全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012044204
一株极端耐辐射奇异球菌的分离和初步鉴定
陈　明　刘秀敏　张　维　林　敏
(中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081)
摘　要 :从放射性污染的土壤样品中分离出 1 株具有极端耐辐射的微生物 BR501 ,该菌最适生长温度为
30 ℃,不具有氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素和利福平等抗性。UV、γ辐射生长曲线的结果显示
BR501 菌株具有极强的辐射抗性。BR501 菌株的 16S rDNA 序列与多株 Deinococcus 属菌株有很高的同源
性 ,其中 ,与 D . radiodurans 菌株的 16S rDNA 相似性高达 99 %。结合 BR501 菌株的表型和 Deinococcus
属具有代表性的 D . Radiodurans R1 菌株的特征 ,将该菌株归属为 Deinococcus 属 ,初步命名为 Deinococcus
sp . BR501。
关键词 :耐辐射微生物 ; Deinococcus sp ;16S rDNA
SEPARATION AND CHARACTERIZATION OF A RADIORESISTANT BACTERIUM
STRAIN BR501 FROM RADIATION POLLUTED SOIL
CHEN Ming 　LIU Xiu2min 　ZHANG Wei 　LIN Min
( Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081)
Abstract :Strain BR501 , an extremely radioresistant bacterium isolated from the radioactive experimental soil . The optimal
temperature for the growth of strain BR501 was 30 ℃. The UV radiation andγ2radiation survival curves showed the strain
BR501 had highly radio2resistance. The strain was sensitive to Amp , Km , Rif , Cm and Tc. The 16S rDNA of the BR501
shared highly similarity to those of species in genus Deinococcus , especially to that of D . radiodurans R1 (99 %) . Based on
the 16S rDNA sequence analysis and the phenotype characteristics , the BR501 belongs to the evolution branch of Deinococcus
and was designated Deinococcus sp . BR501.
Key words :radioresistant bacterium ; Deinococcus sp ; 16S rDNA
收稿日期 :2006206205
基金项目 :国家高技术研究发展计划项目 (2004AA214170)
作者简介 :陈　明 (19622) ,男 ,广东兴宁人 ,博士 ,从事分子生物学研究。Tel :010268975038 ,E2mail :chenmingbio @hotmail . com　　Deinococcus radiodurans R1 是 1956 年首次发现的极端耐辐射微生物[1 ] 。迄今为止 ,全球范围内所发现的极端辐射抗性微生物有十余种 , 其中除了 D .Radiodurans 外 , 还 有 D . radiopugnans[2 ] 、 D .Proteolyticus [3 ] 、D . Radiophilus[4 ] 、D . grandis[5 ] 、D .geothermalis 和 D . Murrayi [6 ] 等。