全 文 ：此文于 1996 年 1 月 20 日收到。
高能重离子辐射诱导水稻半矮生
突变株系的 RFL P 分析
庄楚雄　胡维民　梅曼彤
(华南农业大学遗传工程研究室　广州　510642)
本文用限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP)分析技术 ,选用 97 个已定位的水稻
基因组随机克隆为探针 , 分析了广东地方品种边皮占、香占及其种子经高能氩离子辐
照后诱导产生的稳定半矮生突变株系 Ar210 和氩香 1 号在 DNA 水平上的变异。结果
表明 ,边皮占和 Ar210 之间位点变异率为 5115 %;香占和氩香 1 号之间位点变异率为
6139 %。研究显示 ,高能重离子辐射诱导的变异主要是 DNA 分子较大的改变 ,而非点
突变。用Ar210 与边皮占杂交获得的 F2 群体对Ar210 的半矮生位点的遗传和定位分析
表明 ,此性状受 1 个隐性位点控制 ,并初步将此位点定位于第 4 染色体上。
关键词 :水稻 　半矮生突变体 　高能重离子 　限制性内切酶片段长度多态性
(RFL P)
前 言
已有研究表明 ,高能重离子辐射能有效地诱导玉米[1 ] 、水稻[2 ,3 ]等作物某些性状的变异 ,并
已观察到水稻染色体水平的变异[4 ] 。但鲜见从 DNA 水平对此类诱变后代进行分析的报道。
限制性内切酶片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism 简称 RFL P)分
析技术 ,是近年迅速发展的一项新技术 ,广泛应用于分子作图、基因定位、数量性状的研究及品
种分类等领域。RFL P 分析技术可检测出 DNA 水平的多种变异 ,包括碱基置换、插入、缺失、
染色体重排等。本研究用 RFL P 分析技术对重离子辐射诱导的稳定半矮生突变株系和相应的
原种之间的多态性进行分析 ,旨在从 DNA 分子水平了解重离子辐射诱导突变的性质和突变
频率 ,并对获得的稳定半矮生突变株系进行遗传分析和初步定位。
材 料 与 方 法
材料 　广东地方品种早稻边皮占、晚稻香占及其种子经氩离子束 ( E = 400MeV/ u ,L ET =
117keV/μm)处理后产生的稳定半矮生突变株系 Ar210 (90 Gy)和氩香 1 号 (100 Gy) 。
RFLP分析 　试材幼苗用液氮速冻 ,抽提总 DNA[5 ] 。然后分别用 DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、
Hind Ⅲ、XbaⅠ等 5 种限制性内切酶酶解过夜 ,酶解的 DNA 用 018 %的琼脂糖凝胶电泳过夜 ,
按厂家提供的方法 ,将凝胶上的 DNA 转移到 Gene Screen Plus 尼龙膜上供杂交分析用。
47 核 农 学 报　1997 ,11 (2) :74～78
Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
选用 97 个已在分子遗传图谱定位的水稻基因组随机克隆作为探针 (由美国康奈尔大学
Tanksley 博士提供) ,探针分布于 12 条染色体上 ,其间平均图距为 20 厘摩尔根。用随机引物
法[6 ] ,以α232 P 标记探针。分子杂交和洗膜按 BSA/ SDS 方法[8 ]进行。
半矮生突变位点的遗传分析和定位 　将边皮占与 Ar210 杂交 ,分析 F2 群体各单株的株
高 ,计算其高、矮植株的分离比例。用在边皮占和 Ar210 之间可检测出多态性的标记对 F2 群
体的单株株高与分子杂交带型进行共分离分析 ,用计算机程序 Mapmaker [7 ]计算标记与半矮
生位点之间的重组值及方差。
结 果 与 分 析
(一)原种与突变株系的 RFLP 分析
以 97 个水稻随机基因组克隆作为探针 ,检测两个原种及其突变株系之间 DNA 限制性酶
切模式的变化 ,结果列于表 1 和表 2。从表 1 和表 2 可看出 ,两个原种及其突变株系之间的多
表 1 　边皮占与 Ar210 之间的多态性
Table 1 　RFL P between Bianpizhan and Ar210
染色体号码
Chromosome No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
扫描用的标记数
No. of markers screened 10 10 10 9 9 13 7 5 4 4 8 8
多态性标记数
No. of polymorphic markers 0 1 1 2 0 1 0 0 1 0 2 1
多态性标记与酶组合数
No. of marker/ enzyme combination 0 2 1 5 0 3 0 0 5 0 5 4
