全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 012009205
12 C6 + 重离子辐照大葱的细胞学和 RAPD 分析
侯岁稳1 ,2 　钱平平2 　管利萍2 　吴大利2 　张颖聪2 　孙兰弟2 　李　媛2
高清祥2 　颉红梅1 　周利斌1 　党秉荣1 　李文建1
(11 中国科学院近代物理研究所 ,甘肃 兰州　730000 ;
21 兰州大学生命科学学院 干旱与草地生态教育部重点实验室 ,甘肃 兰州　730000)
摘 　要 :用 30、90 和 180Gy 12 C6 + 重离子辐照处理大葱干种子 ,研究其对大葱根尖的细胞学效应 ,并采用随
机扩增多态性 DNA(RAPD)技术初步分析了其变异类型。不同剂量12 C6 + 的重离子照射能有效诱导大葱
根尖细胞微核和染色体畸变。随着辐照剂量的增加 ,幼苗根尖细胞微核形成几率明显增大 ,微核率、多
微核率和染色体总畸变率呈线性上升。但除去微核以外的染色体畸变率则呈 U 型变化。RAPD 结果表
明 ,大葱不同处理之间的 DNA 存在明显差异 ,所用 35 种引物中有 28 种出现了特异性条带 ,既有新增条
带 ,又有缺失条带 ,还有迁移率的差异。30、90 和 180Gy 剂量辐照引起的 RAPD 变异率分别为 29191 %、
41105 %和 22114 %。结果发现高微核率和染色体变异过大会导致高致死效应 ,使得染色体总畸变率高
的处理组在当代生长苗的 DNA 变异率变小。
关键词 :12 C6 + 重离子 ;大葱 ;染色体畸变 ;RAPD
CYTOLOGICAL EFFECTS AND RAPD ANALYSIS OF Allium fistulosum L. IRRADIATED BY 12 C6 + HEAVY IONS
HOU Sui2wen1 , 2 　QIAN Ping2ping2 　GUAN Li2ping2 　WU Da2li2 　ZHANG Ying2cong2 　SUN Lan2di2
LI Yuan2 　GAO Qing2xiang2 　XIE Hong2mei1 　ZHOU Li2bin1 　DANG Bing2rong1 　LI Wen2jian1
(11 Institute of Modern Physics , Chinese Academy of Sciences , Lanzhou , Gansu 　730000 ;
21 Key Laboratory of Arid and Grassland Ecology , Ministry of Education , School of Life Sciences ,Lanzhou University , Lanzhou , Gansu 　730000)
Abstract :Cytological effects and RAPD analysis of root2tip cells of Allium fistulosum L. , the dry seeds were irradiated by 12
C6 + heavy ions , were studied. Micronucleus and chromosomal aberration observed in the root2tip cells showed that obvious
“linear rise”trend was in the frequency of micronucleus , multi2micronucleus and total chromosomal aberration. But a“U2
formed”trend was observed only in the chromosomal aberration frequency. At the same time , RAPD analysis revealed 12 C6 +
heavy ions exerted great effect on DNA variation of Allium fistulosum L. . Flawing bands , increasing bands and the ones with
different transport ratios were observed in amplified bands of 28 selected primers. The DNA variation rate for 30 , 90 and
180Gy treatments was 29191 % , 41105 % and 22114 % , respectively. This study also found that high micronucleus frequency
and chromosomal variation lead to high lethality , resulting in low DNA variation rate in the survived plants which seeds were
irradiated with high doses.