这些菌株中除 D .grandis 为革兰氏阴性杆菌外 ,大都为革兰氏阳性球菌。Deinococcus 属的细菌不仅具有对电离辐射、UV 辐射以及许多 DNA 损伤试剂的抗性 ,还具有对干燥、过氧化物等极强的抗性。而电离辐射抗性成为 D .radiodurans 最显著的特征 ,在辐照剂量达 15kGy 诱发 细胞基因组 DNA 成百个双链断裂和数千个单链断裂状况下 ,仍能完整如初地恢复其基因组 ,并不丧失生存能力和不发生突变[7～10 ] 。因此 ,引起科学界的极大兴趣。开发和研究这类微生物菌株资源以及研究其DNA 损伤的修复能力 ,不仅对探索 DNA 修复分子机理的基础学科有着十分重要意义 ,而且对促进新的 DNA技术发展以及在环境保护和生物修复、人类健康、生物技术 ,乃至地外空间的开发和利用等方面都具有极大的应用前景。我国对微生物资源的研究和开发已有 20 多年 ,但尚未有极端耐辐射微生物新种或新属的报道 ,相关抗
44　 核 农 学 报　2006 ,21 (1) :44～47Journal of Nuclear Agricultural Sciences
辐射微生物的研究起步较晚。本研究从放射性污染的
土壤中分离和筛选到 1 株具有耐辐射的微生物菌株
BR501 ,对该菌株的 16S rDNA 序列进行测定 ,对其电离
辐射生长曲线等特性进行了分析。
1 　材料与方法
111 　试验菌株和培养条件
供试菌株分离于中国农业科学院原子能利用研究
所同位素试验网室的土样。菌株用 TGY 培养基
(015 % 胰蛋白胨 ,013 %酵母提取液 ,011 % 葡萄糖) ,
30 ℃培养 2 ～ 3d。用于 DNA 操作的大肠 杆 菌
( Escherichia coli) DH5α和野生型菌株 K12 ,用 LB 培养
基 (蛋白胨 10 gΠL、酵母粉 5gΠL、NaCl 10gΠL、pH710) ,
37 ℃培养过夜。固体培养基中加入 115 %的琼脂。
研究抗生素对菌株生长的影响时 ,加入的抗生素
浓度 为 : 利 福 平 ( rifampicin , Rif ) 50μgΠml、四 环 素
(tetracycline ,Tc) 50μgΠml、氯霉素 (chloramphenicol , Cm)
3μgΠml 或 34μgΠml 和卡那霉素 ( Kanamycin , Km) 8μgΠml
或 25μgΠml ,氨苄霉素 (Ampicillin , Ap)为 50μgΠml。
112 　菌株的分离和纯化
取 1g 土样加入 5ml 1molΠL Na3 PO4 中 ,充分振荡
30min ,混匀静置 15min 后 ,取 100μl 上清液涂布于 TGY
固体培养基 ,置于 30 ℃培养箱中培养 2～3d。挑取单
菌落 ,接种到新的 TGY固体培养基中 ,反复多次获得
纯培养菌株。
113 　耐辐射菌株的筛选
为初步鉴定菌株对辐射的抗性 ,对分离到的菌株
进行了 UV 辐射生存率测定。具体方法如下 :将分离
的菌株分别接种到 3ml TGY培养液中 ,30 ℃培养 24h
后 ,取 2ml 菌液 , 离心收集细胞 , 用磷酸缓冲液
(10mmolΠL , pH710)洗涤 2 次 ,重悬于 2ml 磷酸缓冲液
中。将 1ml 细胞悬液置于直径为 3cm 灭菌的培养皿
中 ,室温条件下 ,用 UV 辐照 ,照射剂量分别为 0、100、
300、500、700 和 800JΠm2 。辐照过程中 ,将培养皿置于
电动旋转的平台上 ,转速为 20～30rpmΠmin ,确保 UV 光
能均匀照射到菌液上。经 UV 处理的细胞用 10mmolΠL
磷酸缓冲液进行一系列倍比稀释 (10 - 1 到 10 - 6 ) 。取
100μl 稀释液涂布 TGY平板上 ,每处理 3 次重复。经
30 ℃培养 4～5d ,计算单菌落数。
114 　细菌总 DNA提取和 16S rDNA序列分析
细菌总 DNA 的提取采用 CTAB 法 ,详见 Wilson 方
法[11 ] 。
以菌株基因组 DNA 为模板 ,采用细菌 16S rDNA
通用引物 : F27 (5′2AGAGTTTGATCATG GCTCAG23′) 和
R1492 (5′2TACGGTTACCTTGTTACGACTT23′) ,于 PCR 扩
增仪 (Biometra T1 Thermocyler)进行扩增反应 (94 ℃变性
20s ,52 ℃退火 30s , 72 ℃延伸 80s , 30 个循环后延伸
