全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032187204
赞皇大枣叶片再生植株的初步研究
李　云1 　王　宇2 　田砚亭1 　王树芝3
(11 北京林业大学生物科学与技术学院 ,北京　100083 ; 21 河北省林业厅技术推广站 ,河北 石家庄　050011 ;
31 中国社会科学院考古研究所 ,北京　100710)
摘 　要 :以赞皇大枣组培苗叶片为试材 ,研究了叶片诱导再生不定根的最佳培养基及
其生长调节物质种类及浓度 ,在此基础上从不定根诱导出不定芽 ,获得了完整的再生
植株。结果表明 ,在 1/ 2 MS + IBA 110mg L - 1 + NAA 013mg L - 1培养基上 ,可从叶片上
诱导产生不定根 ,将上述不定根转接到 1/ 2 MS + 62BA 110mg L - 1 + NAA 012mg L - 1培
养基上继续培养 ,从不定根诱导出不定芽 ,从而获得完整的体细胞再生植株。
关键词 :赞皇大枣 ;叶片 ;不定根 ;再生植株
收稿日期 :2002207208
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (38970615)
作者简介 :李云 (1963～) ,男 ,河北蔚县人 ,博士 ,副教授 ,从事林木育种和生物技术研究。
赞皇大枣 (Zanhuang jujube)是枣树( Zizyphus jujuba Mill)中目前已知的唯一含有天然三倍体
植株的品种[1 ] ,其果实营养丰富 ,加工、鲜食均可。然而该品种对枣疯病病原 ———类菌原体
(MLO)的抗性较弱。虽然利用组培微茎尖结合热处理可脱除枣疯病病原 ,但脱毒苗还有再感
染的可能。要想从根本上解决该问题 ,必须培育抗枣疯病新品种。从自然界中选择抗病新品
种需较长时间和较大的筛选范围 ,且成功机率低。因此 ,运用生物技术将抗病基因转入枣树
中 ,是培育抗病新品种的一条迅速而有效的途径。在开展转基因工作时 ,首先应解决体细胞植
株再生难题。目前仅有一些枣树品种的叶片、嫩茎等通过愈伤组织阶段获得再生植株[2～7 ] 的
成功经验 ,赞皇大枣再生较为困难 ,特别是经过“叶片 →不定根 →不定芽 →完整植株”途径还是
一个新的尝试。通过对赞皇大枣叶片再生途径的研究 ,将为今后导入外源抗枣疯病 (MLO) 基
因打下基础。
1 　材料和方法
111 　叶片诱导不定根
取无菌组培苗 ,剪下植株上部的幼嫩叶片 (带叶柄) ,接种于根诱导培养基中 ,叶片远轴面
朝上水平放于培养基上 ,叶柄部分较浅地插入培养基中。为了筛选最佳培养基 ,设计了 2 组试
验 : ①比较不同生长调节物质、不同培养基对诱导叶片产生不定根的效果 ,采用 MS、1/ 2 MS 和
B5 3 个基本培养基 ,分别与 IBA 110mg·L - 1 、IBA 015mg·L - 1 + NAA 0125mg·L - 1和 NAA 015mg·
L - 1 3 种生长调节物质 ,搭配为 9 个处理 ,每处理接种 10 瓶培养基 ,每瓶接种 5 片叶片 ,每处理
781　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :187～190Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
50 片叶片 ; ②以 1/ 2MS 为基本培养基 ,采用 3 因子 3 水平的L9 (34 )正交试验设计 ,研究生长调
节物质及其浓度对诱导不定根的作用 ,3 因子分别为 62BA、IBA、NAA ,其分别对应的 3 个水平
为 :62BA 0、011、012mg·L - 1 , IBA 015、110、115mg·L - 1 ,NAA 011、013、015mg·L - 1 ,共 9 种处理组
合 ,每处理为 50 片叶片。
112 　从不定根上诱导产生再生植株
将叶片诱导产生的不定根水平置于培养基上进行不定芽诱导 ,不定根的放置以刚好没入
培养基表面为佳。试验以 MS、1/ 2MS、B5 为基本培养基 ,62BA 取 110、115、210mg·L - 1 3 个水平 ,
NAA 取 011、012、013mg·L - 1 3 个水平 ,按照 L9 (34 ) 正交试验设计 ,共 9 种处理组合 ,每处理 50
条不定根。以上试验所用培养基均加蔗糖 3 %和琼脂 016 % ,pH 612 ,培养温度 25 ±2 ℃,辅助
光照时间 12h·d - 1 ,光照强度 2000Lx。
2 　结果与分析
211 　叶片不定根的诱导
