全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 052617204
氮离子注入对仿栗种子
当代生理生化性状的影响
陆　佳1 　李志辉1 　张　斌1 　李昌珠2 　欧日明1
(11 中南林业科技大学 ,湖南 长沙　410004 ; 21 湖南省林业科学院 ,湖南 长沙　410004)
摘 　要 :研究了不同剂量的氮离子注入仿栗种子对种子内过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性
以及丙二醛的含量、电解质外渗率的影响。结果表明 :离子注入剂量在 9 ×1016～12 ×1016 N + Πcm2 下过
氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的酶活性达到峰值 ,丙二醛含量和电解质外渗率最低 ,在一定程
度上削弱种子脂质过氧化作用。结果说明一定剂量的氮离子注入能激活合成自由基清除酶的能力 ,在
一定程度上免受自由基侵害。
关键词 :仿栗 ;氮离子注入 ;脂质过氧化
EFFECTS ON N+ ION IMPLANTATION ON PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL
CHARACTERS OF Sloanea hemsleyana SEEDS
LU Jia1 　LI Zhi2hui1 　ZHANG bin1 　LI Chang2zhu2 　OU Ri2ming1
(11 Central South University of forestry and Technology , Changsha , Hunan 　410004 ;
21 Hunan Academy of Forestry , Changsha , Hunan 　410004)
Abstract :Different doses of nitrogen ion were injected into the Sloanea hemsleyana seeds. The effects on peroxidase ( POD)
activity , superoxide dismutase (SOD) activity , catalase (CAT) activity , malondiadehyde (MDA) content and the permeability
of electrolytes were investigated. The results showed that the activities of POD , SOD , and CAT reached the peak at the
injection doses from 9 ×1016 N + Πcm2 to 12 ×1016 N + Πcm2 , and the MDA content and the leakage of electrolytes were at the
lowest level . It suggested that some certain dose of nitrogen ion beam implanting can activate the ability of enezyme scavenging
free radical .
Key words : Sloanea hemsleyana ;nitrogen ion implantation ;lipid peroxidation
收稿日期 :2008201223 　接受日期 :2008203226
基金项目 :中南林业科技大学青年科学基金项目 (0700B)和“十一五”科技部国际合作重点项目 (2006DFA63230)