10min) 。PCR 产物克隆到 Promega p GEM2T Easy 载体
上 ,然后将连接产物转化 E. coli DH5α感受态细胞中 ,
在含 Ap (50μgΠml)ΠIPTGΠX2gal 的LB 平板上挑取白斑菌
落 ,碱裂解法提取质粒[12 ] 。含有 16S rDNA 基因的质粒
提交到上海基康生物技术有限公司 ,完成 16S rDNA 核
苷酸序列测定。测序结果用 BLAST 软件与 Genebank
中序列进行同源性比较。
115 　基因组 DNA的 G+ C含量
菌株 BR501 基因组 DNA 提取和纯化采用 Marmur
(1961) [13 ] 的方法。DNA 碱基组成采用分光光度计
(DU800 , BECKMEN , Germany)热变性的方法检测[14 ] 。
116 　γ辐射生存率和突变频率
BR501 于 TGY培养液 30 ℃培养 24h 后 ,处于对数
生长早期的细胞用于辐射生存率的测定 ,10ml 细胞用
磷酸缓冲液 (10mmolΠL , pH710) 洗涤 2 次 ,并重悬于
10ml 磷酸缓冲液中 ,分别取 2ml 细胞悬液置于 5 个试
管中 ,在室温条件下 ,用60 Coγ射线照射 6h ,按60 Coγ的
辐射强度 ,放置在离源中心不同的距离 ,吸收剂量分别
为 0、2、4、6、8 和 10kGy。对照处理放置在无辐照的室
温条件下。所有处理同时用 10mmolΠL 磷酸缓冲液的
一系列倍比稀释 (10 - 1～10 - 6 )后 ,各取 100μl 稀释液分
别涂布在 TGY 固体培养基上 ,每处理重复 3 次。经
30 ℃培养 4～5 d ,计算单菌落数。
2 　结果
211 　耐辐射微生物菌株的分离
由于放射性实验区中土壤长期受到一定放射性强
度的辐射 ,生存在该环境中的微生物种类和数量较少。
本试验从土壤样品中共分离到 12 个单菌落。通过显
微镜 ( ×1000)观察各菌落对数生长后期或稳定期细胞
以及菌株在固体培养基上形成的菌落形态 ,初步划分
成 4 个明显不同的类群。各挑选一种 (编号为 BR501、
BR402、BR403 和 BR201) ,测定其细胞的 UV 生长曲线。
如图 1 所示 ,分离菌株 BR501 对 UV 辐射抗性最大 ,其
次为 BR402 ,另两株菌 (BR403 和 BR201) 的 UV 生存力
高于 野 生 型 E. coli K12。以 往 研 究 显 示 , D .
radiodurans 野生型菌株对 UV 抗性的剂量高达 500JΠ
m
2 ;再增加剂量细胞的生存力下降[10 , 15 ] 。本研究分离
的 BR501 菌株 ,对数生长期的细胞对 UV 的抗性剂量
54　1 期 一株极端耐辐射奇异球菌的分离和初步鉴定
达到 500～600JΠm2 ,800JΠm2 UV 辐射剂量下还有 10 %
的存活率。可见 ,BR501 菌株与 D . radiodurans 菌株一
样都具有对 UV 辐射极强的抗性。
图 1 　分离菌株 UV 辐射生存曲线
Fig. 1 　UV survival curves for isolates
212 　BR501 的分子鉴定
为了进一步确定 BR501 菌株在分类学上的地位 ,
对BR501 进行了系统发育分类的分析 ,测定了 BR501
菌株的 16S rDNA 序列。以 AD9 基因组 DNA 为模板 ,
对细菌 16S rDNA 特异的引物 F27 和 R1492 进行 PCR
扩增 ,得到长约 115kb 的扩增产物 ,将其插入到 T载体
中。经测定的 BR501 16S rDNA 序列共 1462bp ( GenBan
登录号 : AY940039 ) 。用 BLAST 程序对该序列和
Genebank 中已登录的 16S rDNA 序列进行核苷酸同源
性比较 ,结果发现 BR501 与 Deinococcus 属的多株菌株
有很高的同源性 ,在同源性比对最接近的 100 个 16S
rDNA 序列中 ,86 %为 Deinococcus 属的 16S rDNA 序列 ,
14 %为尚未确定的物种的序列。其中 ,BR501 菌株与
D . radiodurans R1 的 16S rDNA 序列 ( GenBan 登录号 :
AE00051311) 的同源性最高 (identity > 9918 %) ,与 D .
