全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):518 ～ 521
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0518-04
秋水仙素诱导杂交兰四倍体及倍性鉴定
尹翠翠 张 燕 张景华 陈瑶瑶 王广东
(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)
摘 要:以杂交兰 F1 代无菌苗(2n = 2x = 40)为供试材料，分别用浓度为 0. 02%、0. 05%、0. 10% 和
0. 20%的秋水仙素对其根状茎处理 24、48 和 72h，成功获得了四倍体植株。试验结果表明，以 0. 10%的
秋水仙素处理 48h 诱导效果最佳，变异率为 36%。根尖染色体压片表明，四倍体染色体数为 2n = 4x =
80，二倍体对照为 2n = 2x = 40。加倍后的植株较二倍体植株粗壮，叶片变厚，颜色变深，茎基部粗壮，颜
色深，生长势变缓，根系变粗，根状茎增粗，可作为新材料加以利用。
关键词:杂交兰;秋水仙素;四倍体;染色体
TETRAPLOID INDUCTION BY COLCHICINE AND IDENTIFICATION
IN Cymbidium INTERSPECIFIC HYBRIDS
YIN Cui-cui ZHANG Yan ZHANG Jing-hua CHEN Yao-yao WANG Guang-dong*
(College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095)
Abstract:Tetraploid was successfully induced from in vitro plantlets of diploid Cymbidium interspecific hybrids treated
with different concentration colchicine. Rhizomes were treated with colchicine at concentration of 0. 02%，0. 05%，
0. 10% and 0. 20% for 24，48 and 72h. The results indicated that the treatment of rhizomes in colchicine solution at
0. 10% for 48h was the best，and its induction rate was 36% . The chromosome number of induced plants was 2n = 4x =
80，while that of the control plants was 2n = 2x = 40. Compared with the normal diploid plants，tetraploids were
characterized by thicker and stronger roots，stems and leaves. The color of leaves and base of stems were darker and the
plants shown slower growth rate. These new materials could be used in breeding of orchid.
Key words:Cymbidium interspecific hybrids;colchicine;tetraploid;chromosome
收稿日期:2009-08-31 接受日期:2009-12-29
作者简介:尹翠翠(1983-)，女，安徽陆安人，专业硕士研究生，主要从事观赏园艺生物技术研究。E-mail:yincuicui7354@ 163. com
通讯作者:王广东(1972-)，男，河北唐山人，副教授，主要开展观赏植物生理及生物技术研究。Tel:025-84396943;E-mail:gdwang@ njau. edu. cn
兰科兰属(Cymbidium)花卉种质资源丰富，在中
国约有 49 种［1］，由于其观赏价值较高，市场需求量逐
年增加。国内外关于兰属花卉种间杂交培育新品种的
报道较多［2］，而多倍体育种方面研究相对较少。
人工诱导多倍体包括物理方法和化学方法 2 种，
物理方法诱导率较低，而自从秋水仙素作为化学诱变
剂诱导蔓陀萝四倍体获得成功以来［3］，由于其具有诱
变方法简便，诱变率较高，诱变效果好等特点，在许多
植物的多倍体诱导中被广泛应用。通过秋水仙素诱变
的多倍体有四倍体，六倍体，八倍体等。
通常多倍体植物具有植株粗壮、花朵硕大、花色艳
丽、叶质增宽增厚、适应性增强及次生代谢物积累提高
等特点。国内关于兰属多倍体诱导已有春兰［4］、沉香
虎头兰［5］、墨兰 ×大花蕙兰的 F1 代
［6］、素心黄［7］等染
色体加倍的报道。国外已报道的有寒兰［8］等。随着
人们对兰属花卉优良性状需求的日益提高，培育新型
