全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
核 农 学 报 , 叮 一
〔湘 尸 之‘ 己 之似
海岛棉突变系体细胞培养及植株再生研究
时香玉 刘金元 高国强 苏学合
山东省农业科学院原子能利用研究所
朱斗北 陈 晓
济南
采用埃及海岛棉辐射 突变 系 、 、 和 埃及棉吉扎 的下胚轴 为外植体 ,
接种于 改 良的 培养基 无机盐 有机 元 素 上 , 补加 不 同外源激 素诱 导愈
伤组织 和分化 , 然后 经过悬浮培养 , 获得 大 量胚状体 。 经过 重 复实验 , 、 能 够
产生大量胚状体 , 胚状体的发生频率分别为 和 左右 , 发生指数 和 。
最适诱导培养基为改 良 , 一 , 最适继代次数 一
次 , 其中需要在 培养基 中继代 次 。 分化培养基为
一 。 然后选择淡黄或灰 白松散的愈伤组织接种到 悬浮培养基
中 , 培养 巧 一 , 即产生 大量胚状体 和胚性 细 胞 团 。 在不 加激
素的培养基上 , 胚状体 萌发成苗生根 。 对 不 同状 态愈伤组 织 的过 氧化物晦和 醋酶 同
工酶进行分析表明 , 其酶活性和谱带差异较明显。
关键词 海岛棉 突变 来 悬浮培养 胚状体 植株再生
目 舀
棉花体细胞植株再生技术是原生质体培养和遗传转化的基础 。 棉花愈伤组织的诱导首先
由 〔’〕报道 , 培养在 培养基上的胚珠从珠孔处形成愈伤组织 。 最早对棉花愈
伤组织的诱导进行了研究 , 后来很多人利用多个棉花品种进行研究 , 都未获得胚状体 。
年 闭 从克劳茨基棉获得胚状体 , 并产生根和退化叶 。 、 等 通过胚胎发生途径获
得再生植株 。 但是棉花组织培养受基因型限制图 , 获大量再 生植株的品种数量有限 。
囚 由陆地棉愈伤组织分化成胚状体及再生植株。 在我国陆续有鲁棉 、 、 , 晋棉 等和坷
字棉
、 、 产 生再生植株 ,
, , “〕。 海 岛棉的组织培养报道少 , 〔〕, 一 一
等 〔‘ 〕简要报道以海岛棉的子叶为外植体制备原生质体 , 获再生植株 。 我们利用辐射海岛棉阿
须莫尼 优 良长绒突变系的下胚轴为材料 , 研究离体培养再生植株的条件 。
材 料 与 方 法
材料为本所选育的海岛棉突变系 、 、 , 以及吉扎 引 自山西棉花所 。 棉籽用
浓硫酸脱绒 , 流水冲洗后在 酒精中浸 一 , 再经 的氯化汞消毒 巧 。 消毒后的
种子置于无激素 培养基上培养 一 , 得无菌苗 , 切取下胚轴 一 长的切段 , 接种
在不同激素组合的培养基上 。
此文于 年 月 日收到 。
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核 农 学 报 卷
基本培养基为 无机盐 有机元素 葡萄糖 十 琼脂 , 。 诱
导及继代培养基 为 十
, 一 , 一
, 一 分化培养基为 ,
谷氨酞胺
。 悬浮培养基为 仇 加倍 十 谷氨酞胺 。 胚状体萌发培养基
为基本培养基 不加激素 。 培养条件为温度 士 ℃ , 光强 , 光照时间 。 回旋式
摇床 , 转速 一 。
同工酶分析采用聚丙烯酞胺凝胶平板 电泳法 , 浓缩胶 , 一 分离胶
, 。 电泳温度 ℃ , 稳流 , 电泳 , 电极缓冲液 一 系流 , 。
取 不同状态的愈伤组织 松散嫩黄 , 质硬绿色或白色胚性愈伤组织 , 用液氮冷冻 , 磨粉 , 按
加 , 琉基 乙醇 , , 均浆后离心 ,
, ,
取上清液点样 。
结 果 与 分 析
一 激素配比和组合对愈伤组织诱导的影响
个突变系及吉扎 在含有 、 的 、 培养基上 , 周后外植体切 口两
端有微状突起 。 在 、 、 、 、 培养基上继代 , 个月后在 、 培养基上的外植体仍不能形
成或形成很少愈伤组织 , 而在 、 、 培养基上则形成愈伤组织 。 、 形成愈伤组织的比
例高达 以上 , 吉扎 低 。 开始培养在含有 , 一 、 、 激素的 、 、 培养基上的外
植体均能很快形成愈伤组织 , 个突变系形成愈伤组织的比例都很高 , 吉扎 较低 表 。 不
同的激素组合对诱导 产生愈伤组织的速度 、 质地 、 色泽有很大 差异 , 不 同 品种差 异也明显 。
、 、 在含有 、 , 一 激素的培养基上 易形成愈伤组织 , 呈灰白或淡黄色 , 质地疏
