全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022165204
固氮斯氏假单胞菌 dctB 基因在大肠杆菌
中异源表达的研究
李红权1 　平淑珍2 　何　升2 　陈　明2 　林　敏2
(11 河北大学生命科学学院 , 河北 保定　071002 ; 21 中国农业科学院生物技术研究所 , 北京　100081)
摘 　要 :固氮斯氏假单胞菌 dctB 基因编码一个二元调控系统的感应蛋白 DctB ,该蛋白可以感应环境中四
碳二羧酸的存在 ,通过磷酸化激活转录因子 DctD ,启动四碳二羧酸转运结构基因的转录 ,为生物固氮过
程提供能量。本研究通过克隆 dctB 基因并实现了其在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中的过量表达 ,经 IPTG诱
导 8h 后 DctB 的表达量达到最高。该研究为进一步纯化 DctB 蛋白 ,深入研究该蛋白的功能与性质奠定
了基础。
关键词 :斯氏假单胞菌 ; dctB ; 蛋白表达
OVEREXPRESSION OF Pseudomonas stutzeri dctB gene in E. coli BL21( DE3)
LI Hong2quan1 　PING Shu2zhen2 　HE Sheng2 　CHEN Ming 　LIN Min2
(11Life Science College , Hebei University , Baoding , Hebei 　071002 ;
21 Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agriculture Sciences , Beijing 　100081)
Abstract : dctB gene of Pseudomonas stutzerien codes a two component system sensor named DctB. DctB is a sensor of C42
dicarboxylate , which could activite transcription factor DctD through phosphorylation. DctB were overexpressed in E. coli
BL21 (DE3) in this study. The fragment of dctB gene was ligased into vector pET28a and then transferred into E. coli BL211
The maximum expression amount of DctB was detected after 8h induced.
Key words : Pseudomonas stutzeri ; dctB ; protein express
收稿日期 :2007205218 　接受日期 :2007208210
基金项目 :河北大学博士基金 ( Y2006059) 和河北大学医学部科研基金 (2007Z02) ,河北省自然科学基金 ( C2007000188) ,和国家“863”计划
(2006AA020202)
作者简介 :李红权 (19682) ,男 ,河北保定人 ,博士 ,副教授 ,主要从事微生物分子生物学研究 ;
平淑珍 (19552 )女 ,河北高邑人 ,硕士 ,副研究员 ,主要从事固氮微生物研究。李红权与平淑珍对本文有同等贡献。
通讯作者 :林　敏 (19642) ,男 ,四川简阳人 ,博士 ,研究员 ,主要从事环境微生物基因工程的研究。Tel : 010268919861 ; E2mail :linmin57 @vip . 1631com　　四碳二羧酸运输系统 ( C42dicarxylate transportsystem ,dct) 是固氮菌固氮过程中的能量运输系统 ,它将植物根系分泌的四碳二羧酸运入细胞内以维持细胞的基础代谢并进行生物固氮[1 ] 。dctB 基因编码一个二元调控系统的感应蛋白 DctB ,该蛋白可以感应环境中四碳二羧酸的存在 ,通过磷酸化激活转录因子 DctD ,启动四碳二羧酸转运结构基因的转录 ,为生物固氮过程提供能量[2 ] 。Brkenhead K 等[2 ] 的研究表明在共生固氮菌中通过引入额外拷贝 dct 基因提高了四碳二羧 酸流入类菌体的速率 ,从而增强了共生固氮菌的固氮能力。斯氏假单胞菌 ( Pseudomonas stutzeri) A1501 是 1株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌 ,具有固氮和分泌植物激素等优良特性[3 ] 。已有试验证明将四碳二羧酸运输系统的调节基因和结构基因引入联合固氮的斯氏假单胞菌 ,可以提高联合固氮菌的固氮效率[4 ] 。斯氏假单胞菌 A1501 的 dctB 基因已经通过筛选基因文库的方法得到克隆 ,其 Genbank 登录号为AJ313422 , dctB 基因对于四碳二羧酸等能量物质的转运具有重要功能 ,有研究表明该基因发生突变使琥珀