表 2 　香占与氩香 1 号之间的多态性
Table 2 　RFL P between Xiangzhan and Xiang2Ar21
染色体号码
Chromosome No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
扫描用的标记数
No. of markers screened 10 10 10 9 9 13 7 5 4 4 8 8
多态性标记数
No. of polymorphic markers 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 3 2
多态性标记与酶组合数
No. of marker/ enzyme combination 0 0 2 1 0 1 0 3 5 4 9 7
态性都比较低。边皮占和 Ar210 之间只有 9 个标记可以检测到酶切模式的变化 ,多态性标记
占所用标记的比例为 913 % ,而香占和氩香 1 号之间则有 11 个标记可以检测到酶切模式的变
化 ,多态性标记所占的比例为 1113 %。值得注意的是 ,多数有多态性的标记 ,在与 5 种内切酶
酶切的 DNA 杂交时 ,至少有两种以上的酶可以检测出多态性 ,如在边皮占和 Ar210 之间表现
多态性的 9 个标记中 ,就有 7 个标记属于这种情况 ,香占和氩香 1 号之间 11 个多态性标记中 ,
有 8 个属于这种情况。图版 Ⅰ、Ⅱ分别是探针 R G620 和 R G358 杂交的结果 ,从图版 Ⅰ可以看
出 ,边皮占和 Ar210 之间 3 种酶切都有差异 ,图版 Ⅱ中香占和氩香 1 号之间也是 3 种酶切均有
差异。这种在 1 对材料之间 ,1 个探针均能在不同内切酶酶切的 DNA 间检测出多态性现象 ,
McCouch 等人曾作过分析[5 ] ,认为这是由于 DNA 分子有较大改变之故 ,如缺失或插入 ,而非
单一位点的变化。据此可推论 ,突变株系Ar210及氩香1号在DNA分子水平上的改变 ,可能
57　2 期 高能重离子辐射诱导水稻半矮生突变株系的 RFL P 分析
图版 Ⅰ　半矮生突变株系和原种与 RG620
杂交的结果
Plate Ⅰ　Southern2bolt analysis using clone of RG620
with semidwarf mutation line and original parents
图版 Ⅱ　半矮生突变株系和原种与 RG358
杂交的结果
Plate Ⅱ　Southern2bolt analysis using clone of RG358
with semidwarf mutation line and original parents
1. Ar210 ,2. 边皮占 ,3. 香占 ,4. 氩香 1 号 ,5. 104
1. Ar210 ,2. Bianpizhan ,3. Xiangzhan ,4. Xiang2Ar21 ,5. 104
是较大的遗传物质 (DNA 片段)变化所致 ,而非碱基替换或点突变。从而表明 ,高能重离子辐
照 ,可诱发 DNA 片段缺失、插入和重排等 ,导致较大的遗传物质变化。
从表 1、表 2 可看出 ,Ar210 和边皮占之间多态性位点分布于 2、3、4、6、9、11 和 12 号等 7 个染
色体上 ,9 个探针可检测出变异 ,而氩香 1 号和香占之间的多态性位点则分布于 3、4、6、8、9、10、11
和 12 号等 8 个染色体上 ,11 个探针可检测出变异。如以每个探针与酶组合作为 1 个位点计算 ,
共检测了 485 (97 ×5) 个位点 ,Ar210 和边皮占之间多态性位点为 25 个 ,Ar210 的位点变异率为
5115 %(25/ 485) ;而氩香 1 号与香占之间多态性位点为 31 个 ,氩香 1 号的位点变异率为 6139 %
(31/ 485) 。邓红[1 ] 、左清凡[2 ]已从植株水平上发现高能重离子辐射可以诱发 1 个个体的多个性
状同时变异。本研究从 DNA 分子水平上证明突变株系变异也是多位点的。为研究 DNA 水平
突变的稳定性 ,用已检测到有多态性的探针 R G620、R G167 作探针 ,对 Ar210 的 M4 至 M8 的
DNA 进行了杂交分析 ,结果显示 (图版 Ⅲ)其杂交带型一致 ,表明这些突变在遗传上是稳定的。
图版 Ⅲ　原种和 M4～M8 与 RG167 杂交的结果
Plate Ⅲ:Southern2bolt analysis using clone of RG167 with
original parent and M4～M8
1. 边皮占 ,2、3、4、5、6 分别为 M4 ,M5 ,M6 ,M7 ,M8.