培养 30d 后调查结果发现 ,叶片经过离体培养后 ,颜色由绿变褐 ,向上卷曲呈筒状 ,不定根
自叶背主脉处和叶柄伤口处产生 ,从叶背处诱导出的细弱 ,呈白色半透明状 ;从叶柄伤口处获
得的为黄白色 ,较粗 ,生长健壮。将 ≥1cm 的不定根定义为有效不定根 ,统计不定根诱导情况
(表 1) 。
表 1 　基本培养基对叶片诱导不定根的影响
Table 1 　Effect of the basic media on inducing adventitious root from the leaves
基本
培养基
media
IBA
(mg·L - 1)
NAA
(mg·L - 1)
生根率
rooting rate
( %)
平均生根率
average rooting rate
( %)
生根数
No. of roots
总生根数
No. of total roots
根均长
average length of roots
(cm)
MS 0　 015 18 23
MS 015 0125 16 1913 32 83 1108
MS 110 0 24 28
1Π2MS 0 015 58 85
1Π2MS 015 0125 52 5816 77 250 1146
1Π2MS 110 0 66 98
B5 0 015 12 18
B5 015 0125 28 1816 32 71 1115
B5 110 0 16 21
　　由表 1 可知 ,以 1/ 2MS 培养基作基本培养基时诱导效果较好 ,从叶片上诱导的不定根的生
根率、总生根数和平均根长均达到较高水平 ,且在此培养基上的不定根粗壮 ,并有少量毛状侧
根。采用诱导不定根较为理想的 1/ 2MS 培养基为基本培养基 ,改变生长调节物质搭配 ,培养
30d 后 ,调查不定根诱导情况 ,总结生长调节物质对诱导产生不定根的影响 (表 2) 。
由表 2 可以看出 ,叶片生根受 62BA 浓度的影响最大 ,当 62BA 浓度达到 011mg·L - 1时 ,对叶
片生根产生明显的抑制作用 ;012mg·L - 1时 ,叶片不能形成有效根 ,仅在叶背或伤口处产生白色
半透明的愈伤组织。另外 , IBA 和 NAA 浓度对从叶片诱导不定根也有一定影响 ,以 IBA 110mg
·L - 1和 NAA013mg·L - 1的效果最好 ,通过极差分析可知 ,当 62BA 用量为 0、IBA 为 110mg·L - 1 、
NAA 为 013mg·L - 1时 ,生根率最高 ,表明从叶片诱导不定根最适培养基为 1Π2MS + IBA 110mg·
881 核　农　学　报 17 卷
L - 1 + NAA 013mg·L - 1 。
表 2 　生长调节物质和配比对叶片生根的影响
Table 2 　Effect of plant growth regulator on inducing adventitious root from leaves
处理
treatment
62BA
(mg·L - 1)
IBA
(mg·L - 1)
NAA
(mg·L - 1)
生根率
rooting rate ( %)
根均长
average length of roots(cm)
1 1 (0) 1 (015) 1 (011) 6014 1150
2 1 (0) 2 (110) 2 (013) 6810 1131
3 1 (0) 3 (115) 3 (015) 4415 1126
4 2(011) 1(015) 2 (013) 512 1115
5 2(011) 2(110) 3 (015) 715 1108
6 2(011) 3(115) 1 (011) 513 1111
7 3(012) 1(015) 3 (015) 0 0
8 3(012) 2(110) 1 (011) 0 0
9 3(012) 3(115) 2 (013) 0 0
K1 17219 6516 6517
K2 1810 7515 7312
K3 0 4918 5210
K1 5716 2119 2119
K2 610 2512 2414
K3 0 1616 1713
R 5716 816 711
212 　不定根诱导产生再生植株
将诱导产生的不定根水平接种于分化培养基中 ,按L9 (34 ) 正交设计 ,20d 后发现从根上开
始有不定芽萌发 ,调查结果如表 3 所示。分析认为培养基类型对不定根再生植株影响最大 ,无
机盐浓度是影响不定根再生植株的主要因素 :其次是植物生长调节物质 NAA 和 62BA 的浓度。
各因素的最适搭配培养基应为 :1Π2MS + 62BA 110mg·L - 1 + NAA 012mg·L - 1 。