作者简介 :陆佳 (19842) ,女 ,湖南南县人 ,硕士研究生 ,研究方向为森林培育学。E2mail :lujia19842002 @1261com　　仿栗 ( Sloanea hemsleyana) 属于杜英科猴欢喜属 ,为常绿乔木 ,分布于我国四川、云南、湖北西部及湖南等地 ,生长于山谷溪边等土壤潮湿的地方。其树型高大、枝叶繁茂 ,观赏价值高 ;其木材呈白色 ,纹理直而细嫩 ,可作建筑、家俱等用材 ;种子可榨油 ,能作为一种新的油脂资源加以利用。离子束在生物技术上的应用是一个全新的研究领域 ,是育种方法学的重要创新。离子注入植物不仅损伤轻、突变率高、突变谱广 ,而且突变体稳定快 ,可遗 传 ,容易产生新基因材料 ,丰富种质资源 ,为林木育种研究服务。低能离子束在水稻、小麦、棉花和番茄等作物和微生物育种上应用较多[1～5 ] 。但在木本植物方面的研究还鲜有报道。有研究表明[6 ] ,离子束辐射作用于植物可引起体内活性氧自由基大量产生 ,而这些自由基可以通过攻击生物大分子 ,引起蛋白质、核酸等损伤。但植物体内存在对各类活性氧自由基有清除作用的各种酶 ,这些酶通过催化各自的底物与不同活性氧自由基发生反应
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来达到清除体内过量的活性氧自由基 ,保护植物免受
伤害的目的。为此 ,本文以仿栗种子为材料 ,研究低能
氮离子注入对其辐照当代生理生化特性的影响 ,旨在
探讨低能离子束辐照对仿栗种子的损伤及损伤修复机
制 ,为仿栗遗传育种提供理论依据。
1 　材料和方法
111 　材料
仿栗种子选自张家界国家森林公园武陵源风景
区。
112 　离子注入处理
氮离子注入处理在中南林业科技大学森林培育实
验室进行 ,采用 LCD21000 型离子注入机 ,氮离子注入
能量为 30keV ,分别采用 3 ×1016 、6 ×1016 、9 ×1016 、12 ×
1016 、15 ×1016 、18 ×1016 N + Πcm2 六个剂量进行种子注
入处理 ,脉冲次数 40 次 ,以未处理种子为对照 (CK) ,
每组测定种子数为 50 粒。
113 　测定
11311 　材料处理 　每个处理分别称取混合后的仿栗
种子 012g ,放入冰浴的研钵中 ,加入少量 0105molΠL
pH718 磷酸缓冲液及石英砂 ,研磨成匀浆 ,将匀浆转入
10ml 的离心管中 ,用磷酸缓冲液定容到 7ml ,在 8500rΠ
min 条件下离心 20min ,取上清液定容到 10ml ,即为酶
粗提液 ,用于测以下酶活性。
11312 　过氧化物酶 ( POD) 活性测定 　采用愈创木酚
法[7 ] ,酶活性测定的反应体系包括 :219ml 0105molΠL 磷
酸缓冲液 ; 110ml 2 %H2O2 ; 110ml 0105molΠL 愈创木酚
和 011ml 酶液。用加热煮沸 5min 的灭活酶液为对照 ,
反应体系加入酶液后 ,立即于 34 ℃水浴中保温 3min ,
然后迅速稀释 1 倍 ,470nm 波长下比色 ,每隔 1min 记
录 1 次吸光度 ,共记录 5 次 ,然后以每分钟内 A470 变
化 0101 为 1 个酶活性单位 (U) 。酶活性以 UΠg·min 表
示。
11313 　过氧化氢酶 (CAT)活性测定　参照李柏林和梅
慧生[8 ]的方法测定 ,以每克鲜样每分钟内分解 H2O2 的
毫克数为一个酶活性单位。统一提取酶液 215ml ,对
照加灭活酶液 215ml ,再加入 215ml 011molΠL H2O2 ,同
时计时 ,于 30 ℃恒温水浴中保温 10min ,立即加入 10 %
H2 SO4 215ml。用 011molΠL KMnO4 标准溶液滴定 ,至出
现粉红色 (在 30min 内不消失) 为终点。酶活性以每克
鲜重样品 1min 内分解 H2O2 的毫克数表示。
11314 　超氧化物歧化酶 (SOD)活性测定　参照 Stewert
和Bewley[9 ]抑制 NBT光化还原的方法。反应液总体积
3ml ,其中含有 0105molΠL 磷酸缓冲液 115ml ,130mmolΠL
甲硫氨酸 013ml ,75μmolΠL 氮兰四唑 013ml ,100μmolΠL
EDTA2Na2 液 013ml , 20μmolΠL 核黄素 013ml ,蒸馏水
0125ml 和酶液 0105ml ,在 4000lx 日光下反应 20min ,以
缓冲液代替酶液作为对照 ,在 560nm 波长下比色。以
SOD 抑制氮兰四唑光还原 50 %时所需酶液量为一个
酶活性单位。
11315 　丙二醛 (MDA) 含量测定 　参照 Heath 等[10 ] 的
