全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0131 ～ 0136
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-04-20 接受日期:2010-07-08
基金项目:国家科技支撑计划(2010BAD01B04)，国家自然科学基金(30871652，31000678，31071698)，国家油菜产业体系专项(nycytx-005)，国家
大学生创新性实验计划。
作者简介:万光龙(1985-)，男，安徽定远人，博士研究生，研究方向为种质创新与生理调控。
通讯作者:周伟军(1962-)，男，浙江鄞县人，教授，博士，研究方向为作物生理与分子生物学。Tel:0571-86971770;E-mail:wjzhou@ zju. edu. cn
文章编号:1000-8551(2011)01-0131-06
丙酯草醚胁迫下靶标基因在油菜子叶
胚状体中的表达特征
万光龙 耿鑫鑫 吕 晓 刘宏波 郭 翔 罗 茜 汪海燕 周伟军
(浙江大学农业与生物技术学院，杭州 浙江 310029)
摘 要:以甘蓝型油菜品种浙双 758 为材料，利用小孢子离体培养和实时荧光定量 PCR 技术，研究了油
菜子叶胚状体中 ALS 酶和 KARI 酶在不同浓度(0、1、10 mg /L)油菜田新型除草剂丙酯草醚(ZJ0273)处
理下的生理活性、基因相对表达量差异及其动态变化特征。结果表明，ZJ0273 处理后，ALS 酶和 KARI
酶的活性发生了变化，均显著低于对照。说明其在支链氨基酸合成过程具有相应的作用。荧光定量
PCR 结果显示，随着胚状体分化时间的延长，ALS 和 KARI 基因在子叶胚状体中的表达量在低浓度
(1mg /L)ZJ0273 处理下无显著影响，而在高浓度(10mg /L)下的相对表达量则明显降低，无论分化时间
延长与否，2 个基因均表现为下调表达。研究初步表明，ALS 基因和 KARI 基因参与了除草剂 ZJ0273 处
理下油菜胚状体分化发育过程中的表达调控，可用来作为 ZJ0273 的靶标基因。
关键词:油菜;子叶胚状体;丙酯草醚;乙酰乳酸合成酶;酮醇酸还原异构酶;基因表达;实时荧光定量
PCR
EXPRESSION CHARACTERISTICS OF TARGET GENES UNDER HERBICIDE ZJ0273
STRESS IN COTYLEDONARY EMBRYOS OF Brassica napus L.
WAN Guang-long GENG Xin-xin LV Xiao LIU Hong-bo GUO Xiang
LUO Xi WANG Hai-yan ZHOU Wei-jun
(College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310029)
Abstract:The response of acetolactate synthase (ALS)and ketol-acid reductoisomerase (KARI)enzymes as well as
ALS and KARI genes to different concentrations of the herbicide ZJ0273 at cotyledonary embryo stage of Brassica napus
were investigated，and effect of this novel herbicide on physiological activity and gene expression differences was
clarified. Oilseed rape variety Zheshuang 758，with good response to microspore culture，was subjected to various
ZJ0273 treatments (0，1，10 mg /L)and the expressions of two genes (ALS and KARI)encoding ALS and KARI in
leaves were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR). The results showed that the effects of
low ZJ0273 concentration (1 mg /L) on the expression of ALS and KARI genes were not significant，while down
regulation was observed for ALS and KARI genes under high ZJ0273 concentration (10mg /L). These results indicated
that ALS and KARI genes were involved in the regulation of differentiation of cotyledonary embryos under herbicide
ZJ0273 stress，and ALS and KARI genes are the possible target genes for herbicide ZJ0273.
