全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062482204
菊苣高效不定芽直接发生及其植株再生
韩晓玲 王玉华 李红民 郝建国 贾敬芬
(西北大学生命科学学院 ,陕西 西安 710069)
摘 要 :本研究以菊苣无菌苗叶片为外植体 ,建立了高效不定芽直接发生及其植株再生体系。在附加不
同浓度N262benzyladenine (62BA)或与低浓度α2naphthaleneacetic acid (NAA)组合的MS 培养基上 ,5～7d 外
植体表面不经过愈伤组织诱导阶段 ,直接形成不定芽。组织学观察表明 ,不定芽起源于叶片维管束薄壁
细胞 ,且其微管组织系统与叶片外植体内微管组织系统紧密相连。62BA 是不定芽直接发生所必需的 ,
外植体的发育时期、取材部位和培养基蔗糖浓度对不定芽直接发生有重要影响。在附加 210mgΠL 62BA ,
015mgΠL NAA ,100mgΠL Vc ,100mgΠL VB1 ,300mgΠL 脯氨酸和 40gΠL 蔗糖的 MS 培养基上 ,培养 20d 龄基部
叶片 15d 时 ,不定芽直接发生频率最高为 100 % ,每块外植体上产生的不定芽数量也最多 ,平均为 36～38
个。在 1Π2 MS + IBA 015mgΠL 培养基上 ,再生苗诱导生根频率为 97158 % ,再生植株移栽于盆土中 ,100 %
存活且生长良好 ,未见形态异常。
关键词 :菊苣 ; 组织培养 ; 不定芽直接发生 ; 植株再生
AN EFFICIENT PLANT REGENERATION SYSTEM VIA DIRECT
ADVENTITIOUS BUD FORMATION IN CHICORY
HAN Xiao2ling WANG Yu2hua LI Hong2min HAO Jian2guo J IA Jing2fen
( College of Life Science , Northwest University , Xian , Shaanxi 710069)
Abstract :An efficient plant regeneration system through direct adventitious bud formation is established using leaf segments of
asepsis seedlings of chicory ( Cichorium intybus L. ) . After 5～7d of culture , adventitious buds appeared directly from
explants without any intervening callus on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with different concentrations of N2
62benzyladenine ( BA ) alone or together with 015mgΠL α2naphthaleneacetic acid ( NAA ) . According to histological
observations , adventitious buds were originated from thin wall cell of vascular bundle of the leafs , and the vascular bundle
systems of adventitious buds are closely connected with that of leaf explant . 62BA was necessary for direct adventitious bud
formation. The frequency and number of adventitious bud formation were strongly influenced by the development stage of
explants and sucrose concentration. After 15 days culture , the 100 % frequency of bud formation as well as an average of 36～
38 adventitious buds per explant were obtained on MS medium supplemented with 210mgΠL 62BA ,015mgΠL NAA ,100mgΠL
Vc ,100mgΠL VB1 ,300mgΠL proline and 40 gΠL sucrose using 202day2old leaves. When transplanted and cultured for about 10d
on the 1Π2 MS medium added 015mgΠL indole232butyric acid ( IBA) , 97158 % rooting frequency was obtained. Plantlets grew
well and appeared normal with no mortality after transfer to soil .
