全 文 ：　文章编号 :100028551 (2002) 0420197206
重金属胁迫对水稻叶片过氧化氢酶活性
和同功酶表达的影响
葛才林1 　杨小勇1 　朱红霞1 　孙锦荷2
王泽港1 　罗时石1 　马　飞1
(11 扬州大学农学院 ,江苏 扬州　225009 ;21 浙江大学核农学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :本文报道了浓度为 0105～210mM 的重金属 Cu、Cd、Hg 胁迫对 3 个不同类型水
稻品种幼苗叶片过氧化氢酶 (CAT)活性和同功酶表达的影响。结果表明 : (1) 在胁迫
浓度为 0105～210mM 范围内 ,CAT 活性随 Cu 和 Cd 浓度的增高而持续下降 ;CAT 活
性随 Hg 浓度的增高表现为先下降 ,再略有升高 ,然后又明显下降 ,表明浓度为 0105
～210mM 的 Cu、Cd、Hg 胁迫显著抑制 3 个不同类型水稻品种幼苗叶片 CAT 活性。
(2)应用聚丙烯胺浓度梯度电泳对 CAT同功酶分析显示 ,正常情况下水稻叶片中有 1
～2 个 CAT同功酶的表达 (武育粳叶片中表达 2 个 ,扬稻 6 号和汕优 818 叶片中表达
1 个) 。011mM 的 Cd 胁迫能诱导武育粳叶片 ,011mM 的 Cd 和 Hg 胁迫能诱导扬稻 6
号叶片表达 1 个新的 CAT同功酶。尽管如此 ,正常表达的 CAT同功酶仍受到重金属
Cu、Cd、Hg 胁迫的抑制。
关键词 :重金属 ;水稻 ;过氧化氢酶
收稿日期 :2002201228
作者简介 :葛才林 (1962～) ,男 ,江苏高淳人 ,博士 ,扬州大学副教授 ,从事核农学及生物物理的教学科研工作
土壤中的重金属污染不仅会导致农作物产量下降 ,且进入到食物链中会对人类健康产生
有害影响[1 ] 。农田土壤中重金属污染主要源于肥料中的杂质、污水灌溉和各种废弃物[2 ] 。
一般认为 ,重金属对作物伤害的主要途径是引起作物体内的过氧化胁迫。在未受污染的
正常植物细胞中 ,质体、线粒体和微体中会不可避免地产生活性自由基 ,O-2 产生于质体和线
粒体的电子传递系统 ,H2O2 产生于乙醛酸循环体中的β2氧化过程和过氢化物酶体中的光呼吸
过程及超氧化物歧化酶 (SOD)对 O -2 的清除过程[3 ] 。但正常情况下 ,这些器官中产生的活性自
由基受到很好的稳态调节 ,以免它们在体内的过量积累[4 ] 。O -2 由 SOD 清除 ,微体中产生的
H2O2 由过氧化氢酶 (CAT)清除 ,而在细胞其它区域产生的 H2O2 由抗坏血酸过氧化物酶 (APX)
清除[3 ] 。但这种平衡会被各种胁迫所打破 ,目前研究确认 ,作物体内的过量重金属能导致大量
O -2 、H2O2 、OH·的产生和积累[5 ] ,进而导致脂质过氧化、蛋白质结构改变、DNA 断裂、叶绿素含
量降低、离子渗漏 ,最终导致细胞死亡[6 ] 。
重金属胁迫还能引起各种抗氧化酶活性的改变。关于重金属胁迫对 CAT的影响 ,已有一
791　核 农 学 报　2002 ,16 (4) :197～202Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
些研究报道 ,但由于研究材料、重金属种类及浓度与处理时间的不同 ,报道的研究结果间存在
许多矛盾。Dixit 等报道 ,4 和 40μmM 的 Cd 处理豌豆能使叶片中的 CAT活性增高[7 ] ,Vtoria AP
等的研究也表明 ,经浓度范围为 0125～110mM 的 Cd 处理 24h 后水稻根和叶中的 CAT 活性均
有增高[8 ] 。但 Romero2Puertas Mc 等用 Cd 处理被提纯的豌豆过氧化物酶体 ,发现 Cd 对豌豆过
氧化物酶体的伤害主要源于 H2O2 的产生 ,而不是源于 O -2 的产生[9 ] 。Sharma DC 和 Sharma CP
用不同浓度的 Cr 处理砂培小麦 ,发现 Cr 处理造成小麦 CAT活性的降低[10 ] 。杨居荣等的研究
也表明 ,当土壤中 Cd 浓度为 250mgΠkg 时 ,黄瓜和大豆体内的 CAT活性下降[11 ] 。为进一步明确
不同种类、不同浓度的重金属胁迫对水稻 CAT 的影响 ,本文研究了不同浓度的 3 种重金属