1. Bianpizhan ,2. M4 ,3. M5 ,4. M6 ,5. M7 ,6. M8.
(二)半矮生突变位点的遗传分析及其初步定位
图 1 显示 ,边皮占与 Ar210 的 F2 群体株高呈明显的双峰分布。如将株高 ≥90cm 的植株
定为高秆型 , < 90cm 的植株定为矮秆型。群体中高秆植株为 859 株 ,矮秆植株 273 株 ,高矮秆
植株的分离比例符合 3∶1 (x2e = 010112 < x20105 = 3184) 。说明 Ar210 半矮生性状是受 1 对主效
隐性基因控制。调查结果还显示 ,有株高超亲植株 ,说明这一性状还受微效基因修饰。
用 R G620 作探针对 F2 群体的 75 个单株进行 DNA 分子杂交 ,并对各单株杂交带型及其
67 核　农　学　报 11 卷
图 1 　Ar210 ( P1)与边皮占 ( P2)杂交 F2 株高次
数分布
Fig. 1 　Freguency of distribution of height of
F2 plants in the cross of Ar210 ( P1) and
Bianpizhan ( P2)
株高进行了分离分析 ,计算半矮生突变位点和 R G620 之间的重组值 ,所得结果为 2219 % ,方
差为 017 %。据水稻分子遗传图谱[9 ] , R G620 位于第 4 染色体的一端。从最近的报道[10 ]可
知 ,我国南方半矮生品种的主要矮生位点 Sd21 定位于第 1 染色体上 ,与多个 RFL P 标记 (如
R G220、R G109、R G381)紧密连锁。本研究结果显示 ,Ar210 和边皮占在此区域未发现有多态
性的标记 ,可以认为 ,Ar210 携带的半矮生突变位点是一个新的、与 Sd21 不连锁的突变位点。
(三)不同突变株系的 RFLP 模式
本研究随机选取相同剂量、不同批次处理的边皮占种子所诱导的两个稳定半矮生突变株
系 Ar210 和 104 ,对其进行 RFL P 比较分析。结果表明 ,能检测出多态的几个探针与两个突变
株系的杂交带型相同 ,如第 4 染色体的 R G620 (图版 Ⅰ) 、第 6 染色体的 R G264 和第 11 染色体
的 GR G167。这种现象表明 ,在水稻突变中也存在和其他一些生物类似的突变热点 ,而
R G620、R G264、R G167 可能正处在突变热点附近。
讨 论
1. 高能重离子辐射诱变的分子性质。早期报道[11 ]已指出 :高能重离子能有效地导致哺乳
动物细胞中 DNA 分子大片段的缺失或重排。本文的结果表明 ,植物 DNA 分子突变机制也是
一样 ,即由 DNA 分子的缺失、重排等所致。
2.吸收剂量与突变频率的关系。左清风[2 ] 、邓红[3 ]等发现 ,以具有单一能量的重离子处
理水稻种子 ,在一定范围内 ,突变频率与吸收剂量成正比。本试验所用材料 Ar210 和氩香 1 号
是经相同起始能量的氩离子处理的 ,但氩香 1 号的吸收剂量比 Ar210 高 ,突变频率亦是氩香 1
号高。这一结果表明 :DNA 水平的变异也与剂量成正比。
3. RFL P 分析在辐射诱变研究中的应用。已有报道[12 —14 ]表明 ,RFL P 分析不但能检测到
由物理或化学因素诱导产生的变异 ,而且还可以检测到组培中的体细胞变异以及自然变异。
本试验采用 RFL P 分析方法 ,不但了解了高能重离子诱变的分子机制 ,而且还将突变位点进行
定位。RFL P 标记与传统遗传标记相比 ,具有数量多等特点 ,在今后的研究中 ,广泛采用 RFL P
分析方法 ,有助于我们对诱变分子机理的进一步了解 ,而且还可以定位乃至克隆重要农艺性状
基因。
本研究得到高等学校博士学科点专项科研基金和美国洛克菲勒基金资助。
参 考 文 献
1 　丘运兰等. 加速器重离子辐射对玉米的诱变效应. 华南农业大学学报 ,1991 ,12 (1) :48～54
77　2 期 高能重离子辐射诱导水稻半矮生突变株系的 RFL P 分析
2 　左清风等. 加速器氩离子辐射对水稻诱发效应的初步研究. 核农学报 ,1991 ,5 (4) :199～204
3 　邓　红等. 加速器氩离子辐射在水稻育种中的应用. 核农学报 ,1994 ,8 (2) :70～74
4 　何远康等. 重离子辐射诱导花粉母细胞染色体畸变的研究. 华南农业大学学报 ,1994 ,15 (2) :14～19
5 　McCouch SR et al. Molecular mapping of rice chromosome. Theor Appl Genet ,1988 ,76 :815～829
6 　Feinberg AP ,Vogelstein B. A technique for radiolabelling DNA restriction fragments to a high specific activity. Anal Biochem ,
1984 ,132 :6～13
7 　Bothwell A , Yancopoulos GD ,Alt FW. Methods for cloning and analysis of eucaryotic genes. Boston ,USA ,Jones and Bartlett