兰属花卉新品种已成为满足市场需要的关键。本试验
在已有兰属远缘杂交后代材料的基础上［9，10］，进一步
通过染色体加倍技术创建杂交兰新种质，以培育花型
优良，抗逆性强的四倍体杂交兰新材料，并形成稳定可
遗传的新品种，丰富兰科花卉的种质资源。
815
3 期 秋水仙素诱导杂交兰四倍体及倍性鉴定
1 材料与方法
1. 1 供试材料
以杂交兰品种‘韩国桃花’为母本，以蕙兰为父本
进行种间远缘杂交，杂交种子无菌播种后获得的杂交
兰根状茎［9］作为本试验的供试材料，取根状茎接种于
增殖 培 养 基 1 /2MS + NAA 2. 0mg /L + 6-BA 0. 5
mg /L［9］上，对其进行增殖，经过增殖的根状茎进行染
色体加倍试验。
1. 2 多倍体的诱导
将增殖后的根状茎侧生茎尖切成 0. 5cm 大小，分
别用浓度为 0. 02% ～ 0. 20% 的秋水仙素浸泡处理 24
～ 72h，用无菌水冲洗处理后的材料，接种至 1 /2MS +
NAA 2. 0mg /L + 6-BA 0. 5mg /L 培养基上，在温度
25℃，光照强度 2000lx，光照时间 12h 条件下进行培
养，45d 后进行初步的形态学观察。
1. 3 多倍体的筛选及鉴定
外部形态的初步鉴定:在根状茎诱导处理后的
45d，观察根状茎顶端的形态和长势等，进行初步的筛
选及变异率的统计，在此基础上进一步鉴定每个株系
的倍性。
茎尖染色体数鉴定:切取形态变异明显的根状茎
再生的幼嫩茎尖，洗净，分别用 0. 002mol /L 8-羟基喹
啉于 14℃ ～ 16℃条件下处理 6. 5 ～ 7h、卡诺氏固定液
(无水乙醇 ∶ 冰醋酸 = 3 ∶ 1)下 4℃ 冰箱中固定 10 ～
20h、5mol /L 盐酸中室温(22℃)下解离 30min，卡宝品
红染液染色 15 ～ 20min 后压片［10，11］。最后在 Leica
DM1000 光学显微镜下镜检，选取染色体分散程度好
的细胞，进行拍照和分析。
1. 4 加倍植株的生长和增殖
将上述鉴定的变异植株接种在生根培养基 1 /2
MS + NAA 1. 0mg /L + 6-BA 1. 0mg /L［9］上，待植株生根
后，取幼嫩根尖，方法同上，重新鉴定染色体数。并对
鉴定为多倍体的植株进行增殖。
2 结果与分析
2. 1 离体培养条件下秋水仙素对杂交兰根状茎的诱
导效果
以形态学变异特征作为多倍体变异的初步鉴定指
标，不同浓度秋水仙素处理杂交兰根状茎茎尖，变异情
况如表 1 所示。由表 1 可知，0. 10%的秋水仙素处理
根状茎 48h 诱导效果最佳，杂交兰根状茎的变异率为
36%，表明 0. 10%为适宜的处理浓度。以培养 30d 后
停止发育，出现死亡的根状茎数计算各处理的死亡率。
由表 1 可看出，随着处理浓度的升高和时间的延长，死
亡率也随之增加，0. 20%的秋水仙素处理 72h 茎尖全
部死亡，在低于 0. 10% 的秋水仙素处理浓度下，随着
浓度的升高，变异率增大。表明在 0. 05% ～ 0. 10%的
浓度范围内，杂交兰(‘韩国桃花’×蕙兰)的根状茎对
秋水仙素的敏感度较高。
表 1 秋水仙素不同浓度及不同处理时间对
杂交兰根状茎变异率的影响
Table 1 The effects of different colchicine concentration
and different treatment time on variant rate of
rhizomes of Cymbidium interspecific hybrids
秋水仙素
colchicine
concen-
tration
(%)
处理时间
treatment
time (h)
处理根状
茎数
total
treated
rhizomes
死亡数
number of
death
rhizomes
死亡率
death
rate (%)
变异数
number of
mutation
rhizomes
变异率
variant
rate
(%)
0 0 50 0 0 0 0
0. 02 24 50 0 0 0 0
48 50 0 0 0 0
72 50 0 0 0 0
0. 05 24 50 0 0 6 12
48 50 2 4 5 10
72 50 3 6 7 14
0. 10 24 50 0 0 9 18
48 50 4 8 18 36
72 50 4 8 15 30
0. 20 24 50 33 66 7 14
48 50 37 74 9 18
72 50 50 100 0 0
2. 2 杂交兰多倍体植株的鉴定
2. 2. 1 外部形态鉴定 经秋水仙素浸泡处理的根状
茎接种于培养基上，10d 后观察到处理根状茎较未处
理根状茎膨大明显。处理 45d 后观察发现，经秋水仙
素处理的根状茎(B1、B2、B3)较未处理的根状茎(A)
粗壮，茎段变圆分节，着生有绒毛，生长势变缓(图 1)。
2. 2. 2 诱变杂交兰植株染色体数目鉴定 经外部形
态鉴定的变异植株，进一步再生出根状茎，利用茎尖压
片法对其染色体数进行鉴定。结果表明，部分诱导材
料的染色体数超过 40 条，由于植株染色体小，染色体
重叠，茎尖细胞核粘稠等原因，只有少数株系制片显示