Key words:Brassica napus L.;cotyledonary embryo;ZJ0273;ALS;KARI;gene expression;real-time fluorescence
quantitative PCR
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核 农 学 报 25 卷
油菜是重要的油料作物，其种植面积为我国油料
作物总面积 40%以上，其产量占全国油料作物总产量
的 30% 以上，菜籽油占国家食用油总量的 30% ～
40% ［1］。然而，我国各地油菜田杂草种类较多，对油
菜的生产危害程度较严重，已成为油菜生产的主要问
题［2］。针对油菜田的杂草种类对油菜生产的影响，我
国自主研制了新型高效油菜田除草剂丙酯草醚
(ZJ0273)，其高效、低毒、低残留、环境友好的特点使
其得到了产业化应用［2，3］。除草剂 ZJ0273 是以 2-嘧啶
氧基-N-芳基苄胺类衍生物为基础开发的新型高效油
菜田除草剂［4，5］。陈杰等［6］与 Zhao 等［7］研究表明，在
活体条件下，除草剂丙酯草醚使植株体内必需的支链
氨基酸合成受阻，可能属于乙酰乳酸合成酶(ALS)抑
制剂，但其作用方式不同于磺酰脲类和嘧啶水杨酸类
等典型 ALS 抑制剂，丙酯草醚在植物体内是通过代谢
活化来发挥作用。
植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成路
径中包含几个特殊的反应和酶［8，9］。其前 3 步反应分
别需要 3 种酶来催化:乙酰乳酸合成酶(ALS)、酮醇酸
还 原 异 构 酶 (KARI)以 及 二 羟 基 酸 脱 水 酶
(DHAD)［10］。ALS 和 KARI 作为除草剂作用靶标已被
广泛证实［11，12］。ALS 抑制剂是通过抑制植物体内的
ALS 基因的表达，造成 3 种支链氨基酸合成受阻，导致
蛋白质的合成受到破坏，从而使植物细胞的有丝分裂
停止于 G1 阶段的 S 期和 G2 阶段的 M 期，干扰了
DNA 的合成，细胞因此而不能完成有丝分裂［11 － 13］。
除草剂 ZJ0273 属于嘧啶苄胺类衍生物，敏感杂草药后
表现出明显的 ALS 抑制剂的受害症状。除草剂
ZJ0273 对敏感植物的生长抑制作用又与以 ALS 为靶
标酶的除草剂相类似［14］。与 ALS 酶相似，KARI 酶也
是支链氨基酸生物合成过程中的关键酶之一，除草剂
通过抑制其活性中断支链氨基酸的合成从而达到除草
目的［15］。
当前，国内对除草剂 ZJ0273 的研究主要集中在化
学和毒理学等方面［16］。在毒理学研究中，李政等［17］
与张泉等［18］利用14 C 同位素示踪技术，研究了［C 环-
U-14 C］丙酯草醚在不同植物中的吸收运转、分布规律
及代谢产物。对作用机理的深入研究不仅有助于阐明
ZJ0273 在植物体内吸收、运转、代谢的途径与产物、靶
标酶以及药效发挥过程等重要问题，为科学、安全、合
理地使用 ZJ0273 提供理论依据和技术支持;而且有助
于了解同类先导化合物的构效关系，为新化合物的合
成提供理论指导，使这类化合物的开发从盲目筛选向
定向分子涉及方向发展。本课题组在前期的研究中探
明了除草剂 ZJ0273 处理下油菜根、茎和叶中 ALS 的酶
学特性及其相关生理生化作用［2，3］，但关于 ALS 和
KARI 基因在油菜胚状体分化发育过程中的表达特性
和调控特征尚未进行深入探讨。本研究通过小孢子培
养与胚胎发生途径，建立油菜子叶胚状体的荧光定量
PCR 检测体系，探讨油菜小孢子胚状体分化过程中
ALS 和 KARI 基因在不同浓度 ZJ0273 处理下的相对表
达含量差异，以进一步明确 ZJ0273 与靶标酶之间的关
系，为今后进一步探明除草剂与靶分子的作用方式及
该类新除草剂的结构优化提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
选取小孢子培养与胚胎发生反应较好的甘蓝型油
菜品种浙双 758，播种于浙江大学华家池校区实验农
场，在室外平均温度为 14℃时取花蕾进行小孢子培
养。99. 9%丙酯草醚(ZJ0273)(4-(2-(4，6-二甲氧基-
2-嘧啶氧基)苄胺基)苯甲酸正丙酯)由中国科学院上
海有机化学研究所提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 小孢子的分离及培养 参照 Zhou 等方
法［19，20］作改进后进行。在植株开第 1 朵花时，每次从
花序上随机选取处于单核晚期和双核早期的花蕾 10
个混合，共取 3 次，大田条件下的油菜由于温度变化大
而要逐个剥蕾检查(3 ～ 4mm)。花蕾经 5% 次氯酸钠
表面消毒 15 min 后，用无菌水洗涤 5 次，在 10ml 的