Key words :chicory ; tissue culture ; direct adventitious bud formation ; plant regeneration
收稿日期 :2005212216
基金项目 :陕西省自然科学基金项目 (2003C108)和省重点实验室重点项目 (05JS48)
作者简介 :韩晓玲 (19632) ,女 ,陕西临潼人 ,副研究员 ,主要从事植物细胞工程和基因工程研究。Tel : 13343471807 ; Emai :hanxl123 @126. com。贾敬
芬为通讯作者 ,Tel :029 88303484 ,13379224716 ; Emai : Jia J f 38 @nwu. edu. cn
284 核 农 学 报 2006 ,20 (6) :482～485Journal of Nuclear Agricultural Sciences
菊苣 (Chicory , Cichorium intybus . L) 为菊科菊苣属
多年生草本 , 既是高产优质的牧草[1 ] ,又是新兴的高
档特色蔬菜 ,并且菊苣含有菊糖、马栗树皮素、马栗树
皮甙、野莴苣甙、山莴苣素和山莴苣苦素等特殊成分 ,
可药用 ,具有防治黄胆性肝炎、心血管疾病和骨质疏松
症等功效[2 , 3 ] 。近年来已有一些有关菊苣组织培养的
报道[4～6 ] ,但都是通过间接的器官发生途径再生植株 ,
即外植体脱分化产生愈伤组织 ,愈伤组织再分化成不
定芽 ,最后不定芽生根成苗。此法培养周期长 ,程序复
杂 ,植株再生频率低 ,易发生变异。本文以菊苣叶片为
外植体 ,通过不定芽直接发生途径 ,旨在建立高效离体
植株再生体系 ,为菊苣快速扩繁和利用生物技术对其
进行遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
111 无菌实生苗的产生
菊苣种子由陕西省农业科学院牧草研究所提供 ,
品种为普那。种子用自来水冲洗 ,70 %乙醇浸摇 30s ,
011 % HgCl2 表面消毒 10min ,无菌水冲洗 6 次 ,接种于
无生长调节剂的 MS[7 ] 培养基上。每日光照 16h ,光照
强度 2000lx ,培养温度 25 ℃±2 ℃。
112 外植体不定芽的直接诱导
将 10、15、20、25、30d 龄菊苣无菌苗叶片切成叶
柄、叶片基部和叶片顶部 3 部分 ,分别接种在附加
210mgΠL 62BA、015mgΠL NAA、100mgΠL Vc、100mgΠL VB1 ,
300mgΠL 脯氨酸和 40gΠL 蔗糖的 MS 培养基上 , 琼脂含
量为 0168 % ,pH 值调整至 518～612 ,培养温度为 25 ℃
±2 ℃,2500lx 光照培养。同时将 20d 龄无菌苗叶片接
种在含不同激素配比的 MS 培养基上 (表 2) 或 MS + 62
BA 210mgΠL + NAA 015mgΠL + Vc 100mgΠL + VB1 100mgΠL
+ 脯氨酸 300mgΠL 的培养基上 ,以比较激素和不同蔗
糖浓度 (0～50gΠL) 对不定芽直接发生的影响。培养
15d 后观察统计外植体上直接发生不定芽的数量和频
率。不定芽直接形成频率 = (直接形成芽的外植体数Π
接种的外植体数) ×100 %。
113 再生苗的生根、炼苗与移栽
将生长高度 3cm 以上的再生苗从外植体上切下 ,
培养于附加 0～110mgΠL 吲哚丁酸 ( IBA)的 MS 或1Π2MS
培养基上 ,当幼苗产生 3～5 条发达的根系后 ,移去封
口膜 ,敞开瓶盖 ,炼苗 4d , 选取生长健壮的再生植株 ,
洗净根部残留的培养基 ,移栽于塑料盆钵中 ,自然光下
保湿培养。
114 组织学观察
培养 15d 的外植体于 Olympus 实体解剖镜下观察 ,
选取理想的组织切块照相 ,然后用 FAA 固定液固定 24h
后 ,石蜡包埋 ,使用LEICARN2135 型切片机切片 ,厚度为
9μm ,切片按常规方法处理 ,番红—固绿对染 ,加拿大树
胶封片 ,Olympus BX50 型显微镜下观察照相。
2 结果
211 叶片外植体不定芽的直接发生及组织学观察
10～30d 龄无菌苗叶片 ,接种在含有 62BA 或 62BA
与低浓度 NAA 组合的 MS + Vc 100mgΠL + VB1 100mgΠL
+ 脯氨酸 300mgΠL + 蔗糖 40gΠL 培养基上 ,培养 5～7d
后 ,在外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽
芽点 ,15d 后 ,芽点进一步发育成不定芽 ,芽的形成有
单生 (图 12A ) 和簇生 (图 12B、C) 两种方式 ,这些不定
芽的发生具有共同的特征 ,即均从外植体上直接产生 ,
未经愈伤组织诱导阶段 ,也未见其周围有任何愈伤组
织形成。组织学观察表明 ,不定芽起源于叶片外植体
图 1 菊苣叶片不定芽直接发生的形态学和组织学观察
Fig. 1 Morphological and histological observation of direct adventitious bud formation of
leaf explant of chicory ( C. intybus L. )
A ,B 不定芽直接从叶片切块表面发生 ;C ,大量不定芽直接从叶片外植体切口处发生 ;D ,不定芽从叶外植体直接发生的组织切片 ,显示不定芽与叶
外植体之间的微管组织系统密切相连。
A , B Adventitious buds directly arising from a leaf segment surface ; C , Numerous adventitious buds directly induced from wounded parts of a leaf explant ; D ,
Histological section of adventitious buds directly originated from thin wall cells of vascular bundle of the leaf segment , showing the tight connection of vascular systems
between adventitious buds and leaf explant .