(Cu、Cd、Hg)对水稻不同类型 (粳稻、籼稻和杂交稻)品种幼苗叶内 CAT活性和同功酶表达的影
响。
1 　材料和方法
111 　材料
供试重金属离子 :Cu2 + (CuSO4·5H2O) ,Cd2 + (CdCl2·215H2O) ,Hg2 + [ Hg (CH3 COO) 2 ]。均为
化学纯。供试水稻品种 ( Oryza sativa L. ) 为武育粳 (粳稻型) 、扬稻 6 号 (籼稻型) 、汕优 818 (杂
交稻) ,由扬州大学稻麦研究室提供。
112 　方法
11211 　水稻培养和重金属胁迫处理 　将浸种催芽后的萌发种子播种于培养皿中的尼龙网上 ,
加入稍加改进的木村 B 培养液 (将培养液中的柠檬酸铁改为 EDTA2铁 ,加入一定浓度的硅酸
钠。pH为 510 左右) ,20 ℃培养。待水稻幼苗长至 2 叶 1 心时 ,分别将各培养皿中培养液换成
含有 0、0105、011、015、110、210mM Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 的培养液 ,进行重金属胁迫处理。
11212 　酶液提取 　重金属处理 7d 后 ,取水稻幼苗叶片 ,称重后置于预冷的研钵中 ,按 1∶3 的
比例加入预冷的提取介质 (蔗糖 11198g ,Tris 0160g ,抗坏血酸钠 01088g ,半胱氨酸 01030g ,氯化
镁 01020g ,定容至 100ml ,pH值调为 714) ,冰浴上研磨成匀浆 ,15000rpm、0 ℃离心 30min ,上清液
为酶提取液 , - 20 ℃保存备用。
11213 　淀粉酶活性测定 　采用氧化还原滴定法 (即碘量法) 进行 CAT活性测定。取上述酶液
20μl (空白加 20μl 蒸馏水代替酶液) 于 50ml 锥形瓶中 ,加入 pH710 的磷酸缓冲液 5ml ,再加入
1 %的 H2O2 1ml ,20 ℃反应 5min ,然后加入 2N 的 H2 SO4 3ml 以中止反应。再加入 10 %的 KI 1ml
并滴入 2～3 滴钼酸铵和淀粉指示剂 ,最后用 0108N 的 Na2 S2O3 滴定至蓝色消失 ,记录 Na2 S2O3
的用量。根据空白和测定二者滴定值之差 ,可计算被 CAT 分解的 H2O2 的量 ,并以 1min 内 1g
鲜重叶组织所分解 H2O2 的 mg 数表示 CAT活性。
11214 　淀粉酶同功酶分析 　吸取上述酶液 20μl ,采用聚丙烯酰胺浓度梯度凝胶电泳技术进行
同功酶分析。聚丙烯酰胺浓度范围为 4 %～30 % ,并使凝胶中含有 015 %的淀粉。4 ℃条件下 ,
220V 稳压电泳 ,电泳时间为 10h。电泳后的凝胶于 015 % H2O2 中浸泡 1min ,然后用蒸馏水冲
洗 ,再放入酸化的 015 %的 KI溶液中染色。凝胶上有 CAT活性的部位不被染色 ,其余部位变
成蓝色。
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2 　结果和分析
211 　重金属胁迫对水稻叶片过氧化氢酶活性的影响
图 1 　重金属胁迫对水稻武育粳幼苗
叶中 CAT活性的影响
Fig. 1 　Effect of heavy metal stress on the
activity of catalase in the leaves of
Wuyujing seedling
图 2 　重金属胁迫对扬稻 6 号幼苗
叶中 CAT活性的影响
Fig. 1 　Effect of heavy metal stress on the
activity of catalase in the leaves of
Yangdao 6 seedling
图 3 　重金属胁迫对汕优 818 幼苗
叶中 CAT活性的影响
Fig. 1 　Effect of heavy metal stress on the
activity of catalase in the leaves of
Shanyou 818 seedling
图 1～3 分别为不同浓度的重金属 (Cu、Cd、Hg)胁迫对水稻武育粳、扬稻 6 号和汕优 818 幼