NLN 培养液(由 KNO3、Ca(NO3)2· 4H2O、MgSO4·
7H2O、KH2PO4 组成)100ml /L、微量元素(由 H3BO3、
MnSO4·4H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4
·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O 组成)10ml /L、
铁盐和有机成分，蔗糖，pH6. 0］中轻轻捣碎，40μm 尼
龙筛网过滤。于离心管加入 20ml 培养液，950r /min
离心 5min，去上清液后加 40 ml NLN-13 培养液，并加
活性炭(0. 25mg /ml)10 滴。分别取 4ml 小孢子悬浮液
于 10 个直径为 5cm 培养皿中，封口膜密封 2 层后，置
于恒温箱中黑暗 30℃热击培养 2d，之后移至黑暗条件
下 24℃常温培养。约 14d 后出现肉眼可见的后鱼雷
期胚状体，移至摇床上振荡培养 1 周。
1. 2. 2 ZJ0273 处理 将培养后形状正常的胚状体
(图 1-A)转移至含有不同浓度(0、1 和 10mg /L)
ZJ0273 的 1 /2 MS 固体分化培养基(2%蔗糖，0. 9%琼
脂，pH 6. 0)进行萌发分化(图 1-B、C)，附加 2 mg /L 萘
乙酸(NAA)、0. 3mg /L 苄氨基腺嘌呤(6-BA)。在移入
231
1 期 丙酯草醚胁迫下靶标基因在油菜子叶胚状体中的表达特征
培养基后的第 7、14、21 和 28 天分别取样，－ 80℃下保
存备用。各处理重复 3 次，每次 60 个胚状体。
图 1 不同浓度 ZJ0273 处理下油菜浙双 758 子叶期胚状体
Fig. 1 Cotyledonary embryos of Brassica
napus cv. Zheshuang 758 under different
concentrations of ZJ0273 treatment
注:A 为子叶期胚状体;B 为移入培养基胚状体;
C 为在含不同浓度丙酯草醚的培养基生长的胚状体
Note:A:Cotyledonary embryos;B:Embryos incubated
in culture medium;C:Embryos grew in culture medium
with different ZJ0273 concentrations
1. 2. 3 ZJ0273 处理后胚状体 ALS 酶活测定［21，22］
1ml 酶促反应缓冲液 (50mmol /L 磷酸钾缓冲液，
pH7. 0，50mmol /L 丙酮酸钠，5mmol /L MgCl2，5mmol /L
TPP，100μmol /L FAD)中加 ALS 粗酶液 0. 5ml 启动反
应，即置于 37℃ 恒温水槽中反应 30min;加 0. 1ml
6mol /L 硫酸溶液终止反应(对照在反应前加硫酸)，置
于 60℃的恒温水浴槽中脱羧反应 15min;再加 0. 5%
肌酸和 5% α-萘酚(10% NaOH 溶液为溶剂)混合液
2ml，振荡后在 60℃水浴槽中显色反应 15min;取出冷
却至室温，5000g 离心 10min。粉红色上清液用紫外分
光光度计在 530nm 波长下测定吸光度。蛋白含量根
据 Bradford［23］采用考马斯亮蓝法测定。酶活力用单位
时间内每毫克蛋白催化反应的吸光值表示(OD530 /mg
protein / h)。
1. 2. 4 ALS 和 KARI 基因的引物设计 按照荧光定量
PCR 引物设计原则，应用 Primer Premier 3. 0 软件设计
油菜 ALS、KARI 基因的引物。以甘蓝型油菜 actin 基因
为内参(基因号 GQ339782)设计 1 对特异引物由上海
生工合成(表 1)。
表 1 油菜子叶胚状体中 ALS 和 KARI
基因的荧光定量 PCR 引物序列
Table 1 FQ-PCR primer sequences of ALS and
KARI genes in cotyledonary embryos of Brassica napus
基因名称
gene
name
引物序列
primer pairs (5′ － 3′)
退火温度
annealing
temperature
(℃)
产物长度
product
length (bp)
actin F:GCTGACCGTATGAGCAAAGA 56 182
R:ACGATGGATGGACCCGA 56
ALS F:ATCACAGGACAAGTCCCTCG 60 220
R:GAATCGCAAGCTGTTGTTGA 60
KARI F:AAGAATGTGGAAGGTGGGTG 58 259
R:GACCCAATCTTGCTGTGGTT 58
1. 2. 5 子叶胚状体叶片 RNA 的提取、纯化与反转录