松 , 易在液体培养基中形成悬浮系 , 而在 , 一 与 的激素组合中虽生长很快 , 但易发褐 ,
稀软 , 不易形成悬浮系 。 、 和 易经过悬浮培养形成胚性细胞或胚状体 , 而吉扎
不易形成愈伤组织 , 多呈白色或绿色 , 质地坚硬 , 难以形成悬浮系而产生胚状体 , 所以诱导产生
愈伤组织的状态是获得再生植株的关键 。 因此 , 应在含有 , 一 与 激素的培养基上诱
导 , 在含有 、 或 的培养基上继代培养 。
二 固体培养基上胚性愈伤组织和胚状体的产生
愈伤组织在诱导培养基上继代多次 , 未发现产生胚状体 , 转接在分化培养基上 , 个月即
看到 、 有少量胚状体产生 。 产生胚状体的培养基激素组合有 、 、 〕
等 , 发生频率近 , 指数在 以下 。 产生胚状体的培养基激素组合有 、
等 , 频率低于 , 指数 左右 表 , 有个别胚状体产生 , 且为畸形 , 吉扎 在分化培
养基上不能产生胚状体 。 因此 , 固体分化培养基 中产生胚状体的频率低 , 不适于苗的大量再
生 〔“ 〕。
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期 海岛棉突变系体系细胞培养及植株再研究
表 不同激素配比 组合诱导愈伤组织的效果
品种或品系 诱
导培养基
,
接种数
天后观察结果 继代培养 天后观察结果
出愈块数 出愈率 出愈率
吕
花印
的印儿阴
如儿印胡巧︸、曰一‘工口立,
︸‘一
八︸一气︸、
埃及棉
“ 吉扎 ”
“ , ,
表 不同诱导继代与分化培养基的组合以及悬浮培养对胚胎发生的影响
品种或品系
〕
诱导继代
培 养 基
分 化 培 养 基 。
玉,
固体 悬浮 叩 固体 悬浮 固体 阮
频率 指数 频率 指 数
叫 叫此
频率 指 数 频率 指 数 频率 指 数
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悬浮
频率 指 数
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频率 胚胎发生频率 指数 胚胎发生指数 凡 一
。 斗
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核 农 学 报 卷
三 悬浮培养胚状体和胚性细胞团的产生
将培养在分化培养基上的 、 和 的淡黄色或灰 白色疏松愈伤组织转接到
加倍 十 谷氨酞胺 的液体培养基中 , 培养 左右则产生大量
的单个球形胚 、 心形胚
、 鱼雷胚和大量的胚性细胞团 图版 一 , 。 表 显示 , 适于 产生
胚状体的液体培养基组合有 ,
、
,
、
,
、 户 之 等 , 产生胚状体的频率和
指数都低于 。 加低浓度激素 和 谷氨酸胺的效果 比不加的提高明显 州 。
四 胚状体萌发成苗和移栽
将悬浮培养产生的胚状体和胚性细胞团转接到不加激素的 固体培养基上 , 单个胚状
体萌发成苗 , 同时胚性细胞团继续分裂生长 , 逐渐从边缘 、 表面 、 裂缝 又产生大量的胚状体 图
版 一 , , 也能继续产生新的胚性愈伤组织 。 在萌发培养基上 个月左右产生的胚状体达到
高潮 图版 一 , , 个月后仍有胚状体产生 。 胚性愈伤组织可 以重复悬浮培养 , 仍能保持胚
状体和胚性细胞团的产生 。 每 悬浮物能产生 个以上的胚状体 , 正常苗在
图 版
胚性愈伤组织 , 含各类胚状体 鱼雷胚状体萌发 悬浮后 的 毛卜卜愈伤组织团块和 胚状体 大量胚
状体产生和 萌发 畸形苗 , 顶端萌发正常芽 具 一 片真叶的再生苗 具 一 片真叶的再生植株
移入土壤中的完整植株
, 几 〔圣 一一 , 渗 一
一。
一 馆
一
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期 海岛棉突变系体系细胞培养及植株再研究
左右 , 畸形苗表现为无子叶 , 无生长点 , 根或茎伸长等 , 但有的畸形苗又可以从顶端产生正常芽
图版 。 和 也有胚状体产生 、萌发 , 但正常苗不超过 。
正常胚状体萌发后 巧 出现真叶 , 根开始形成 , 有 一 片真叶 图版 , 后长
出 一 片真叶 图版 一 , 移栽成活 图版 工一 。