苗叶中 CAT活性的影响动态。从图中可看出 : (1)浓度范围为 0105～210mM 的 Cu、Cd、Hg 胁迫
均使水稻各品种幼苗叶中的 CAT活性显著低于对照 ,表明该浓度范围的 Cu、Cd、Hg 胁迫显著
抑制水稻各品种幼苗叶中的 CAT活性。(2) 随 Cu 和 Cd 胁迫浓度的增高 ,水稻各品种幼苗叶
中的 CAT活性持续下降。而随 Hg 胁迫浓度的增高 ,水稻各品种幼苗叶中的 CAT活性却呈现
先迅速下降 ,后略有上升 ,再明显下降的规律。(3) 不同重金属对供试水稻品种叶片 CAT活性
的抑制程度有明显差异 ,Cu 胁迫对 CAT 活性的
抑制程度明显大于 Cd 胁迫显著大于 Hg 胁迫。
(4)不同类型品种幼苗叶内 CAT 活性对重金属
胁迫抑制的敏感性差异不明显。这表明 ,重金属
胁迫对水稻叶片 CAT 活性的影响主要取决于重
金属种类和浓度 ,而与品种类型关系不明显。
212 　重金属胁迫对水稻叶片 CAT 同功酶表达
的影响
上述结果表明 ,浓度范围为 0105～210mM
的重金属 Cu、Cd、Hg 胁迫对水稻叶片 CAT 活性
有显著的抑制作用。图版 ⅠA～C分别为不同浓
度的 Cu、Cd、Hg 胁迫对水稻武育粳、扬稻 6 号和
汕优 818 幼苗叶片 CAT 同功酶表达的影响。从
图 4 可看出 : (1)图 4A、4B、4C中均含有一条很
991　4 期 重金属胁迫对水稻叶片过氧化氢酶活性和同功酶表达的影响
图版 Ⅰ　重金属胁迫对水稻幼苗叶中
CAT同功酶表达的影响
(A :武育粳　B :扬稻 6 号　C:汕优 818)
Plate Ⅰ　Effect of heavy metal stress on the
catalase isozymes expression in the leaves
of rice seedling
(A :Wuyujing ; B : Yangdao 6 ; C :Shanyou 818)
0 : CK; 1 , 2 , 3 : Cu2 + 0105 , 011 , 015mM; 4 , 5 , 6 : Cd2 +
0105 ,011、015mM; 7 ,8 ,9 :Hg2 + 011 ,015、210mM
宽的电泳迁移率很小的 CAT活性带 C0 ,作者认为
C0 带所显示的 CAT 活性可能来源于酶粗提液中
未破裂的各种亚细胞器及其碎片中所含的过氧化
氢酶。从图中可看出 ,重金属胁迫对水稻各供试
品种叶片酶粗提液中未破裂的各种亚细胞器及其
碎片中过氧化氢酶的表达会产生抑制作用。抑制
程度因重金属种类和作物类型的不同而有一定的
差异 ,Cu 胁迫对水稻叶片酶粗提液中未破裂的各
种亚细胞器及其碎片中 CAT 表达的抑制程度最
大 ,其次为 Hg 胁迫、Cd 的抑制程度最小 ,但抑制
程度均随 Cu、Cd、Hg 胁迫浓度的增高而增大。粳
稻 (武育粳)和杂交稻 (汕优 818) 叶片酶粗提液中
未破裂的各种亚细胞器及其碎片中 CAT 的表达
受到 Cu、Cd、Hg 胁迫的抑制程度显著大于籼稻
(扬稻 6 号) 。(2) 图版 Ⅰ2A 的结果表明 ,正常情
况下 (即对照中)武育粳叶片中表达 2 种 CAT同功
酶 ,即图中的 C1 和 C3 带。011mM 的 Cd 胁迫显著
诱导了武育粳叶片一个新的 CAT 同功酶 (即 C2)
的表达。尽管如此 ,武育粳叶片中正常表达的
CAT同功酶明显受到 Cu、Cd、Hg 胁迫的抑制 , ≥
0105mM的 Cu 及 ≥015mM 的 Hg 胁迫使武育粳叶
片 CAT同功酶 C1 完全消失 ; ≥011mM 的 Cu、≥
0105mM的 Cd 及 ≥015mM 的 Hg 胁迫亦使武育粳叶片 CAT 同功酶 C3 完全消失。这表明武育
粳叶片 CAT同功酶 C1 对 Cu 胁迫的抑制敏感性高 ;武育粳叶片 CAT同功酶 C3 对 Cd 胁迫的抑
制敏感性高。(3)图版 Ⅰ2B 和 C 表明 ,正常情况下 (即对照中) ,籼稻 (扬稻 6 号) 和杂交稻 (汕
优 818)叶片仅表达一种 CAT同功酶 (C1) ,但 011mM 的 Cd 和 Hg 胁迫明显诱导扬稻 6 号叶片中
一个新的 CAT同功酶 (即 C01)的表达。随 Cu、Cd、Hg 胁迫浓度的增高 ,扬稻 6 号和汕优 818 叶