硫代巴比妥酸 ( TBA) 比色法。取上述统一提取酶液
2ml ,加 0167 % TBA 2ml ,混合后在 100 ℃水浴上煮沸
30min ,冷却后再离心一次。分别测定上清液在
450nm、532nm 和 600nm 处的吸光度值 ,按公式 c (μmolΠ
L) = 6145 (A532 - A600 ) - 0156 A450算出丙二醛 (MDA) 浓
度 ,再算出单位鲜量组织中的 MDA 含量 (μmolΠg) 。
11316 　电解质外渗率测定　参照徐本美的方法[11 ] ,略
加改动。选取完整无损、颗粒饱满的处理后种子 1 g ,
用自来水冲洗干净后用双蒸水冲洗数遍 ,再用滤纸吸
干表面水分 ,置于小烧杯中 ,加入 30ml 双蒸水 ,用保鲜
膜封口。置于 25 ℃恒温培养箱中 ,分别于 1、4 和 24h
取出 ,在室温下放置一段时间 ,待其温度与室温相同
时 ,用 DDS2307 型电导仪测其电导率 (C1 ) ,再将样品放
入沸水浴中煮沸 15min ,冷却至室温测其电导率 (C2 ) ,
试验前要先测定双蒸水的电导率 (空白值) ,重复 3 次。
相对电导率 ( %) = (C1 - 空白值ΠC2 - 空白值) ×100 %
图 1 　离子注入对仿栗种子 POD 活性的影响
Fig. 1 　Effects of N + ion implantation on the
POD activity of S . hemsleyana seeds
2 　结果与分析
211 　不同剂量离子束处理对仿栗种子 POD 活性的影
响
由图 1 可见 ,随着离子束剂量的增加 ,仿栗种子的
POD 活性呈现先上升后降低的趋势 ,当剂量达 9 ×1016
N + Πcm2时 ,POD 酶活性达到峰值 ;当剂量达到 12 ×1016
N + Πcm2 时 , POD 活性比峰值仅下降了 1 % ;当剂量超
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过 12 ×1016 N + Πcm2 时 ,酶活性呈明显下降趋势。说明
中等剂量注入对 POD 活性最具刺激作用。
212 　不同剂量离子束处理对仿栗种子 CAT活性的影
响
试验结果表明 ,随着离子束剂量的增加 ,仿栗种子
的 CAT活性与 POD 呈现相似的变化趋势 ,即先增加后
降低 (图 2) ,当离子束剂量达到 9 ×1016 N + Πcm2 ,CAT
活性出现一个峰值 ;当剂量超过 12 ×1016 N + Πcm2 时 ,
酶活性又逐渐下降 ,但变幅不大。
图 2 　离子注入对仿栗种子 CAT活性的影响
Fig. 2 　Effects of N + ion implantation on the
CAT activity of S . hemsleyana seeds
213 　不同剂量离子束处理对仿栗种子 SOD 活性的影
响
试验结果表明 ,随着离子束剂量的增加 ,仿栗种子
的 SOD 活性呈现先上升后降低的趋势 (图 3) ,当离子
束剂量达到 9 ×1016 N + Πcm2 ,SOD 酶活性达到峰值 ;当
剂量达到 12 ×1016 N + Πcm2 时 ,SOD 酶活性比峰值下降
了 13187 % ;当剂量超过 12 ×1016 N + Πcm2 时 ,仿栗种子
内 SOD 活性呈明显下降趋势。说明中等剂量注入对
SOD 活性具有刺激作用。
图 3 　离子注入对仿栗种子 SOD 活性的影响
Fig. 3 　Effects of N + ion implantation on the
SOD activity of S . hemsleyana seeds
214 　不同剂量离子束处理对仿栗种子 MDA 含量的
影响
MDA 是脂质过氧化作用的终产物 ,MDA 含量表示
脂质过氧化强度和膜系统伤害程度 ,是逆境生理的主
要指标。从图 4 可以看出 ,氮离子注入后 ,随着剂量的
增加 ,仿栗种子 MDA 的含量呈先下降后上升的趋势 ,
在剂量 9 ×1016 N + Πcm2 时 ,MDA 含量达到最低点 ,之后
出现上升的趋势。说明氮离子注入起始阶段生物体自
身修复系统发挥了作用 ,脂质过氧化作用受到削弱 ;当
离子剂量过大时 ,细胞损伤严重 ,保护酶活性可能受到