384 6 期 菊苣高效不定芽直接发生及其植株再生
维管束的薄壁细胞 ,且其微管组织系统与叶片外植体
的微管组织紧密相连 (图 12D) ,这与体细胞胚胎所具
有的独立的微管系统明显不同。
212 叶片年龄对菊苣不定芽直接发生的影响
将发芽 10～30d 龄的无菌苗叶片 ,接种在 MS + 62
BA 210mgΠL + NAA 015mgΠL + Vc 100mgΠL + VB1 100mgΠL
+ 脯氨酸 300mgΠL + 蔗糖 40gΠL 的培养基上 ,15d 后统
计外植体上直接产生的不定芽数。结果如图 2 所示 ,
叶片发育年龄对菊苣体细胞器官直接发生有明显的影
响。较幼嫩的叶片易诱导产生愈伤组织 ,很少有不定
芽的直接发生 ,而发育年龄较大的外植体 ,细胞分化程
度较高且褐化严重 ,也不利于不定芽的直接形成 ,只有
发育时期适中 ,如 20d 龄的叶片 ,方可高频率 (100 %)
直接产生不定芽 ,而且不定芽形成速度快 ,接种 6～7d
即有不定芽发生 ,繁殖系数高 ,每块外植体上形成的芽
数平均高达 38175 个。
图 2 叶片发育年龄对菊苣不定芽器官直接发生的影响
Fig. 2 Effect of leaf development stage on direct
adventitious bud formation of chicory
213 外植体类型对菊苣不定芽直接发生的影响
将 20d 龄无菌苗叶柄和叶片分别培养在 MS + 62
BA 210mgΠL + NAA 015mgΠL + Vc 100mgΠL + VB1 100mgΠL
+ 脯氨酸 300mgΠL + 蔗糖 40gΠL 的培养基上 ,培养 5～
7d ,可在外植体上观察到不定芽直接发生。15d 后统
计结果 (表 1)表明 :叶柄、叶片基端和叶片顶端均能直
接产生不定芽 ,而且不定芽形成频率均为 100 % ,但是
每块外植体上产生不定芽的数量却显著不同 ,其中叶
片基部最多 ,每块外植体上形成的芽数平均为 36108
个 ,顶部次之 ,叶柄最少 ,为 18142 个。
214 62BA和 NAA 浓度及其配比对菊苣不定芽直接
发生的影响
表 2 为 20d 龄无菌苗叶片在含有不同激素组合的
MS + Vc100mgΠL + VB1100mgΠL + 脯氨酸 300mgΠL + 蔗糖
40gΠL 培养基上培养 15d 的统计结果。在无外源激素
的“J1”培养基和仅含有 NAA 的“J2”培养基上 ,叶片表
面不能直接发生不定芽 ,但在含有 62BA 的培养基“J3
～J11”上 ,均有不定芽的直接形成。不定芽发生频率
随着 62BA 浓度的增加而递增 ,用激动素 KT替代 62BA
亦有类似的效果 ,可见 ,62BA 或 KT是菊苣直接不定芽
发生所必需的激素。当 62BA 浓度为 210mgΠL 时 ,添加
低浓度的 NAA (015mgΠL) 对不定芽发生频率有一定的
促进作用 (J9) ,而较高浓度 NAA 易诱导愈伤组织 ,不
利于不定芽的直接发生。
表 1 外植体类型对菊苣不定芽直接发生的影响
Table 1 Effect of explant type on direct adventitious
bud formation of chicory
外植体类型
kinds of
explants
接种外植体数
No. of explants
incubated
直接发生芽
频率 ( %)
frequency of direct
shoot formation
每块外植体
繁殖芽数
No. of proliferated
shoots per explant
叶片基部
leaf basal part
70 100 36108 ±31048a
叶片顶部
leaf apical part
68 100 27194 ±21367b
叶柄
petiole
70 100 18142 ±21013c
注 :表中数据为四次重复平均值±标准误差 ;数值后的不同字母表示差
异显著性 ( P < 0101) . 下表同。
Note :date in table represent mean ±S. E. of four replicates , values followed by
different letters are significantly different ( P < 0101) . The same as following
table.