Publisher ,1990 ,235～236
8 　Lander ES et al. Mapmaker :a interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and
natural populations. Genomics ,1 :174～181
9 　Tanksley SD et al. A high density molecular map of the rice genome. Rice Genet Newsl ,1992 ,9 :111～115
10 　Cox R et al. Mutations and inactivation of mammalian cells by various ionizing radiation. Nature ,1977 ,267 :425～427
11 　Cho YG et al. The semidwarf gene , sd21 ,of rice , Ⅱ. Molecular mapping and marker2assisted selection. Theor Appl Genet ,
1994 ,89 :54～59
12 　张耕耘等. 九个水稻耐盐突变体的 RFL P 分析. 植物学报 ,1994 ,36 (5) :345～350
13 　庄杰云等. 应用 RFL P 研究水稻基因突变的特性. 遗传学报 ,1994 ,21 (5) :379～384
14 　李　平等. 水稻花药培养植株后代的 DNA 变异. 遗传学报 ,1995 ,22 (4) :286～292
RFLP ANALYSIS OF RICE SEMIDWARF MUTATION IND UCED BY
HIGH ENERGY ARGON ION RADIATION
Zhuang Chuxiong 　Hu Weimin 　Mei Mantong
( Genetic Engineering L aboratory , South China A gricult ural U niversity , Guangz hou 　510642)
ABSTRACT
Two Indica rice varieties , Bianpizhan and Xiangzhan ,and their semidwarf mutants induced
by high energy argon ion radiation , Ar210 , and Xiang2Ar21 , were examined with restriction
fragment length polymorphism( RFLP) analysis by using 97 rice single copy genomic clones
mapped on 12 chromosomes of molecular genetic map ,combined with 5 restriction enzymes. A2
mong the markers screened ,9 detected polymorphism were bet ween Bianpizhan and Ar210 ,and
11 detected polymorphism were bet ween Xiangzhan and Xiang2Ar21. Moreover , t wo or more re2
striction enzymes could generate RFLP patterns when screened with a given marker for several
polymorphic markers. Based on the polymorphic allel ic loci , the mutation frequencies were esti2
mated as 5115 %and 6139 %for Ar210 and Xiang2Ar21 respectively. These results suggested that
the nature of mutation on the D NA level was probably large geneic changes rather than point
mutation . Genetic analysis and gene tagging of semidwarf mutation in one of the mutant l ine , Ar2
10 , indicated that this mutation was controlled by a major recessive gene , which was prel iminary
located on chromosome 4.
Key words :Rice ,mutation ,high energy argon ,RFL P
87 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1997 ,11 (2) :74～78