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酸、延胡索酸等四碳二羧酸的转运能力丧失[4 ] 。本研究
通过生物信息学方法对斯氏假单胞菌 DctB 的结构域进
行了分析 ,通过 PCR 扩赠 dctB 基因并将其克隆到表达
载体 pET28a ,转化大肠杆菌 BL21 (DE3) ,从而实现了其
在大肠杆菌中的异源表达。为进一步纯化 DctB 蛋白 ,
深入研究该蛋白的功能与性质奠定了基础。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　菌株与质粒　本研究所用菌株与质粒见表 1。
表 1 　菌株和质粒
Table 1 　Strains and plasmids
菌株与质粒
srtain and
plasmid
特性
characteristics
来源
source
E. coli JM109
recA1 supE44 endA1 hsdR17
gyrA96 relA1 thiΔ( lac2proAB)
F ’ [ traD36 proAB +
lacIqlacZΔM15 ]
本实验室
this lab
Pseudomonas
stutzeri A1501 野生型 wild type
丘元盛等[3 ]
Qiu yuansheng et
al
E. coli BL21
(DE3)
原核表达宿主菌
host bacterium of pET28a
Novagen 公司
C21 Ap r , pBS 载体上携带 P. stutzeriA1501 dctBDPQM 基 因 914kbXhoI 的片段
pBS carrying 914kb dctBDPQM
fragment of P. stutzeri A1501
本实验室 this lab
p GEM2T easy Ap r Promega 公司
pET28a
原核表达载体
expression vector of prokaryotic cell
Novagen 公司
pEB
pET28a 载体上携带 P. stutzeri
A1501 113kb 的 dctB 基因
pET28a carrying 113kb dctB gene of
P. stutzeri A1501
本研究 this study
11112 　培养基与试剂 　A15 培养基[2 ] 用于斯氏假单
胞菌的培养 ,LB 培养基用于大肠杆菌 ( E. coli ) 的培
养。DNA 片段回收采用 QIAEXII Agarose Gel Extraction
Kit ,限制性内切酶购于 Promega 公司 ,化学试剂购于北
京化学试剂公司。
11113 　PCR 引物 　扩增 dctB 基因的引物为 : dctBF :
5’ATGGATCCATGACCGCACTTCTCGCT 3’; dctBR : 5’
CAGAATTCTCATTGGAAA TGGTCCTC 3’,引物合成与序
列测定由奥科生物技术有限公司承担。利用此引物进
行 dctB 基因片断的 PCR 扩增 ,退火温度 55 ℃。
112 　方法
11211 　细菌培养　斯氏假单胞菌用 A15 培养基 30 ℃
振荡培养过夜 ,大肠杆菌用 LB 培养基 37 ℃振荡培养
过夜。A15 和LB 培养基中分别加入氨卡青霉素和卡
那霉素的终浓度为 100μgΠml 和 50μgΠml。
11212 　DNA 与质粒的提取、限制性内切酶酶切及 T4
连接酶连接 　DNA 提取、质粒提取、限制性内切酶酶
切、T4 连接酶连接等分子操作均按文献 [ 5 ]所述进行。
用 SDS2蛋白酶 K裂解 P. stutzeri A1501 ,十六烷基三甲
基溴化铵 (CTAB)沉淀细胞碎片和多糖 ,然后用异丙醇
沉淀来提取总 DNA ,得到的 DNA 作为 PCR 扩增 dctB
基因的模板。碱裂解法提取 pET28a 的质粒 DNA ,用
EcoRI , BamHI 酶切并纯化 pET28a 质粒 DNA 与 PCR 扩