表 3 　培养基对植株再生的影响
Table 3 　Effect of media on plant regeneration
处理
treatment
培养基
media
62BA
(mg·L - 1)
NAA
(mg·L - 1)
植株再生率
regeneration rate ( %)
1 1 (MS) 1 (110) 1(011) 115
2 1 (MS) 2 (115) 2(012) 915
3 1 (MS) 3(210 3(013) 0
4 2(1Π2MS) 1 (110) 2(012) 1815
5 2(1Π2MS) 2 (115) 3(013) 16
6 2(1Π2MS) 3 (210) 1(011) 8
7 3 (B5) 1 (110) 3(013) 315
8 3 (B5) 2 (115) 1(011) 12
9 3 (B5) 3 (210) 2(012) 1315
K1 11 2315 2115
K2 4215 3715 4115
K3 29 2115 1915
K1 3167 7183 7117
K2 14117 1215 13183
K3 9167 7117 615
R 1015 5133 7133
981　3 期 赞皇大枣叶片再生植株的初步研究
213 　再生植株的生长和扩繁
21311 　再生植株的生长 　再生植株形成后 ,若继续留在原诱导不定根的培养基上 ,不定根会
出现生长停滞、褐化死亡等现象 ,这可能与 62BA 浓度有关。为了及时将已成功诱导的再生植
株进行保存和扩繁 ,需从再生植株上剪切 1cm 长的茎段 ,及时转入壮苗培养基 1/ 2MS + NAA
012mg·L - 1和扩繁培养基上 ,以保证植株健壮生长和大量繁殖。
21312 　再生植株的扩繁 　取再生植株的茎段 ,转接到分化培养基 MS + 62BA 215·mgL - 1 + NAA
012mg·L - 1上 ,增殖率可达 500 %。在增殖培养基上培养 30d 后 ,可用相同培养基进行继代培
养 ,以期获得较大的繁殖基数 ,当将嫩梢剪切成 1cm 长的茎段 ,转接入生根培养基 1Π2MS + IBA
013mg·L - 1 + NAA 012mg·L - 1中 ,培养 20d 时调查发现 ,植株生根率达 95 %以上。
3 　讨论
以赞皇大枣叶片为试材诱导产生不定根 ,并通过不定根培养获得体细胞再生植株是一条
切实可行的再生途径。由于该途径采用生长调节物质的活性较弱、浓度较低 ,在培育过程中几
乎无愈伤组织产生 ,因此 ,可以认为产生体细胞变异的概率是非常低的。试验中存在的主要问
题是不定根再生植株的再生率较低 (最高仅为 1815 %) 。因此 ,为了提高不定根再生植株的再
生率 ,需要从叶片选择、培养基筛选、生长调节物质种类和用量等方面做进一步研究。
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A PRELIMINARY STUDY ON THE PLANT REGENERATION
FROM LEAVES OF ZANHUANG JUJUBE
LI Yun 　WANG Yu 　TIAN Yan2ting 　WANG Shu2zhi
( College of Biological Science and Technology , Beijing Forestry University , Beijing 　100083)
Abstract :The tissue culture of leaves from Zanhuang jujube were studied. Adventitious roots were
first induced on 1Π2MS medium which supplemented with IBA( 110mg·L - 1 ) and NAA ( 013mg·
L - 1) ,and regenerative plants were obtained on 1Π2MS + 62BA ( 110mg·L - 1 ) + NAA ( 012mg·
L - 1) medium from the adventitious roots. Methods of regeneration and propagation were also
discussed.
Key words :Zanhuang jujube; leaf ; adventitious root ; regenerative plant
091 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :187～190