了四倍体 2n = 4x = 80。初步筛选的变异植株中约有
30%为四倍体(图 2)。
2. 2. 3 多倍体植株的表型鉴定 诱导变异植株经鉴
定后确认为加倍的植株，在离体条件下进行增殖和生
根培养，获得完整的植株。观察植株形态，发现四倍体
915
核 农 学 报 24 卷
图 1 野生型杂交兰根状茎(A)与诱导变异
根状茎的比较(B1、B2、B3)
Fig. 1 Rhizomes comparison between wild type
(A)and variant(B1，B2，B3 )of
Cymbidium interspecific hybrids
图 2 杂交兰二倍体、四倍体细胞的染色体数目
Fig. 2 Chromosome characteristics of diploid and
tetraploid Cymbidium interspecific hybrids
A:二倍体 diploid (2n = 2x = 40);B:四倍体 tetraploid (2n = 4x = 80)
植株较二倍体植株粗壮，叶片变厚变硬，茎基部粗壮，
且颜色变深，根系变粗变短，木质化程度增加(图 3)。
图 3 杂交兰四倍体(A)和二倍体(B)组培苗形态特征比较
Fig. 3 Comparison of morphological characteristics
between tetraploid(A)and diploid (B)plantlets of
Cymbidium interspecific hybrids
3 讨论
秋水仙素作为染色体加倍的诱变剂，其毒性较强，
处理浓度过高会影响试验材料的正常生长，超过一定
浓度，会导致试验材料的死亡，但处理浓度过低，则达
不到染色体加倍的效果。王军玲等［12］对鸡冠花营养
芽的多倍体诱导研究发现，0. 15%的秋水仙素溶液浸
泡处理 36h 效果最佳，诱导率达 23. 3%。吴红芝等［13］
对彩色马蹄莲不定芽的多倍体诱导研究发现，0. 05%
的秋水仙素处理 24h 的诱导效果最佳，诱导率高达
52%。李正红等［14］对地锦体胚和丛生芽的多倍体诱
导研究发现，0. 05%的秋水仙素处理 48h 以上对地锦
体胚萌发具有显著抑制作用，0. 10%浓度处理 96h 产
生完全抑制。李涵等［15］诱导齿瓣石斛丛生芽多倍体
的研究表明，在 0 ～ 0. 10g /L 范围内，秋水仙素处理浓
度高，变异率低，处理时间与变异率之间无明显的相关
性。李涵等［16］利用秋水仙素诱导非洲菊的研究表明，
在 0. 02% ～ 0. 10%范围内，随着秋水仙度浓度的升高
和处理时间的延长，变异率不断增加，在 0. 10% 的浓
度下处理 48h 变异率达 10% ～ 16%。本试验研究表
明:用 0. 05% ～ 0. 20%浓度的秋水仙素处理杂交兰根
状茎 24 ～ 72h 均能诱导产生变异植株，在低于 0. 10%
的秋水仙素处理浓度下，随着浓度的升高，变异率增
大，高于 0. 10% 的浓度，随着浓度的升高，死亡率增
大，变异率减小。其中 0. 10%的秋水仙素处理 48h 诱
导效果最佳，变异率为 36%。进一步对变异植株的茎
尖进行染色体鉴定，发现变异植株中约有 30%为多倍
体植株，且死亡率较低，仅为 8%，说明秋水仙素能有
效诱导杂交兰多倍体。
杂交兰茎尖发生染色体加倍后，通常生长缓慢，通
过调节培养基营养组成及生长调节剂的浓度，逐渐降
低 NAA 的浓度至 0. 10mg /L，使其正常生长，获得了株
型粗壮，叶片粗糙宽厚的杂交兰四倍体无菌苗，但由于
杂交兰从组培苗到开花需要 2 ～ 3 年，目前还未获得开
花的植株，故对开花性状等的研究还有待进一步进行。
参考文献:
［1 ］ 刘仲健，陈心启，茹正忠 .中国兰属植物［M］. 科学出版社，2006:
30
［2 ］ 朱根发，陈明莉，罗智伟，罗思琼，吕复兵，王碧青 .墨兰与大花蕙
兰种间杂种原球茎的诱导及增殖研究［J］. 园艺学报，2004，31
(5):688 － 690
［3 ］ Blackslee F A， Avery A G. Methods of inducing doubling of
chromosome in plants［J］. Hered，1937，25:80 － 108
025
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(3):518 ～ 521
［4 ］ 林 芬，邓国础 .春兰人工诱变的研究［J］. 湖南农业大学学报，
1997，3(4):336 － 340
［5 ］ 李 涵，龙春林，郑思乡，李枝林 .沉香虎头兰多倍体诱导及其鉴
定［J］.园艺学报，2005，32(5):853
［6 ］ 张志胜，谢 利，肖爱兴，何琼英，姜 蕾 . 秋水仙素处理兰花原
球茎对其生长和诱变效应的影响［J］. 核农学报，2005，19(1):
19 － 23
［7 ］ 邓 樱，周 晔，陈继敏 .秋水仙素诱导兰属‘素心兰’多倍体的
方法研究［J］.亚热带植物科学，2008，37(2):38 － 40