按照 Invitrogen 公司 RNA 提取试剂盒(货号 15596
－ 026)的方法从所取胚状体样本中提取总 RNA，提取
的 RNA 质量由 OD260 /OD280比值和 1% 琼脂糖凝胶电
泳鉴定，并将剩余的总 RNA 贮存于 － 80℃冰箱中备
用。反转录采用 Fermentas 公司 RiboLockTM First strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒。20μl 的反转录反应体系
包含 2μl 总 RNA，1μl 的 Oligo(dT)18引物，加 DEPC-
H2O 至 12μl;反应体系于 70℃ 下变性 5min，冰浴冷
却，依次加入 4μl 5 × First strand Buffer，1μl RiboLockTM
Ribonuclease inhibitor (20U /μl )和 2μl 10mmol /L
dNTPmix， 37℃ 下 温 浴 5min，冷 却 后 加 入 1μl
RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200U /
μl)，42℃下保温 60min，70℃下反应 10 ～ 15min，得到
的产物 cDNA 分装后于 － 20℃保存备用［24］。
1. 2. 6 ALS 和 KARI 基因的实时荧光定量 PCR 荧光
定量 PCR 采用 Takara 公司的 SYBR Green Realtime
PCR Master Mix-Plus 试剂盒。荧光定量反应体系为
20μl:含有 SYBR Mix 10μl，正反向引物(10μmol /L)各
0. 8μl，样品 RNA 2μl(400ng)和 DEPC 处理过的无菌
水。扩增条件为:95℃下 15min 激活 HotStart DNA 聚
合酶，95℃下变性 15s，56℃退火 30s，72℃下延伸 40 s
(荧光信号检测)，40 个循环，利用 BioRad icycler iQ 荧
光定量 PCR 仪完成扩增过程。每个处理组试验均完
成 3 个生物学重复。
1. 2. 7 数据分析 参照基因的 ΔCT 法
［26］，在调整
Baseline cycles 和 Threshold value(Ct)的阈值后，利用
公式 ΔCT = 2
Ct(reference)-Ct(target)，计算出目标基因(ALS、
KARI)在不同浓度 ZJ0273 处理不同分化阶段的相对
表达量。其中，Baseline cycles 是样本的荧光背景值和
阴性对照的荧光值，Ct 值是 PCR 扩增过程中，扩增产
物的荧光信号达到设定的阈值时所进行的扩增循环次
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核 农 学 报 25 卷
数，该点位于 PCR 产物消除荧光背景后进入指数增长
期的始点。Ct(reference)和 Ct(target)分别为内标基因表达
量和目标基因达到设定荧光值时的扩增循环次数。
2 结果与分析
2. 1 ZJ0273 处理下油菜子叶胚状体的存活率变化
在低浓度(1mg /L)ZJ0273 处理下，油菜子叶胚状
体表现较轻的损害，随着处理时间的延长油菜子叶胚
状体成活率逐渐降低，3 周后基本保持不变;而在高浓
度(10mg /L)处理下，油菜子叶胚状体表现出明显的损
害，3 周后子叶胚状体部分部位逐渐出现黑色斑点、并
逐渐呈现衰亡的症状，成活率显著降低。对照(0mg /
L)的存活率无显著变化，有正常的分化能力(图 2 －
A)。
图 2 不同浓度丙酯草醚处理下油菜子叶胚状体存活率(A)和 ALS 酶活性随处理时间的变化(B)
Fig. 2 Change of survival rate (A)and ALS activity (B)of Brassica napus
cotyledonary embryos with treatment duration under different concentrations of ZJ0273 treatment
2. 2 ZJ0273 处理下 ALS 酶活性变化
在 ZJ0273 处理后，随着时间的变化，对照 ALS 酶
活力无明显变化，但 1 和 10mg /L 浓度处理显著抑制
了胚状体 ALS 酶活力(图 2 － B)。处理 7d 时，对照与
处理之间 ALS 酶活力差异不明显。而在 14 和 21d
时，对照 ALS 酶活力明显高于 1 和 10mg /L 浓度处理
的 ALS 酶活力。1mg /L 浓度处理下，14 与 21d 的 ALS
酶活力无显著差异，但均显著低于 7d 时酶活力。
10mg /L 浓度处理下，ALS 酶活力随着时间的变化显著
降低。
2. 3 样品 RNA 纯度和完整性检测