Key words :12 C6 + heavy ions ; Allium fistulosum L. ; chromosomal aberration ; RAPD
收稿日期 :2007204210 　接受日期 :2007205221
基金项目 :“西部之光”联合学者项目 (XL050616) ;中国博士后科学基金 (20060390715) ;甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目 ( GNSW22006216)
作者简介 :侯岁稳 (19692) ,男 ,博士后 ,甘肃静宁人 ,主要从事细胞生物学研究工作。E2mail : housw @lzu. edu. cn　　离子束是带电的重粒子 ,对生物的诱变作用强 ,诱发突变谱广 ,突变率高[1 ] 。自 1986 年离子注入开始应用于作物品种改良以来 ,已经在芸豆[2 ,3 ] 、玉米[4 ] 、小 麦[5 ,6 ] 、水稻[6 ,7 ] 、棉花[8～11 ] 、烟草[12 ] 、拟南芥[13 ] 、甜菊[14～16 ] 、茄果类蔬菜[17 ,18 ] 、杨树和银杏[19 ] 等植物上进行了研究 , 产生了染色体行为异常和结构变异等突变
9　核 农 学 报　2008 ,22 (1) :9～13Journal of Nuclear Agricultural Sciences
效应 ,使一些作物在产量和果实大小方面得到明显的
提高[14 ,17 ] 。
RAPD技术用于遗传研究获得了有用的分子标
记[20 ,21 ] ,使基因组 DNA 多态性的检测得以快速、有效
地进行[22 ] ,通过 RAPD 对甜菊[16 ] 、烟草[12 ] 等由离子注
入引起植物变异的研究已经陆续报道。
与其他蔬菜相比 ,我国大葱育种明显滞后于生产 ,
尤其近年来随着大葱出口和深加工产品的需求增加 ,
使得市场对其品种的依赖性大大增强。因此选育抗
旱、抗寒、抗病虫害和高产的大葱品种具有较高的经济
价值。目前对于采用重离子束进行大葱辐照育种的研
究在国内外还未见报道。本文研究了12 C6 + 重离子辐
照对大葱染色体畸变率等的影响 ,并进行了 RAPD 分
析 ,从分子水平上为大葱的诱变育种提供参考。
1 　材料和方法
111 　材料
试验用大葱种子为兰州当地种植品种。
112 　方法
11211 　辐照处理 　试验在兰州重离子加速器国家实
验室 (NL2HIAL)重离子研究装置 (HIRFL) TL2 终端上进
行。引出碳离子束初始能量为 80155MeVΠu 的12 C6 + ,经
过镍窗、电离室、空气后照射到样品上 ,种子辐射均在
大气条件 8513kPa 下。辐照剂量为 30、90 和 180Gy ,以
未经辐照的种子作为对照。
11212 　微核和染色体畸变的观察 　选取对照、30、90
和 180Gy 辐照的种子各 100 粒 ,放入培养皿中发芽 ,待
根长达到约 2cm 时切取 015cm 长的根尖 ,用 Carnoy 液
(乙醇∶冰醋酸 = 3∶1)固定 ,苯酚品红染液染色压片 ,在
Motic 显微镜下观察染色体畸变情况。每个辐照处理
各观察 20 个根尖 ,每个根尖随机选取 10 个视野 ,统计
出现微核、多微核、落后染色体、染色体桥等染色体畸
变现象的细胞数 ,拍照 ,统计微核率和染色体总畸变
率。微核率 = (含有微核的细胞数Π观察细胞总数) ×
100 % ;染色体总畸变率 = (含有染色体畸变的总细胞
数Π观察细胞总数) ×100 % ;多微核率 = (含有多微核
的细胞数Π观察细胞总数) ×100 % ;染色体畸变率 =
(含有染色体畸变的细胞数 (除去微核以外的)Π观察细
胞总数) ×100 %。
11213 　基因组总 DNA 的提取和 RAPD 分析 　分别取
4 个处理组的大葱新鲜嫩叶约 013g ,用 CTAB 法进行基
因组总 DNA 的提取 ,提取过程中 DNA 粗提液用 RNA
酶进行 37 ℃30 min 保温消化处理 ,以去除 RNA 污染。
RAPD 所用 35 种引物 ,Taq 酶和 dNTP 均购自上海生工
生物工程技术服务有限公司。对每个引物制备反应混