［8 ］ Kim M，Yang W J，Hoon S C， et al. Polyploidy induction of
Cymbidium kanran by treatment of colchicine in vitro［J］. Journal of
Horticulture Science，1997，39(1):73 － 76
［9 ］ 陈瑶瑶，张 燕，张 琛，王广东 . 杂交兰‘韩国桃花’ × 蕙兰种
间杂交种子无菌萌发特征研究［J］. 园艺学报，2009，36(3):
441 － 446
［10］ 张景华，陈瑶瑶，王广东 . 杂交兰 × 蕙兰种间杂交后代的核型特
征分析［J］.分子植物育种，2009，7(2):380 － 384
［11］ 朱 徵 . 植物染色体及染色体技术［M］. 北京:科学出版社，
1982:42 － 92
［12］ 王军玲，汪卫星，郭启高，王忠猛，向素琼，李晓林，梁国鲁 . 鸡冠
花离体快繁及多倍体诱导［J］. 分子植物育种，2008，6(1):87
－ 192
［13］ 吴红芝，张锡庆，郑思乡，石景峰，毕玉芬 . 彩色马蹄莲多倍体的
诱导［J］.园艺学报，2008，35(3):443 － 446
［14］ 李正红，孙振元，彭镇华 .秋水仙素诱导地锦多倍体研究［J］. 核
农学报，2005，19(6):430 － 435
［15］ 李涵，郑思乡，龙春林 .齿瓣石斛多倍体的诱导初报［J］. 云南植
物研究，2005，27(5):552 － 556
［16］ 李 涵，鄢 波，张 婷，蒋亚莲，张 颢，于丽霞，李绅崇 . 切花
非洲菊多倍体诱导初报［J］.园艺学报，2009，36(4):605 － 610
(责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
)
(上接第 512 页)
参考文献:
［1 ］ Saunders J M，Bingham E T. Production of alfalfa plants from callus
tissue［J］. Crop Science，1972，12:804 － 808
［2 ］ 李 聪，熊德邵，耿华珠 . 苜蓿愈伤组织再生植株研究［J］. 中
国草地，1989(3):51 － 55
［3 ］ Atika C，Deepak P. Regeneration and genetic transformation of grain
legumes:An overview［J］. Current Science，2003，84:3381 － 387
［4 ］ Susana de S A，Ana S R L A，Dulce MMFS，et al. An efficient
transformation method to regenerate a high mumber of transgenic
plants using a new embryogenic line of Medicago truncatula cv.
Jemalong［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，78:123
－ 131
［5 ］ 师尚礼 .不同培养基对三种豆科牧草花药培养影响的研究［J］.
甘肃农业大学学报，2000. 35(1):43 － 46
［6 ］ Meijer E G M. Brown D C W. A novel system for rapid high
frequency somatic embryogenesis in Medicago sativa［J］. Physiologia
Plantarum，1987，69:591 － 596
［7 ］ 苏玉春，韩微微，陈 光 . 紫花苜蓿组织培养再生体系的建立
［J］.中国草地学报，2008，30 (2):43 － 46
［8 ］ 黄远新，谭 鹃，黄玉兰，冯 超 . 紫花苜蓿立体叶片愈伤组织诱
导的研究［J］. 草业与畜牧，2008，154:1 － 4
［9 ］ Ivanova A，Velcheva M，Denchev P，et al. Endogenous hormone
levels during direct somatic embryogenesis in Medicago falcata［J］.
Physiologia Plantarum，1994，92:85 － 89
［10］ 吕冬霞，曲长福 .植物生长调节剂对愈伤组织培养的影响［J］. 北
方园艺，2004，(5):68 － 72
［11］ Ana S D， Ana S P， Dulce M D S， et al. Efficient somatic
embryogenesis and plant regeneration from long － term cell
suspension cultures of Medicago truncatula cv. Jemalong In Vitro
xellular and developmental［J］. Biology － Plant，2006，42(3):
270 － 273
(责任编辑 王媛媛)
125