增得到的 dctB 基因片断。用 T4 连接酶连接 pET28a
与 dctB 的酶切片断。连接产物用于转化大肠杆菌
BL21 (DE3)
11213 　感受态细胞的制备及细菌的电激转化　挑取
LB 固体培养基上 E. coli 的新鲜单菌落 ,接种于 20ml
LB 液体培养基中 ,37 ℃220rΠmin 振荡培养 ,使菌液 OD
值达到 015～016 ,冰上冷却培养物。将菌液转入灭菌
离心管 ,4 ℃2700g 收集菌体 ,去上清。加入 20ml 预冷
的 10 %甘油 ,置于冰上 ,轻轻颠倒离心管 ,使菌体悬
浮。4 ℃2700g 收集菌体 ,去上清 ,在吸水纸上倒置控
干。加入 10ml 的预冷 10 %甘油 ,轻摇离心管 ,将菌体
悬浮 ,3 次重复 ,加入 200μl 的预冷 10 %甘油 ,悬浮菌
体 ,分装 (50μlΠ115ml 离心管) 后液氮速冻 ,置 - 70 ℃保
存备用。以上所有步骤均在冰浴条件下操作。取两管
E. coli JM109 感受态细胞 (50μl)于冰上融化。分别加
入 1～2μl 含 dctB 的重组质粒或空载体质粒 ,轻轻混
匀 ,置于冰上约 1min 。设置电击程序 (pre2set protocol2
E. coli) :将混合液转入预冷的 012cm 电击杯中 ,放入电
击池 ,电击 ( Pulse) 。取出电击杯 ,立即加入 1ml LB 培
养基 ,轻轻混匀。将菌液转移到预冷的 115ml 离心管
中 ,225rΠmin , 37 ℃培养 1h。记录电击参数 ,时间常数
必须接近 5s。培养菌液涂布到含 Kan 的 LB 平板上 ,
碱法提取质粒并进行酶切鉴定筛选转化子。
11214 　DctB 的诱导表达及 SDS2PAGE 分析 　将筛选
获得的阳性重组质粒 pEB ,挑取单菌落接种于 3ml 含
Kan 的LB 液体培养基中 ,于 37 ℃过夜培养活化后 ,按
1∶100 稀释加入到 6ml 含 Kan 的 LB 液体培养基中 ,振
荡培养至 OD600 值为 016 , 加入 IPTG 至终浓度为
0175mmolΠL ,继续于 20 ℃摇床培养 ,以含 pET28a 空载
体的大肠杆菌 BL21 (DE3) 为对照。经煮沸裂解菌体 ,
离心 ,取上清液 ,用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋
白表达情况。SDS 聚丙烯酰胺凝胶的制备参照《蛋白
质技术手册》进行[6 ] ,将制备好的 10 %的分离胶和 5 %
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的浓缩胶先后加入安装固定好的模具中。在加入分离
胶后 ,加少许水以利于胶面平齐 ,络合 30min ,用滤纸
吸干胶面上的水层后加入浓缩胶 ,插上梳子 ,络合约
1h。将灌好的胶板连同支架放入电泳槽中 ,中间电泳
槽加入的电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板 ,将梳
子拔出。将蛋白样点入点样孔 ,设置稳流状态电流约
20mA ,电泳 2h 至溴酚兰到达底部。拆开玻璃板 ,剥离
凝胶 ,并放入考马斯亮蓝染色液中染色 5 - 6h 或者更
长时间。将染色后的凝胶转入脱色液中脱色 1h ,期间
换脱色液 3～4 次。。
11215 　DctB 的结构域分析 　使用 Protein Families
Database of Alignment and HMMS(pfam @sanger. ac. uk)对
DctB 的结构域进行分析。利用 PRED2TMR (Version
110) ( http :ΠΠo21db. uoa. grΠPRED2TMRΠ) 跨膜蛋白结构
预测软件对固氮斯氏假单胞菌 A1501 的 DctB 蛋白氨
基酸序列进行跨膜结构域分析。
2 　结果与分析
211 　DctB 蛋白的结构域分析结果
使用 Protein Families Database of Alignment and
HMMS(pfam @sanger. ac. uk) 对 DctB 的结构域进行分
析 ,结果表明 ,DctB 含有组氨酸激酶 A 结构域 (386aa～
436aa) , 组氨酸激酶结构域 ( 478aa ～ 588aa ) 。利用
PRED2TMR ( Version 110) ( http :ΠΠo21db. uoa. grΠPRED2
TMRΠ)跨膜蛋白结构预测软件对固氮斯氏假单胞菌
A1501 的 DctB 蛋白氨基酸序列进行结构预测的结果