为保证反转录的顺利进行，用紫外分光光度计对
提取的 RNA 纯度和完整性进行检测，经 OD 值检测发
现，提取的总 RNA 样品 A260 /A280均在 2. 0 左右，并将
所有样品 RNA 稀释成统一的浓度 200ng /μl。经 1%
琼脂糖凝胶电泳鉴定，18S RNA 条带和 28S RNA 条带
非常清晰。表明所提取总 RNA 的纯度高，完整性好，
没有发生降解与 DNA 污染，符合反转录的要求，可进
一步做表达试验。
2. 4 子叶胚状体中 ALS 和 KARI 基因的 FQ-PCR 扩
增曲线和溶解曲线分析
在荧光定量 PCR 过程中，ALS 与 KARI 基因的荧
光强度均有不同程度的增加。图 3-A 反映 2 种酶的核
酸扩增过程中 S 形荧光定量动力学曲线。 ALS 与
KARI 基因的指数区间均较明显，在 18 ～ 36 个循环都
能测出，因此为较为理想的扩增曲线。图 3-B 为 ALS
和 KARI 基因的溶解曲线，在所检测的温度范围内只
有单一的峰型，说明在荧光定量 PCR 扩增过程中没有
非特异性扩增，因此所得结果可靠。
2. 5 ZJ0273 处理下子叶胚状体中 ALS 和 KARI 基因
的表达特征差异
进一步对 ALS 和 KARI 在油菜浙双 758 胚状体中
的表达特性进行比较分析表明，在不同浓度 ZJ0273 处
理下，ALS 与 KARI 基因的表达存在明显差异(图 4)。
ALS 基因在低浓度(1mg /L)处理下的相对表达量高于
高浓度(10mg /L)处理，且随着处理时间的延长，2 种
浓度处理下 ALS 基因的相对表达量均逐渐降低(图 4-
A)。KARI 基因在处理后的表达特征与 ALS 基因在处
理后的表现趋势基本一致。 KARI 基因在低浓度
(1mg /L)ZJ0273 处理下的相对表达量高于高浓度
(10mg /L)处理，且随着处理时间的延长，KARI 基因的
相对表达量逐渐降低 (图 4-B)。此外，在高浓度
(10mg /L)处理下，ALS 基因和 KARI 基因的响应呈下
调表达(表 2)，表达水平低;而在低浓度处理下，ALS
基因和 KARI 基因的表达水平相对较高。
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1 期 丙酯草醚胁迫下靶标基因在油菜子叶胚状体中的表达特征
图 3 ALS 和 KARI 基因的荧光定量 PCR 扩增曲线(A)和溶解曲线(B)
Fig. 3 Amplification curves (A)and melting curves (B)of ALS and KARI genes by FQ-PCR
图 4 不同浓度丙酯草醚处理下子叶胚状体中 ALS(A)和 KARI(B)基因的相对表达量差异
Fig. 4 Difference in the relative expression amounts of ALS
(A)and KARI (B)genes in cotyledonary embryos of
B. napus under different concentrations of ZJ0273 treatment
表 2 丙酯草醚处理下 ALS 与 KARI 基因的表达方式及其差异倍数
Table 2 Expression of ALS and KARI genes in embryos exposed to different concentrations of ZJ0273 treatment
丙酯草醚浓度
ZJ0273
concentration
(mg /L)
基因名称
gene
name
处理第 7 天
treatment duration (7 days)
处理第 14 天
treatment duration (14 days)
处理第 21 天
treatment duration (21 days)
表达方式
expression
倍数 *
times
表达方式
expression
倍数 *
times
表达方式
expression
倍数 *
Times
1 ALS 下调 DR 1. 086 下调 DR 1. 315 下调 DR 1. 359
KARI 下调 DR 1. 696 下调 DR 4. 202 下调 DR 6. 825
10 ALS 下调 DR 1. 495 下调 DR 3. 021 下调 DR 3. 564
KARI 下调 DR 2. 525 下调 DR 4. 788 下调 DR 7. 860
注:* 丙酯草醚处理下(1 和 10 mg /L)的相对表达量 /对照的相对表达量。
Note:* means relative expression amount at 1 and 10 mg /L / Relative expression amount at 0 mg /L，respectively.