合物 ,并以水为模板作为负对照 ,总反应体系 30ul ,加
入 10 ×Taq buffer 为 3μl , 2mmolΠL MgCl2 为 214μl ,
012mmolΠL dNTP 为 016μl , 012μmolΠL 随 机 引 物 为
016μl ,110U Taq polymerase ,DNA 模板 3μl ,无菌超纯水
2012μl ,在 Master Cycle Gradient PCR 扩增仪中进行扩
增。扩增程序如下 : 94 ℃预变性 5min ,94 ℃变性 45s ,
32 ℃退火 45s ,72 ℃延伸 1min ,40 个循环 ,再 72 ℃保温
10min ,最后 4 ℃保温。RAPD 扩增产物 10μl 加 2μl 加样
缓冲液 ,用 110 %的琼脂糖凝胶 40ml (加入 015μgΠml 溴
化乙锭 ( EB) 2μl 染色) 在 1 ×TAE 缓冲液中电泳分离 ,
在BIO2RAD 凝胶成像分析系统上拍照 ,统计总条带数
和特异性条带数并进行分析。相似率 Sxy = 2NxyΠ(Nx
+ Ny) ,其中 Nxy 表示个体 x 和 y 之间共有的 DNA 扩
增片段的数目 ,Nx 和 Ny 分别是个体 x 和 y 的 DNA 扩
增片段的数目[23 ] ;变异率 = 1 - 相似率。
2 　结果与分析
211 　12 C6 + 重离子辐照对大葱根尖细胞染色体畸变的
影响
12 C6 + 重离子辐照能有效地诱导大葱染色体产生
各种染色体畸变类型 ,如微核、染色体桥、游离染色体、
落后染色体等 (图 1) 。随辐照剂量的增加 ,幼苗根尖
细胞微核形成几率明显增大 ,微核率呈线性上升 (表
1) ,180Gy 处理的大葱微核率最高 ,比 30 和 90Gy 分别
高出 6111 %和 3194 %。30 和 90Gy 处理的大葱单个根
尖细胞出现以单微核居多 ,极少出现双微核和多微核 ,
但 180Gy 的大葱出现了一定数量的双微核及多微核 ,
且多微核率随辐照剂量增加呈线性上升 (图 2) 。随着
辐照剂量的增大 ,染色体总畸变率也呈线性上升 (表
1) ,但除去微核以外的染色体畸变率则呈 U 型变化 ,
90Gy 大葱染色体畸变率极小 ,仅为 0107 % ,比 30Gy 和
180Gy 分别低了 0150 %和 0187 % (图 3) 。这表明大葱
受到不同剂量12 C6 + 重离子辐射后有不同程度的损伤 ,
虽然总的表现为微核率和染色体总畸变率呈线性上
升 ,但除微核以外的染色体畸变率却发生了不同的变
化 ,这些变化极有可能导致细胞内遗传物质发生改变 ,
产生有益变异。
212 　RAPD 分析
12C6 + 重离子辐照后 ,RAPD 结果表明大葱不同处
理之间 DNA 出现明显变化。在筛选出的 35 个引物中
有 28 个出现了特异性条带 (表 2) 。共扩增出 207 条
01 核　农　学　报 22 卷
　　　
图 1 　12 C6 + 重离子辐射大葱根尖细胞产生的染色体畸变
Fig. 1 　The micronucleus and chromosomal aberrations in root2tip cells of Allium fistulosum L. by
12 C6 + heavy ion beam implantation
A : 对照 ;B2C:微核 ;D2F :染色体桥 ; G:染色体桥和落后染色体 ;H :落后染色体 ; I2J :游离染色体
A : Control ; B2C: Micronucleus ; D2F : Bridge chromosomes ; G: Bridge chromosome and backward chromosome ; H: Backward chromosome ; I2J : Free chromosomes
表 1 　12 C6 + 重离子束辐照对大葱根尖细胞染色体变异的影响
Table 1 　Effect of 12 C6 + heavy ion beam irradiation on chromosomal aberration in root2tip cells of Allium fistulosum L.
