版 Ⅰ　L . fendleri 与 B . napus 原生质体融和
Plate Ⅰ　The protoplast fusion between L . fendleri and B . napus
大的原生质体来自 B . napus ; 小的来自 L . fendleri 。
The big protoplast was the one of B . napus ; The small protoplast was the one of L . fendleri
刚移入田间时生长略缓慢 ,成熟时株高比对照微矮。L . fendleri 和 N . nupus 不论是原生质体在
融合时用γ射线处理或 PEG处理 ,还是非处理对照 ,其杂种融合原生质体细胞再生植株移入
大田后 ,初植阶段生长缓慢 ,植株高度 60～70cm ,基杆粗细介于双亲之间 ,叶片形状类似 L .
fendleri ,但叶片大小是其 2 倍以上 ,花型、花色与 N . nupus 相同 ,花药大小则处于两亲本之间 ,
略偏于 N . nupus ,花药空瘪 ,无花粉粒 ,自交不能结实 (图版 Ⅱ) 。
843 核　农　学　报 15 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图版 Ⅱ　L . fendleri 与 B . napus 原生质体融合杂种植株
Plate Ⅱ　The hybrid plant from the protoplast fusion was morphologically
intermediate between L . fendleri and B . napus
3 　讨 　论
野生优质工业用植物 L . fendleri 下胚轴和子叶制备的原生质体 ,在出愈率和绿苗再分化
率方面存在差异。在培养相同的条件下 ,来源于下胚轴的原生质体的出愈率和再分化率均高
于来源于子叶原生质体的。
从野生植物品种 L . fendleri 和 B . napus 栽培品种原生质体融合后的细胞出愈率和分化率
来看 ,来源于 L . fendleri 子叶原生质体与 B . napus 子叶原生质体融合细胞的出愈率和再分化率
高于来源于两品种下胚轴原生质体间融合细胞。
对 PEG、γ射线两种促进原生质体融合的处理因素而言 ,低剂量γ射线 (2～5Gy) 处理混合
原生质体后能促进原生质体融合的频率 ,融合原生质体的出愈率也高于 PEG处理 ,这可能与
经 PEG处理后需经多次洗涤有一定关系。
从本研究结果来看 ,所获得的 L . fendleri 和 B . napus 原生质体融合杂种植株能健壮生长 ,
株高、花型、叶片、花药大小等重要农艺性状均介于双亲之间 ,有明显的改善。但是 ,由于双亲
亲缘关系太远 ,原生质体融合杂种植株不能形成正常花粉 ,甚至无花粉粒。在减数分裂前期 ,
试图用秋水仙素处理 ,使其染色体加倍 ,以期其能够完成正常的减数分裂。花粉早期败育 ,无
花粉粒 ,导致花药空瘪 ,未能获得种子 ,如何获得原生质体融合杂种种子和提高杂种植株结实
率 ,还有待于进一步研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Cooperative State Research Service ,Lesquerella as a source of hydroxy fatty acids for industrial products. United States Department of
Agriculture ,1991 ,
[ 2 ] 　Barclay A S ,et al . The search for new industrial crops Ⅱ: Lesquerella as a source of new oilseeds ,Economic Botany ,1992 ,16 :29～
47
943　6 期 L . fendleri 与 B . napus 原生质体融合改良野生优质工业用油植物研究
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
[ 3 ] 　Thompson A E ,et al . Yield potential of lesqerella ( Gray) wats. ,a new desert plant resource for hydroxy fatty acids.Journal of Envir2
onments. 1989 ,16 :331～336
[ 4 ] 　Smith jr C R ,et al .Lesquerolic acid ,a new hydroxy acid from Lesqerella seed oil . Journal of Organic Chemistry ,1961 ,26 :2903～
2905
[ 5 ] 　Thompson A E ,et al . Lesquerella —a new arid land industrial oil seedcrop . Elguayulero ,1988 ,10 :16～18
[ 6 ] 　Gentry H S ,Barclay A S. The search for new industrial crops Ⅲ:prospectus of Lesquerella fendleri . Economic Botany ,1962 ,16 :206～
211
[ 7 ] 　Sikdar S R ,et al . Erussica ,the intergeneric somatic hybrid developed through protoplast fusion between Erica sativa lam. and Brassica
juncea (L. ) Czern. Theor Appl Genet ,1990 ,79 :561～567
[ 8 ] 　Rollins R C ,et al . The genus Lesquerella (cruciferace) in north America. Harvard University Press ,Cambridge ,MA ,1973 ,
[ 9 ] 　Glimelius K. Physiol . Plant ,1984 ,61 :38
WILD INDUSTRIAL OIL PLANT SPECIES IMPROVED BY PROTOPLAST
FUSION BETWEEN L . fendleri AND B . napus
YU Qiu2cheng 　YAN Jian2ming
( Institute of Atomic Energy for Application in Agriculture , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing , Jiangsu prov . 　210014)
ABSTRACT :The protoplast fusion between wild plant species L . fendleri of the genus Lesquerella
and B . napus was studied in order to transfer the industrial oil gene in L . fendleri into B . napus .
The results showed that the percentage of calli derived from protoplats isolated from cotyledon was
lower than the that isolated from hypocotyls when the protoplats were cultured in P8 medium. The
percentage of protoplat fusion treated withγ2ray was higher than the that treated with PEG. The
hybrid plant regeneration from fusion of protoplasts between L . fendleri and B . napus was the
highest when the calli were cultured in B5 medium + 2mgZTΠL. The height of hybrid plants was 60
～70cm. The shape of leaves resembled more to those of L . fendleri ;and the leaves were three
times larger than L . fendleri’s . The anther size and the stem height of the hybrid plants were in2
termediate between both parents. The flower type and colour were the same as B . napus . No seeds
was obtained because no pollens produced in the anther.
Key words :callus ; protoplast fusion ; regeneration
053 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (6) :345～350