全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062441204
梭梭 ( Haloxylon ammodendron)愈伤组织诱导
及植株再生
施　茜1 　孙振元2 　卢　琦3
(11 甘肃省治沙研究所 ,甘肃 武威　733000 ;21 中国林业科学研究院林业研究所Π国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091 ;
31 中国防治荒漠化研究与发展中心Π中国林业科学研究院 ,北京　100091)
摘 　要 :以梭梭 ( Haloxylon ammodendron)无菌苗的茎尖、子叶、下胚轴为材料进行愈伤组织诱导 ,
培养基中单独添加 1～3mgΠL 的 2 ,42D 或与 015mgΠL 的 62BA 配合使用 ,均能成功诱导出愈伤组
织 ,但在愈伤组织诱导起始阶段 ,用含 2 ,42D 210mgΠL、BA 015mgΠL 的培养基效果较好 ;在 2 ,42D
110mgΠL、BA 015mgΠL 的分化培养基上经过两次连续继代培养后 ,在含 BA 015mgΠL、IAA 110mgΠ
L 的培养基上愈伤组织生长状态最好 ,并从茎尖诱导的愈伤组织上获得了再生植株。
关键词 :梭梭 ;组织培养 ;胚性愈伤 ;植株再生
CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION IN Haloxylon ammodendron
SHI Qian1 　SUN Zhen2Yuan2 　LU Qi3
(11 Gansu Desert Control Research Institute , Wuwei , Gansu ,733000 ;
21 Research Institute of Forestry , Chinese Academy of ForestryΠKey Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing ,100091 ;
31 China National Research and Development Center for Combatting Desertification Π Chinese Academy of Forestry , Beijing , 100091)
Abstract :Protocols for in vitro plant regeneration via callus devised from shoot tip were established in an important
desert plant , Haloxylon ammodendron. Callus induction has been achieved from cotyledons , hypocotyls and shoot
tip explants. The highest frequency of callus induction and greatest amount of callus proliferation occurred on MS
medium supplemented with 210mgΠL 2 ,42D combined with 015mgΠL BA. Followed two generations of subcultures on
MS medium supplemented with 110mgΠL 2 ,42D and 015mgΠL BA. The highest frequency of embryogenic callus
induction was achieved on MS medium supplemented with 110mgΠL IAA combined with 015mgΠL BA. At the same
time , in vitro plant regeneration occurred from callus devised via shoot tip explants.
Key words : Haloxylon ammodendren ; tissue culture ; embryogenic callus ; plant regeneration
收稿日期 :2005207211
基金项目 :国家“948”项目 (No. 2001203) ,“十五”攻关 (No. 2000BA517A09) ,国家转基因植物研究与产业化专项 (J Y032B228202) ,甘肃省
科学事业费 (QS0312C31203)
作者简介 :施茜 (1964 - ) ,女 ,浙江永康人 ,高级工程师 ,从事荒漠植物生理生态学研究。孙振元为通讯作者 ,Email : sunzy @caf . ac. cn
梭梭 ( Haloxylon spp. )是中亚荒漠中分布最广的荒漠植被类型 ,是戈壁沙漠最优良的防风固沙植被
之一。多年来由于人们对其根部寄生的肉苁蓉 ( Cistanche deserticole) 的盲目采挖 ,造成梭梭的自然更新
困难、区域性发展滞缓濒危 ,已被列为国家三级濒危保护植物[1 ,2 ] 。梭梭主要靠种子繁殖 ,自花结实率
低 ,种子发芽保存期短 ,去掉果翅的种子 1 年后发芽率降到 40 % ,两年后会降到 10 % ,因而开展梭梭无
性繁殖方法研究十分必要[3 ,4 ] 。目前 ,梭梭枝条扦插尚未有成功的报道 ,梭梭属植物组培方面的研究也
很少 ,仅限于 Ramirez 对无叶梭梭 ( H. aphyllum) 胚性细胞的初步诱导 ;Paveen 以 H. aphyllum 无菌苗带芽
茎尖为试材进行离体培养 ,但均处于实验室阶段[5 ,6 ] 。本研究以梭梭 ( H. ammodendren) 为材料 ,通过愈
伤组织诱导获得再生植株 ,为保护和繁衍这一珍稀濒危植物种 ,加速其在植物细胞工程 ,基因工程等相
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关学科上的应用提供依据。
1 　材料和方法
111 　无菌材料的获得
试验用种子于 2003 年 11 月采自甘肃省民勤治沙综合试验站。挑选成熟度好、饱满的种子 ,用流水
冲洗干净后 ,用 70 %乙醇浸泡 3min ,011 %升汞溶液灭菌 8～10min ,无菌蒸馏水清洗 4～5 次。灭菌以后
的种子接种到垫有潮湿滤纸的培养皿上。黑暗条件下培养 8h 后便可以观察到芽的萌动 ,3～6d 后 ,无
菌苗长至 3～5cm 备用。
112 　愈伤组织培养