剂量
dose ( Gy)
观察细胞数
cells
微核细胞数
cells with micronucleus
畸变细胞数
aberration cells
微核率
micronucleus( %)
总畸变率
total aberration ( %)
0 1000 0 0 0 0
30 4755 84 27 1177 ±0. 44 2133 ±0. 60
90 3475 137 3 3194 ±1. 38 4103 ±1. 40
180 3363 265 33 7188 ±1. 55 8186 ±1. 54
图 2 　不同剂量12 C6 + 重离子对大葱根尖
细胞多微核率的影响
Fig. 2 　Effect of different 12 C6 + heavy ion beam
doses on multi2micronucleus frequency in root2tip
cells of Allium fistulosum L1 图 3 　不同剂量12 C6 + 重离子对大葱根尖细胞(除微核外)染色体畸变率的影响Fig. 3 　Effect of different 12 C6 + heavy ion beam doseson chromosomal aberration frequency except micronucleusin root2tip cells of Allium fistulosum L1
带 ,其中对照、30、90 和 180Gy 分别扩增总条带数为 63、
54、32 和 68 条 (表 3) ,扩增带谱分子量在 100bp～2000bp
之间 (图 4) 。从图 4 列举的部分引物扩增图谱可以看
出 ,RAPD 扩增的结果中既有新增和缺失条带 ,还有相同
条带之间迁移率的差异 ,且某些相同条带的亮度 (即
DNA 含量)也有所差异 ,90Gy 的泳道经常没有条带或条
带很少 (表 2 ,图 4) ,其产生的特异性条带最多 ,为 39 条 ,
其次是 30Gy(35 条) ,180Gy 最少 (29 条) ,与对照 (63 条)
差异较大 (特异性条带 = 增加条带数 + 缺失条带数) 。
由此计算出 30、90、180Gy 的变异率分别为 29191 %、
41105 %和 22114 %。结果表明经过12 C6 + 重离子辐照能
有效地诱导大葱 DNA 发生改变 ,从而产生变异。
11　1 期 12C6 + 重离子辐照大葱的细胞学和 RAPD 分析
表 2 　28 个引物扩增出的 DNA 片段数
Table 2 　DNA fragments amplified with 28 primers
引物
primer
序列
sequence
产生条带数 amplified band numbers per primer
对照 (control) 30Gy 90Gy 180Gy
S13 TTCCCCCGCT[24 ] 2 0 0 1
S38 AGGTGACCGT[24 ] 3 0 3 3
S72 TGTCATCCCC[24 ] 2 0 0 2
S73 AAGCCTCGTC[24 ] 3 1 0 0
S83 GAGCCCTCCA[26 ] 0 0 0 2
S86 GTGCCTAACC[26 ] 3 2 0 3
S87 GAACCTGCGG[26 ] 0 0 0 3
S88 TCACGTCCAC[26 ] 1 2 0 2
S90 AGGGCCGTCT[26 ] 2 1 3 3
S95 ACTGGGACTC[26 ] 3 3 3 3
S97 ACGACCGACA[26 ] 4 4 3 4
S98 GGCTCATGTG[26 ] 1 2 2 1
S99 GTCAGGGCAA[26 ] 1 2 2 1
S101 GGTCGGAGAA[25 ] 4 1 0 0
S105 AGTCGTCCCC[25 ] 1 0 0 3
S109 TGTAGCTGGG[25 ] 1 2 0 3
S112 ACGCGCATGT[25 ] 4 5 0 5
S113 GACGCCACAC[25 ] 2 1 0 2
S118 GAATCGGCCA[25 ] 3 2 2 3
S200 TCTGGACGGA[24 ] 1 1 1 1
S424 GACCGACCCA[26 ] 1 1 1 3
S425 ACTGAACGCC[26 ] 3 3 1 3
S428 ACCTCAGCTC[26 ] 5 5 2 5
S430 ACAACTGGGG[26 ] 4 5 1 2
S431 TCGCCGCAAA[26 ] 2 2 1 2
S432 CACAGACACC[26 ] 2 5 1 3
S435 CAGCGACTGT[26 ] 3 1 3 3
S440 GGTGCTCCGT[26 ] 2 3 3 2
表 3 　28 个引物扩增出的 DNA 片段数分析
Table 3 　Analysis of DNA fragments amplified