DR，Down-regulation.
3 讨论
本试验选择油菜小孢子子叶胚状体进行酶活和基
因表达研究，主要是因为油菜子叶胚状体具有以下优
点:供试材料生长一致，处理之间误差小;染色体组为
单倍体，基因遗传背景一致，便于进行基因表达研究。
结果表明，对照与低浓度 ZJ0273 处理下的胚状体存活
率无明显变化，均具有较好的分化能力。添加高浓度
(10mg /L)的 ZJ0273 对油菜 ALS 酶活有一定的抑制作
用，且随着处理时间的延长，酶活力降低，对 ALS 酶的
抑制作用增加，这与陈杰等［6］和 Zhang 等［2］研究结果
一致。
植物中 KARI 酶在组织中是由单个基因编码
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的［27］，而在芸薹属植物中，ALS 基因以多基因家族的
形式存在［27］。有关 ALS 酶的结构和调控机制至今仍
未研究清楚，对于该酶的完整晶体结构与其抑制剂结
合物结构还停留在各种理论和推测上［6，7，10］。根据基
因库中已有序列，我们选取了 ALS 基因家族中的 ALS
－ II 基因作为研究对象，其在成熟蛋白编码区、N 端叶
绿体转运肽的编码区以及基因上游非编码区具一定的
功能和特征［28］。其他相关基因在支链氨基酸合成过
程中的作用与除草剂机理的关系在进一步研究中［29］。
本研究结果发现，ZJ0273 对油菜胚状体中的 ALS
基因和 KARI 基因的调控因其浓度高低和处理时间不
同而异。在高浓度(10 mg /L)ZJ0273 处理下，ALS 基
因和 KARI 基因对其响应呈下调表达模式，表达水平
低;而在低浓度 ZJ0273 处理下，ALS 基因和 KARI 基因
的表达水平相对较高，这表明 ALS 基因和 KARI 基因
的表达在高浓度除草剂 ZJ0273 处理下可能受到了抑
制。在对不同除草剂浓度处理下 ALS 基因和 KARI 基
因的表达模式及其差异特征进行分析时，以油菜 actin
基因为内参，并通过改变退火温度等实验条件和优化
有关实验参数，初步建立了对影响油菜支链氨基酸合
成的 2 个关键基因 ALS 基因和 KARI 基因的实时荧光
定量 PCR 检测方法，这对于今后深入研究这 2 个基因
以及 ALS 基因家族中其他基因在除草剂处理下的表达
具有一定的指导意义。
4 结论
不同浓度的除草剂 ZJ0273 对油菜子叶胚状体成
活率的影响具有显著差异。油菜子叶胚状体内 ALS
酶的活性随 ZJ0273 处理时间的延长受到不同程度的
影响。对 ALS 基因和 KARI 基因的荧光定量 PCR 分析
显示，2 个基因参与了 ZJ0273 处理下油菜胚状体分化
发育过程中的表达调控，初步表明它们可用来作为
ZJ0273 的靶标基因。
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