表 2 植物激素对菊苣不定芽直接发生的影响
Table 2 Effect of the different phytohormones on
direct adventitious bud Formation of chicory
培养基编号
No. of media
外源激素
phytohormone
(mgΠL)
62BA NAA 接种外植体数No. of explantsinoculated 芽直接发生频率direct shootformation frequencyΠ%
J1 010 010 48 010a
J2 010 110 50 010a
J3 015 010 50 22 ±2150b
J4 015 015 49 29145 ±1150c
J5 110 010 49 5215 ±4160 d
J6 110 015 50 65 ±3125e
J7 115 015 50 88 ±4155f
J8 210 010 49 9613 ±3145g
J9 210 015 50 100 ±0100g
J10 210 110 50 84 ±4175f
J11 210 210 50 6715 ±5125e
215 蔗糖浓度对菊苣不定芽直接发生的影响
图 3 结果表明 ,蔗糖对菊苣叶片不定芽直接发生
484 核 农 学 报 20 卷
有重要的影响。在无蔗糖的培养基上 ,叶片切块几乎
不产生不定芽 ,而在含有蔗糖的培养基上均能直接形
成不定芽 ,随着蔗糖浓度的升高 ,外植体上不定芽产生
的数量和频率也随之增加 ,当培养基中蔗糖浓度为
40gΠL 时 ,不定芽的发生频率最高 (100 %) ,每块外植体
上形成的芽数也最多 ,平均为 3615 个。可见较高浓度
的蔗糖能有效提高不定芽的直接发生频率 ,这可能与
高浓度蔗糖所产生的渗透胁迫作用有关。
图 3 蔗糖浓度对菊苣体细胞不定芽器官直接发生的影响
Fig. 3 Effect of sucrose concentration on direct
adventitious bud formation in chicory
216 培养基种类和吲哚丁酸( IBA) 对菊苣再生苗生
根的影响
不定芽形成的再生苗在附加不同浓度 IBA 的 MS
或 1Π2MS 培养基上 8～10d 后产生不定根。14d 后统计
生根情况 ,结果见图 4。培养基种类对再生苗生根有
一定影响 ,高盐浓度 MS 培养基不利于根的形成 ,而盐
浓度减半的 1Π2MS 培养基比较适合菊苣再生苗的生根
培养。
菊苣生根比较困难 ,在无 IBA 的 MS 或 1Π2MS 培
养基上根诱导率较低 ,低浓度 IBA 对菊苣再生苗生根
具有明显的促进作用 ,其中 1Π2MS + IBA 015mgΠL 培养
基最适合生根 ,诱导频率达 97158 % ,而较高浓度 IBA
对根的形成有不利的影响。
217 炼苗与移栽
将生根培养基上生长 20d 左右 ,根系发达 ,生长健
壮的小苗 ,敞开瓶盖炼苗 ,然后移栽于盆土中 ,再生植
株成活率为 100 % ,生长良好 ,未见形态异常。
3 讨论
大量实验证明 ,外植体的生理状态和发育程度是
影响植物组织培养的重要因素 ,生理代谢旺盛而分化
图 4 培养基种类和 IBA 浓度对菊苣再生苗生根的影响
Fig. 4 Effect of medium type and IBA concentration on
root regeneration of adventitious buds of chicory
程度较低的外植体有利于愈伤组织诱导及器官分化。