with 28 primers
剂量
dose
( Gy)
总条带数
total
bands
缺失条带数
flawing
bands
增加条带数
increasing
bands
相似率
similar
rate ( %)
变异率
variation
rate ( %)
对照 (Control) 63 - - - -
30 54 22 13 70109 29191
90 32 35 4 58195 41105
180 68 12 17 77186 22114
3 　讨论
重离子辐射引起染色体畸变的研究是离子注入作
物诱变和生物学效应研究的一个重要方面。其常见特
征是微核、染色体桥、落后染色体等畸变现象 ,这些畸
变有可能导致细胞内遗传物质的改变 ,所以重离子辐
射引起染色体畸变的研究在育种应用上具有重要意
义。相关研究表明 ,重离子可以在细胞的有丝分裂期
诱导染色体的畸变 ,这种畸变在其他的辐射类型中见
不到[27 ] 。另外有研究表明 ,DNA 是辐射损伤的关键靶
分子 ,一般认为 DNA 单个位点的损伤 ,包括双链断裂 ,
都能被有效修复 , 只有 DNA 的成簇损伤 ( clustered
damages) 或局部多损伤位点 ( local lymultily damage
dedsites ,LMDS) ,即在直径为 1～4nm 的位点上至少发
生 2～5 次能量沉积事件 (局部电离事件) ,才是较难被
　　　　
图 4 　引物 S430 ,S424 ,S86 ,S83 ,S440 ,S435 ,S200 ,S118 扩增结果
Fig. 4 　The RAPD results produced by S430 , S424 , S86 , S83 , S440 , S435 , S200 and S118 primers
M:Marker (bp) ;1 :对照 ,control ;2 :30Gy ;3 :90Gy ;4 :180Gy
21 核　农　学　报 22 卷
修复而导致细胞死亡、突变的关键损伤[28 ] 。受到12 C6 +
重离子辐照的大葱 ,正是随着辐照剂量的增加 ,细胞损
伤增大 ,微核率和染色体总畸变率明显呈线性上升 ,在
修复过程中可能导致了细胞内遗传物质的改变 ,从而
产生变异 ,其中 ,有的可作为育种材料。
近年来 RAPD 技术在遗传图谱的构建、辅助选择
育种、亲缘关系和遗传多样性的研究以及在植物体细
胞杂种鉴定等方面有很大的应用进展。对12 C6 + 重离
子辐照后的大葱 DNA 进行 RAPD 扩增后 ,与对照相
比 ,处理过的植株 DNA 的扩增条带主要出现了 3 种情
况 :第一 ,28 种引物在处理组和对照组之间各出现 0～
5 条差异性片段 ;第二 ,各处理组和对照组之间可以扩
增出某些相同的条带 ,但条带荧光强度有所差异 ;第
三 ,各处理组之间的差异没有显现出明显的规律性。
这些与前人的研究结果相似[13 ,16 ] ,但本试验结果变化
差异更大。这大概与我们选择的辐照剂量和试验材料
不同有关。
随着辐照剂量的增大 ,染色体总畸变率呈线性上
升趋势 ,而除去微核以外的染色体畸变率则呈“U 型”
变化 ,即 90Gy 处理的大葱除去微核以外的染色体畸变
率明显小于 30 和 180Gy。染色体总畸变率越大应该相
对应的 DNA 变异率也越大 ,但从 RAPD 扩增的结果显
示 90Gy 变异率最大 ,180Gy 的反而最小。这可能由于
在最大剂量的处理组 ,高微核率和变异过大导致高致
死率 ,仅存的几株苗可能是经过适度的变异或者是个
别植株本身的自我修复能力较强而存活下来的 ,使得
RAPD 的变异率最低 , 只为 90Gy 处理的一半左右
(22114 %) (表 3) 。
参考文献 :
[ 1 ] 　余增亮 1 离子束生物技术引论 1 合肥 :安徽科学技术出版社 ,
1996 ,223～240
[ 2 ] 　陆　挺. 离子注入生物样品的正电子湮没研究. 北京师范大学学
报 (自然科学版) ,1995 ,31 (2) :204～206
[ 3 ] 　薛建明 ,王宇刚 ,卢希庭 ,等. 低剂量离子在生物样品中的投射行
为的研究. 核技术 ,1999 ,22 (8) :449～453
[ 4 ] 　罗红兵 ,赵　葵 ,郭继宇 ,等. 重离子束在玉米诱变育种中的应用
研究. 湖南农业大学学报 (自然科学版) ,2004 ,30 (4) :385～388
[ 5 ] 　刘志芳 ,邵俊明 ,唐掌雄 ,等. 不同能量重离子注入农作物的诱变
效应. 核农学报 ,2006 ,20 (1) :1～5
[ 6 ] 　陆　挺. 离子注入植物引起生物效应的机理. 北京师范大学学报
(自然科学版) ,1996 ,32 (2) :227～229
[ 7 ] 　王采莲 ,慎　玫 ,朱凤绥 ,等. 离子注入对水稻诱变效应的初步研