表明 :DctB 含有两个跨膜结构域 (15aa～35aa) 、(283aa
～300aa) 。这种结构可能与该蛋白在膜外的部分能够
感应环境中四碳二羧酸的变化 ,从而使得膜内的部分
通过磷酸化激活四碳二羧酸转运蛋白的转录有关。
212 　dctB 基因表达载体的构建
以斯氏假单胞菌 A1501 的总 DNA 为模板对 dctB
基因进行 PCR 扩增 , 得到 118kb 的基因片段。用
EcoRI ,BamHI 酶切 ,回收该 DNA 片段 ,与用 EcoRI ,
BamHI酶切并回收纯化的 pET28a 连接 ,连接产物转化
E. coli JM109 ,在含有 Kan 的 LB 平皿上筛选重组子 ,
提取质粒 ,得到重组质粒 pEB ,进行酶切验证 ,得到的
酶切片断大小与 dctB 基因片断大小一致 (图 1) 。经过
与 P. stutzeriA1501 dctB ( Genebank 登录号 :AJ313422)
的 DNA 序列进行比对 ,重组质粒 pEB 所携带片断的
DNA 序列与 dctB 的基因序列完全一致 ,并已正确插入
至 pET28a 的 BamHI , EcoRI 的两个酶切位点之间 (图
2) ,这就保证了 DctB 蛋白的正确表达。
图 1 　pEB 的酶切鉴定
Fig. 1 　Identifiction of pEB by restriction digestion
1 :λDNA HindIIIΠEcoRI marker ;
2 :pEB EcoRIΠBamHI 酶切 ; 3 :pEB 质粒
1 :λDNA HindIIIΠEcoRI marker ;2 :pEB digested by
EcoRIΠBamHI ;3 :Plasmid pEB
213 　DctB 蛋白的诱导表达
用 pEB 转化 E. coli BL21 (DE3) , IPTG诱导表达 ,
用 SDS2PAGE 检测蛋白表达情况 ,结果表明诱导 8h 后
dctB 的表达量最高。dctB 表达的蛋白的相对分子量
为 66kD , 略高于理论推算值 62kD ,原因是由于表达蛋
白带有部分载体序列 (His2Tag) ,结果如图 3 所示。
图 3 　表达载体 pEB 的诱导表达
Fig. 3 　Inducible expression of pEB in E. coli
M:蛋白 marker ;1 :诱导 8h ;2 :诱导 4h ;3 :空载体诱导 8h
M:protein marker ;1 : induced 8h ;2 :induced 4h ;
3 :pET28a Vector induced 8h
3 　讨论
大肠杆菌表达系统是目前最常见的原核表达系
统。由于其遗传背景清楚 ,容易培养 ,能大规模地发
酵 ,还有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体 ,使
之成为克隆和表达外源基因的首选菌株。融合表达不
仅可以使外源基因高效表达 ,并且具有减少蛋白酶的
761　2 期 固氮斯氏假单胞菌 dctB 基因在大肠杆菌中异源表达的研究
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图 2 　固氮斯氏假单胞菌 A1501 dctB 基因的核苷酸序列
Fig. 2 　Nucleotide sequence of dctB genes from Pseudomonas stutzeri A1501
降解、纯化方法简单、特异性强等优点。Linda Giblin 等
曾利用大肠杆菌表达系统对共生固氮菌的 DctB 蛋白
成功地进行表达[7 ,8 ] ,但对联合固氮菌 DctB 的蛋白表
达研究未见报道。对联合固氮菌能量转运系统中感应
蛋白 DctB 的研究对进一步揭示联合固氮菌四碳二羧
酸转运机理 ,提高固氮效率具有重要意义。本研究利
用大肠杆菌的表达载体 pET28a ,实现了 P. stutzeri
A1501 DctB 蛋白在大肠杆菌中的异源表达 ,并优化了
表达条件。为进一步纯化 DctB 蛋白 ,深入研究 DctB
蛋白的表达调控机制奠定了基础。
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(下转第 164 页)
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百分率最高 ,与苹果遗传转化上的报道相同[14 ,24 ] 。
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