aquaticus 和 D . Indicus 的同源性达 95 %以上。而且 ,
BR501 菌株的 16S rDNA 基因序列拥有所有 Deinococcus
属的特征标识的核苷酸 [16 ] , 即 657、749、757、1050、
1208、1421、1429、1471 和 1479 位点分别为 C、G、T、G、
T、A、G、C和 C。另外BR501 基因组DNA 的 G+ C含量
为 6617 mol % ,非常接近于 D . radiodurans R1 (6616
mol %) [17 ] 。
基于 16S rDNA 基因序列 ,构建与 BR501 菌株亲缘
关系相近物种的系统发育树 (图 2) ,表明 BR501 菌株
属于 Deinococcus 属。因此 ,BR501 菌株初步命名为
Deinococcus sp . BR501。
213 　BR501 菌株的电镜观察
图 3 为 BR501 菌株的电镜照片 ,细菌以四分体形
式存在 ,无鞭毛 ,不产生孢子。在固体培养基上形成明
图 2 　BR501 菌株与 Deinococcus 属菌株
16S rDNA 序列的的系统发育比较
Fig. 2 　The phylogenetic analysis of BR501 strain and
Deinococcus sp . strains based on the
16S rDNA sequences
显的红色菌落 ,革兰氏染色为阳性。液体培养基中 ,细
胞“密集成群”,易沉淀于试管底部。最适生长温度为
30 ℃。已知 D . radiodurans R1 是 Deinococcus 属典型代
表 ,其细菌为红色球菌 ,液体培养基中以二分体和四分
体形式存在 ,最适生长温度为 30 ℃,但能在高达 37 ℃
的环境中生长[1 , 18 ] 。本试验分离的 BR501 菌株均与
D . radiodurans 菌株的特性相符。
图 3 　BR501 菌株的电镜照片
Fig. 3 　An electron photomicrograph of BR501 strain
214 　BR501 菌抗生素抗性的鉴定
测定 BR501 对抗生素的抗性试验结果显示 ,该菌
对 Rif、Tc、Cm 和 Km 等抗生素敏感。
215 　γ辐射生存率
极端耐电离辐射是 Deinococcus 菌株最显著的特
征。为此 ,测定了 BR501 菌株对γ辐射的抗性 (图 4) 。
对数生长期的 BR501 细胞在 5kGyγ辐射下并不死亡 ,
显示出极高的抗辐射性。而 Escherichia coli K12 在
64 核　农　学　报 21 卷
2kGy 辐照处理后的生存率不足 011 % , 明显低于
BR501 菌株的γ辐射抗性 (图 41) 。
图 4 　BR501 菌株的γ辐射生存曲线
Fig. 4 　Survival curves for E. coli K12 and BR501
strain following exposure toγ-irradiation
3 　讨论
Deinococcus radiodurans R1 是 1956 年从 X 光照射
的肉罐头中分离的极端耐辐射微生物 ,另外一株 D .
radiodurans SARK分离于医院空气污染物[20 ] 。全球至
今已分离出 10 余株该属的微生物菌株。本研究从放
射性实验的土壤中分离到一株极端耐辐射微生物菌株
BR501 ,经 16s rDNA 序列比对 , G + C 含量测定以及表
型特征分析 ,初步鉴定为 Deinococcus sp . BR501。研究
结果表明该菌对γ辐射和 UV 辐射的抗性 (图 1 和图
4) 与已知最具辐射抗性的 Deinococcus radiodurans
R1[17～19 ] 相当。根据已公布的 Deinococcus radiodurans
R1 基因组序列[17 ] (http :ΠΠwww ,ncbi . nim ,govΠ)设计错配
修复基因 mutS1 以及 pprI 特异性引物对 ,能从 BR501
菌株基因组 DNA 中扩增到相应大小的 PCR 产物。因
此 ,从 BR501 菌株的辐射抗性、表型特征以及 16S
rDNA 基因序列的分析等方面看 ,BR501 菌株很可能为
D . radiodurans ,但还需进一步的生理鉴定。
在已分离的 10 余株 Deinococcus 属菌株中 , D .
radiodurans[21 ]和 D . geothermalis[22 ] 是目前报道中具有
自然转化和可遗传操作的菌株。本研究将含有 Km 抗
性的 Deinococcus2E. coli 的穿梭质粒能转化到 BR501 细
胞中 ,发现 BR501 细胞可获得 Km 抗性 (数据未列) ,表
明 Deinococcus sp . BR501 菌株也具有自然转化的能力。
同时 ,该菌不具有许多抗生素抗性 ,为该菌株的遗传操
作和相关功能基因的研究等方面提供了便利条件。因
此 ,该菌株的分离和鉴定为进一步克隆耐辐射基因、了
解 DNA 损伤修复的分子机制奠定了良好的研究基础。
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