抑制 ,因而膜质过氧化产物积累 ,这与 SOD 和 CAT 在
高剂量下酶活性下降相一致。
图 4 　离子注入对仿栗种子 MDA 含量的影响
Fig. 4 　Effects of N + ion implantation on the
MDA content of S . hemsleyana seeds
215 　不同剂量离子束处理对仿栗种子电解质外渗率
的影响
电解质渗透程度可作为膜变性和损伤的直接指
标 ,相对的电导率越大则膜透性越大 ,电解质外渗越严
重。由图 5 可见 ,在 9 ×1016 N + Πcm2剂量下 ,电解质在
1、4 和 24h 均达最低值 ,而大于 9 ×1016 N + Πcm2 剂量则
呈上升趋势 ,这与 MDA 积累的趋势一致。
图 5 　离子注入对仿栗种子电解质外渗率的影响
Fig. 5 　Effects of N + ion implantation on the
permeability of electrolytes of S . hemsleyana seeds
3 　讨论
脂质过氧化作用是指细胞膜系统组分脂质分子中
不饱和脂肪酸氧化降解的链式反应。不饱和脂肪酸在
活性氧的引发作用下 ,发生自由基反应 ,脂质过氧化终
产物为 MDA。MDA 和自由基可与蛋白结合 ,导致蛋白
916　5 期 氮离子注入对仿栗种子当代生理生化性状的影响
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和酶交联、聚合 ,丧失活性。同时改变了膜结构 ,使细
胞膜产生变性 ,最终导致细胞损伤[12 ] ,影响膜的正常
生理功能。
离子束注入生物体在其经过的径迹周围产生大量
的活性氧自由基 ,其中包括 O -2 、·OH、H2O2 等 ,在逆境
下 ,生物自由基产生与清除的平衡被打破 ,生物自由基
的浓度上升[10 ] ,而细胞膜内含有大量的不饱和脂肪
酸 ,在生物自由基或活性氧的作用下易诱发脂质过氧
化作用。SOD、CAT 和 POD 是生物体中清除自由基的
主要酶系 ,SOD 催化 O -2 分解后产生大量的 H2O2 ,而
CAT、POD 是清除细胞内 H2O2 的酶 ,并且在阻断自由
基链式反应中起着承上启下的作用[13 ] 。本研究证明 :
氮离子注入剂量在 9 ×1016 N + Πcm2 时 ,仿栗种子中
POD、CAT、SOD 3 种酶活力均达到峰值 ,而在大于 12 ×
1016N + Πcm2 剂量下 ,酶活性逐渐下降。说明一定剂量
的氮离子注入能激活合成自由基清除酶的能力 ,在一
定程度上免受自由基侵害 ,同时 ,在剂量 9 ×1016 ～12
×1016N + Πcm2 下 ,3 种酶活力平均较高 ,有利于协调作
用 ,使自由基维持在一个较低的水平。
MDA 已被确认为脂质过氧化物 ,其含量多少是脂
质过氧化作用强弱的一个重要指标。用一定剂量的氮
离子注入仿栗种子 ,种子中 MDA 含量降低 ,且在 9 ×
1016N + Πcm2 剂量下 ,MDA 含量最低 ,此时电解质外渗
率也最低 ,说明脂质过氧化作用被削弱。氮离子注入
仿栗种子后 ,随着剂量的增加 ,MDA 的含量呈现先下
降后上升的趋势 ,说明离子注入起始阶段生物体自身
修复系统发挥了作用 ,脂质过氧化作用被削弱。但随
着离子剂量的增加 ,其含量呈现上升趋势 ,说明高剂量
氮离子的注入 ,使膜的通透性增加 ,离子大量外渗 ,破
坏了细胞的调节能力 ,膜系统的正常功能被破坏 ,因而
膜质过氧化产物积累。
综上所述 ,不同剂量的氮离子注入对仿栗种子的
生理特性有着不同程度的影响 ,且离子注入剂量在 9
×1016～12 ×1016N + Πcm2 下 POD、CAT、SOD 活性达到峰
值。说明一定剂量的氮离子注入能激活合成自由基清
除酶的能力 ,在一定程度上免受自由基侵害 ,同时 ,在
剂量 9 ×1016～12 ×1016 ionsΠcm2 下 ,3 种酶活力平均较
高 ,有利于协调作用 ,使自由基维持在一个较低的水
平。但由于试验条件以及仿栗种子本身难发芽等一些
因素的影响 ,在对幼苗辐射损伤方面的研究还有待进
一步进行。
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