本试验中 ,不同发育年龄的菊苣叶片及其不同部位 ,不
定芽直接发生的情况却有所不同 ,可能与外植体内源
激素水平及生理状态不同有关[8 ] 。另外组培基因型对
不定芽高效再生具有非常重要的影响 ,本文虽然未对
不同基因型进行优化试验 ,但从本试验如此高效的不
定芽再生结果不难看出 ,本试验所用品种普那是非常
适合离体组织培养的。
62BA 和 NAA 不同浓度组合及配比 ,控制着菊苣
叶片细胞的分化和形态建成。当培养基中 NAA 使用
浓度大于 62BA 时 ,外植体脱分化形成愈伤组织 ;当两
者用量相当时 ,叶片表面直接发生大量体细胞胚胎 ,同
时在切口处诱导产生胚性愈伤组织 (另文报道) ;而在
仅有 62BA 或 62BA 与低浓度 NAA 组合的培养基上 ,方
能直接分化不定芽。表明菊苣叶片对外源激素比较敏
感。
菊苣组织培养国内外已有一些报道 , 但都是通过
间接的器官发生途径再生植株[4～ 6 ] 。有关菊苣不定芽
直接发生及其组织学观察的研究尚未见报道。本文以
菊苣叶片为外植体 , 优化了不定芽直接发生的条件。
组织学观察表明 ,不定芽起源于维管束的薄壁细胞 ,且
其微管组织系统与叶片外植体的微管组织系统连接紧
密。在优化的培养基上培养 15d 后 ,不经愈伤组织诱
导阶段 ,直接产生大量不定芽 (每块外植体平均产生
36～38 个) ,35～40d 内即可再生完整植株 ,缩短了培
养周期 ,简化了培养程序 ,提高了植株再生频率和繁殖
系数 ,为菊苣快速繁殖提供了一条经济有效途径 ,并在
利用生物技术改良菊苣品质方面具有重要意义。
参考文献 :
(下转第 459 页)
584Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (6) :482～485
并且重复性好 ,与阳性对照之间的相关性不太强。原
因可能是经过离子束的介导作用之后 ,水稻的基因组
发生了一些变化 ,整合了玉米 DNA 片段 ,至于片段大
小 ,还有待进一步对差异条带进行回收 ,取得确凿证
据。
3 讨论
低能离子束介导转基因技术是创建于我国的一种
新的物理遗传转化技术 ,已成功地将目的基因导入水
稻获得状基因植株[16 ] 。借助离子束介导等方法转移
活性裸露 DNA 大分子已成为当前基因工程研究的热
点。这可能由于低能离子不仅在细胞的表面造成可修
复的机械损伤成为外源 DNA 进入细胞内的通道 ,而且
正电离子与靶细胞的电荷交换使微孔通道积累正电
荷 ,能吸引带负电荷的外源 DNA 分子进入细胞 ,同时
离子束的动量、能量效应造成细胞内基因组 DNA 可修
复的损伤 ,增加了外源 DNA 重组和插入细胞基因的几
率 ,引起后代更为广泛的变异 ,为育种工作提供了更为
丰富的种质资源。
通过离子束介导玉米基因组 DNA 转入水稻 ,对获
得的变异株进行生理生化指标的测定结果表明 ,变异
株有可能整合了玉米的基因片段 ,不同程度地表现出
供体的性状。对变异株的 AFLP 扩增结果进行分析 ,
扩增条带与阴性对照相似率很高 ,而与玉米的相似率
很低 ,说明外源 DNA 导入植物后 ,后代的基因组结构
与 DNA 受体高度相似 ,这与动物材料的试验结果一
致[15 ] 。经离子束介导获得的变异株扩增条带与阴性
对照存在明显的差异条带 ,出现了新增带、缺失带、增
强带和减弱带等 ,这些差异带提示外源 DNA 可能已经
整合到受体的基因组中 ,同时为进一步寻找转基因的
分子证据提供了帮助。
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