片中正常表达的 CAT同功酶 C1 的宽度逐步变窄 ,亮度逐步变浅。这显示 ,重金属对扬稻 6 号
和汕优 818 叶片中 CAT同功酶 C1 表达的抑制程度亦随 Cu、Cd、Hg 浓度的增高而增大。
3 　讨 　论
上述结果表明 ,尽管一定浓度的重金属 Cu、Cd 和 Hg 胁迫能诱导武育粳和扬稻 6 号叶片中
新的 CAT同功酶 (这些同功酶在对照中并未表达) 的表达 ,但浓度在 0105～210mM 的重金属
Cu、Cd、Hg 胁迫均显著抑制了正常表达的 CAT同功酶的活性 ,并且抑制程度随 Cu、Cd、Hg 浓度
的增高而增大。
重金属 Cu、Cd、Hg 胁迫导致水稻叶片 CAT同功酶活性降低的原因可能与水稻对各种生物
或非生物胁迫所产生的分子应答有关。目前一般认为 ,植物在病原微生物胁迫条件下能造成
过敏细胞的死亡 ,而这种过敏细胞的死亡与水杨酸的产生有关。且水杨酸的产生明显影响植
002 核　农　学　报 16 卷
物体内的 H2O2 水平[12 ] 。Ganesan 和 Thomas 报道 ,水稻在水杨酸胁迫条件下 ,叶内 SOD 活性未
发生明显变化 ,CAT活性则受到明显抑制 ,进而导致水稻叶片的 H2O2 积累[13 ] 。他们进一步认
为水杨酸是水稻对生物或非生物胁迫产生应答的分子信号。当水稻受到病原微生物浸染时 ,
通过水杨酸的产生 ,一方面诱导抗病蛋白的表达 ,另一方面通过对 CAT活性的抑制 ,导致 H2O2
在细胞表面的积累 ,这种细胞表达 H2O2 的积累又诱导细胞壁蛋白质的交联 ,从而使细胞壁加
厚、加强 ,进而阻止病原微生物的进一步浸染[4 ,13 ] 。和上述机制相类似 ,重金属 Cu、Cd、Hg 胁迫
也可能通过导致水稻体内水杨酸的产生 ,而致使水稻叶片 CAT 活性受到抑制。其次 ,重金属
胁迫对水稻叶片 CAT活性的抑制还可能与 Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 引起 CAT 分子构型的改变有关。
CAT是一个含 Fe3 + 的金属酶 ,进入水稻叶内的 Cu2 + 、Cd2 + 、Hg2 + 可能会取代 CAT分子中的铁离
子而使 CAT活性降低。也可能由于活性自由基的积累 ,引起 CAT 分子空间构型的改变 ,进而
导致对 CAT活性抑制的放大作用。
由图版 Ⅰ可知 ,不同类型的水稻品种其叶中所表达的 CAT同功酶的数量有差异。正常情
况下 (即对照中) ,粳稻 (武育粳)幼苗叶片有 2 种 CAT同功酶的表达 ,而籼稻 (扬稻 6 号)和杂交
稻 (汕优 818)幼苗叶片中仅有 1 种 CAT同功酶的表达。Gan 和 Scandalios (1996)认为 ,所有植物
的 CAT基因来源于一个共同的祖先基因 ,可分为 3 个个别的组。第 1 组 (主要的一组) ,包括玉
米 Catl、大麦 Catl 和水稻 CAT B 基因。第 2 组 ,为双子叶植物所特有 ,包括烟草 Cat2 和土豆 Cat
基因。第 3 组 ,为单子叶植物所特有 ,包括玉米 Cat2、大麦 Cat2 和水稻 CAT A 基因[14 ] 。Skadsen
等 (1995)通过对大麦不同部位 2 个 CAT基因 mRNA 含量的分析 ,认为大麦 Catl (和水稻 CAT B
同源) 在大麦种子胚乳中表达。大麦 Cat2 (和水稻 CAT A 同源) 主要在大麦幼苗芽和叶中表
达[15 ] 。综上可认为 ,正常情况下水稻中主要存在 2 种不同的 CAT同功酶 ,分别应是 CAT A 和
CAT B 基因的表达产物。本文电泳图片中粳稻的 C1 和 C3 可能分别相当于 CAT A 和 CAT B 基
因的表达产物 ,而籼稻和杂交稻叶中的 CAT 同功酶 C1 可能相当于 CAT A 基因的表达产物。
很显然 CAT B 基因在籼稻和杂交稻叶中没有表达。显然 ,水稻 CAT A 和 CAT B 基因的表达均
受到重金属 Cu、Cd、Hg 胁迫的抑制 ,但其抑制程度因作物类型和重金属种类的不同而有所不
同。至于 011mM 的 Cd 胁迫所诱导的粳稻 (武育粳) 幼苗叶片 CAT 同功酶 C2 ,011mM 的 Cd 和
Hg 胁迫所诱导的籼稻 (扬稻 6 号)幼苗叶片 CAT同功酶 C01 ,来源于何种 CAT基因的表达 ,还