五 不同状态愈伤组织同工酶酶谱
不同状态愈伤组织之间 , 过氧化物酶和醋酶同工酶酶谱及活性有很大差异 。 图 是
图 愈伤组织过氧化物酶电泳谱带照 片和模式图
过氧化物同工酶电泳谱带和模式图 。 为了分析方便 、直观 , 把酶谱分为
、 、 、 个区 ,
一 一 一 是 悬浮后具有分化胚状体能力 的胚性愈伤组织 、 、 的
普带 。 一 一 一 是悬浮前的不 同状态的愈伤组织 , 酶谱相似 。 、 、 、 谱带则
明显与其它组不同 , 又有 自己的特点 区简单 , 活性差 , 区都有两条清晰 、很细的带 , 区则
有很宽较浅的带 。 这 组酶谱是经过悬浮培养后产生的胚性愈伤组织 , 有分化胚状体的能力 。
第 组酶谱则是悬浮培养后 , 继代多次衰老 、褐化的愈伤组织 , 表现酶活性差 , 失去分化的能
力 。 其余的酶谱 一 一 一 一 是 的 ,
、 、 中的绿色 、 白色发
硬的愈伤组织 , 多次继代
、
分化都不能产生胚状体 。 这一现象极有意 义 , 区和 区可作为特
征带检测胚性愈伤组织 。
图 显示不同激素组合培养的不 同状态愈伤组织 的醋酶 同工酶酶谱 。 、 、 组酶谱是
组合悬浮培养后的胚性愈伤组织 , 第 组 因为愈伤组织褐 化 , 酉旨酶活性极弱 , 酶带简
单 。 , 是 〕
、 的胚性愈伤组织 。 、 、 、 的酷酶活性高 , 区有 条带 , 区的
带色重 、清晰 , 、 区带比较明显 。 而其它不具分化能力的愈伤组织 , 酉旨酶谱带少 , 甚至 没有 ,
活性极低 。
结果表明 , 通过悬浮培养产生的有分化能力的胚性愈伤组织 , 同工酶活性高 , 且比较一致 。
因此 , 通过对愈伤组织的同工酶分析 , 有可能对分化胚状体的能力预先提供参考依据 。
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讨 论
棉花组织培养 , 在许多陆地棉品种 如诃字棉等 已获得再生植株 , 其它棉种的再生植
株也有不少报道 , 但多为老品种 。 本研究选用海岛棉阿须莫尼 辐射诱变选育的突
变 系为材料获得再生植株 , 它们的培养成功 , 对于创造或培育新的育种突变材料有很大意义 。
在培养过程中 , 诱导培养基中低浓度的 ,
一
与 有利于愈伤组织形成 。 不利
于外植体诱导 , 但对胚性愈伤组织的形成起关键作用 〔‘ 〕。 而 与高浓度的 有利于胚
状体的发生和发育 〔‘ ‘ 〕。 、 、 、 是 、 体细胞胚胎发育较为适宜的外源激
素 , 而在其培养过程中 , 悬浮培养是获得大量胚状体和再生植株不可缺少的一步 〔‘
, ’ 〕。 在胚
状体萌发培养基中不需要任何激素 , 加激素会使胚性愈伤组织重新愈伤化 , 褐化死亡 。
通过不同状态愈伤组织的醋酶 、过氧化物酶同工酶分析 , 发现有形成胚状体能力的胚
性愈伤组织与不能形成胚状体的愈伤组织 , 不但在状态上不同 , 其同工酶活性有很大差别 。 可
采用以下两种方式预测愈伤组织发育成胚状体的可能性 一是根据其外部形态 、质地 〕 愈伤组
织疏松 、淡黄色或灰白色颗粒状能形成悬浮系和胚状体 二是根据同工酶电泳分析预测愈伤组
织的再生能力 , 这一现象非常有意义 , 可进一步深入研究 。
参 考 文 献
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刘春明 , 姚敦义 陆地棉体细胞发生及细胞组织学研究 植物学报 , , 一
余建明等 陆地棉原生质体高频率分裂及植株再生 遗传学报 , 一
张献龙等 陆地棉品种
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坷字 ”月分跳与非胚性愈伤组织生 化代谢产生 、勺比较研究 作物 丫报
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仁行之等 陆地棉愈伤组织产生 及胚胎发生的细胞学研究 西北植物学报 , 训
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张家明等 陆地棉体细饱植株再生及移栽技术 作物学报
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