究 ,核农学报 ,1995 ,9 (1) :13～19
[ 8 ] 　周立人 ,范　军 ,程备久 ,等. 不同能量的氮离子注入棉花种子的
诱变效应研究. 安徽农业大学学报 ,1998 , 25 (4) : 371～374
[ 9 ] 　郑冬官 ,方其英 ,黄德祥 ,等. 离子注入在棉花育种中的诱变功
效. 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :315～317
[10 ] 　程备久 ,田秋元 ,余增亮 ,等. 离子注入诱发棉花过氧化物酶同功
酶及农艺性状变异的研究. 棉花学报 ,1994 ,6 (1) :41～47
[11 ] 　程备久 ,李　展 ,周立人 ,等. 三种离子注入棉花种子的生物学效
应. 安徽农业大学学报 ,1995 ,22 (3) 189～195
[12 ] 　张志宏 ,杜立群 ,李洪杰. 离子注入烟草种子引起的 M1 代变异分
析. 生物物理学报 ,1998 ,14 (4) :762～766
[13 ] 　梁前进 ,胡玉莲 ,张根发. 拟南芥氮、碳离子注入诱变效应分析.
生物物理学报 ,2002 ,18 (2) :251～255
[14 ] 　舒世珍 ,朱凤绥 ,陆　挺. 离子注入甜菊种子效应初报. 安徽农业
大学学报 ,1994 ,21 (3) :299～302
[15 ] 　王彩莲 ,慎　玫 ,陈秋方 ,等. 离子注入甜菊的诱变效应研究. 核
农学报 ,1998 ,12 (6) :347～352
[16 ] 　丁　亮 ,陈睦传 ,沈明山 ,等. RAPD 分析氮离子注入甜菊种子后
的幼苗基因组 DNA 变异. 生物物理学报 ,1999 ,15 (4) :798～803
[17 ] 　邬振祥 ,李素梅 ,尹国香 ,等. 离子注入在番茄育种上的应用. 安
徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :321～325
[18 ] 　李小国 ,张宏伟. 离子注入茄果类蔬菜种子试验初报. 新疆农业
科学 ,2002 ,39 (4) :238～239
[19 ] 　彭镇华 ,胡蕙露 ,康忠铭 ,等. 离子注入杨树和银杏的同工酶研
究. 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :255～259
[20 ] 　Williams J G K, Kubelik A R , Linak KJ , et al . DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are as useful as genetic markers. Nucl
Acid Res , 1990 , 18 (22) : 6531～6535
[21 ] 　Welsh J , Mcclelland M. Finger printing genomes using PCR with
arbitrary primersare useful genetic markers. Nucl Acid Res , 1990 , 18
(22) :7213～7218
[22 ] 　惠东威 ,庄炳昌 ,顾　京 ,等. 利用 RAPD 对大豆属植物系统学研
究的初报. 科学通报 ,1994 ,39 (2) :175～178
[23 ] 　李建中 ,鲁双庆 ,刘少军 ,等. 异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传
变异的 RAPD 分析. 水产学报 ,2003 ,27 (5) :403～408
[24 ] 　盖树鹏 ,孟祥栋. 大葱胞质雄性不育基因的 RAPD 标记. 农业生物
技术学报 ,2002 ,10 (1) :94～97
[25 ] 　孟祥栋 ,马　红 ,张卫华. 利用 RAPD 技术对葱属品种遗传关系的
分析. 生物多样性 ,1998 ,6 (1) :37～41
[26 ] 　卢龙斗 ,熊 　蕾 ,高武军 ,等. 葱属 12 种植物的 RAPD 分析. 西北
植物学报 ,2002 ,22 (5) :1086～1092
[27 ] 　Prasanna P G S , Kolanko C J , Gerstenberg H M , et al . Premature
chromo - some condensation assay for biodosimetry : studies with fission
neutrons. Heslth Phys , 1997 , 72 : 594～600
[28 ] 　丘冠英 ,彭银祥. 生物物理学. 武汉 :武汉大学出版社 ,2000 , 186
～188
31Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (1) :9～13