有待于进一步研究。
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EFFECT OF HEAVY METAL STRESS ON THE CATALASE ACTIVITY AND
EXPRESSION OF ISOZYMES IN THE LEAVES OF RICE SEEDLING
GE Cai2lin1 　YANG Xiao2yong1 　ZHU Hong2xia1 　SUN Jin2he2
WANG Ze2gang1 　LUO Shi2shi1 　MA Fei1
(11Agricultural College , Yangzhou University , Yangzhou , Jiangsu prov. 　225009 ;
21 Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310029)
ABSTRACT:The effect of heavy metal stress on the catalase ( CAT) acivity and expression of
isozymes in the leaves of rice( Wuyujing ,Yangdao 6、Shanyou 818) seedling was measured and an2
alyzed. The results showed as follows. ( 1) When the concentration of Cu , Cd and Hg was in the
range of 0105～210mM ,the CAT activity decreased continuously with the concentration of Cu and
Cd increasing. However , with the concentration of Hg increasing the CAT activity rapidly de2
creased first ,and then increased slightly ,and again decreased obviously , indicating that the Cu , Cd
and Hg of 0105～210mM inhibited the CAT activity in the leaves of rice seedling. ( 2) The results
by using polyacrylamide concentration gradient gel electrophoresis technique to analyze the CAT
isozymes indicated that ,on the normal condition ,there were 1 to 2 CAT isozymes being expressed
in the rice leaves( 2 CAT isozymes being expressed in Wuyujing leaves , 1 CAT isozymes in Yangd2
ao 6 and Shanyou 818 leaves) . 011mM Cd stress induced Wuyujing leaves to express 1 new CAT
isozymes, 011mM Cd and Hg stress also induced Yangdao 6 leaves to express 1 new CAT
isozymes , but the expression of CAT isozymes , which were expressed in normal condition , were in2
hibited by Cu , Cd and Hg stress.
Key words :heavy metal ; rice ; catalase
202 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (4) :197～202