试验所采用的基本培养基是 MS 培养基 ,根据实验设计的不同附加各种激素成分 ,每升培养基加蔗
糖 30g ,琼脂 7g ,各种培养基的 pH值高压灭菌前均调为 5. 8。培养室温度为 25 ±2 ℃,光照强度 2000lx ,
光照时间 16h·d - 1 。
11211 　不同外植体的脱分化差异　将上述无菌苗茎尖、子叶和下胚轴切成 2～3mm 长的小段 ,接种到
附加 1mgΠL 2 ,42D 的 MS 培养基上 ,定期观察愈伤组织产生的时间、生长速度、颜色、质地等 ,25d 后统计
愈伤组织诱导率 ,记录愈伤组织生长情况。
11212 　不同生长素对梭梭愈伤组织诱导的影响　以无菌苗子叶为试材接种到附加不同浓度 2 ,42D、
NAA、IBA 的 MS 培养基上 ,观察方式同上。
11213 　不同浓度配比的 2 ,42D 和 62BA 对愈伤组织诱导的影响 　以上述试验结果为基础 ,选择愈伤组
织诱导效果好的生长调节物质 2 ,42D 和 62BA 进行不同浓度配比试验 ,观察方式同上。
113 　愈伤组织的选择性继代和植株分化
采用正交试验设计 ,取生长稳定、继代培养 25～30d ,不同外植体来源的愈伤组织接种到 MS 附加
IAA (012、015 和 110mgΠL) ; 62BA (012、015 和 110mgΠL) ;2 ,42D(0、015 和 110mgΠL)的培养基上。定期观察
愈伤组织诱导和分化情况 ,25d 后统计植株再生率。
2 　结果与分析
211 　愈伤组织的诱导
21111 　不同外植体的脱分化差异
根据初步试验并参考前人的研究结果[6 ] ,本试验选择 MS 为基本培养基并附加 110mgΠL 2 ,42D ,对不
同外植体的脱分化差异进行比较 (表 1) 。结果表明 ,不同外植体开始产生愈伤组织的时间和形成愈伤
组织的形态有所不同 ,接种 5d 后 ,所接种的子叶外植体切段两端开始透明 ,逐渐膨大 ,7d 后肉眼可见愈
伤组织 ,培养 20d 后外植体可完全被浅绿色愈伤组织所包围。茎尖外植体开始产生愈伤组织的时间较
子叶外植体晚且持续时间长 ,8～10d 后可看见较紧密的绿色或浅绿色愈伤组织。下胚轴 8～10d 后开始
在切段两端形成愈伤组织 ,但愈伤疏松 ,白色或浅黄色 ,生长速度也较慢。三者相比 ,以子叶为外植体产
生的愈伤组织生长速度最快。但不论是从子叶、下胚轴还是茎尖上 ,接种 20d 后愈伤组织诱导率都达到
了 100 %。
表 1 　不同外植体的脱分化差异比较
Table 1 　Differentiation of callus induction from different explants
外植体来源
source of explants
出愈时间
callus initiation (d)
愈伤组织诱导率
callus inducing rate ( %)
愈伤组织质地
callus quality
子叶 cotyledon 5～7 100 浅绿色、紧密 light green ; compact
茎尖 shoot tip 8～10 100 绿色、浅绿 ,较紧密 green ,light green ; relatively compact
下胚轴 hypocotyl 8～10 100 白色 ,淡黄 ,疏松 white , yellowy ; incompact
21112 　不同生长素对愈伤组织诱导的影响　从外植体诱导和建立愈伤组织都需要植物生长调节剂 ,多
数情况下通过加入 2 ,4 - D 获得愈伤组织[7 ] 。由表 2 可见 ,生长刺激素种类和浓度对梭梭愈伤组织的产
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生有较大的影响。所试的 3 种生长素都可以促进梭梭愈伤组织的产生 ,但是作用程度有所不同。其中
IBA 诱导愈伤组织所需的时间最短 ,诱导率也较高 ,但接种于 IBA 培养基中的愈伤组织液泡化程度较
重 ,坏死现象严重。NAA 诱导愈伤组织的时间较 IBA 稍长 ,但出愈率低 ,部分愈伤组织块发褐死亡。2 ,
42D 诱导愈伤组织所需的时间较其他两者长 ,出愈率间于二者之间 ,但从形态上看 ,愈伤组织质地较密 ,
质量较好。25d 后将愈伤组织块转接到相同的培养基上继续观察 ,再继代培养 25d 后 NAA 诱导的愈伤
组织变化不大 ,部分愈伤逐渐褐化死亡 ; IBA 诱导的愈伤组织量有明显增加 ,部分从愈伤组织上分化出
不定根 ;2 ,42D 诱导的愈伤组织生长速度适中 ,质量较好。
表 2 　不同激素对梭梭愈伤组织诱导的影响
Table 2 　Effects of plant growth regulators and their concentrations on callusinduction of H. ammodendron
植物生长调节剂
plant growth regulators(mgΠL)
2 ,42D NAA IBA 出愈时间tiem of callus initiation(d) 出愈率callus inducing rate ( %) 愈伤组织质地callus quality
011 - - 12 4410 白色 ,生长慢 white ; slow growth
015 - - 9 6114 黄绿 ,生长较快 kelly ; relatively fast growth
110 - - 11 9010 浅绿 ,较紧密 ,生长较快
light green ;relatively compact ; relatively fast growth
- 011 - 9 4310 白色 ,褐化 ,无生长 white ; brownish ; no growth
- 015 - 9 2510 浅绿 ,致密 ,生长慢 light green ; compact ; slow growth
- 110 - 8 3210 白色 ,发褐 ,生长慢 white ; brownish ; slow growth
- - 011 9 8513 绿色 ,疏松 ,生长快 green ; incompact ; fast growth
- - 015 9 6210 绿色 ,液泡化 ,生长快 green ; vacuole2like ; fast growth
- - 110 7 8910 绿色 ,液泡化 ,生长快 green ; vacuole2like ; fast growth
21113 　不同浓度配比 2 ,42D 和 62BA 对愈伤组织诱导的影响 　在上述研究基础上 ,选择 2 ,42D 和 62BA
配合 ,进行愈伤组织诱导培养 (表 3) 。结果显示 : 生长素在梭梭愈伤组织诱导中的刺激作用是显而易
见的 ,当培养基中只有 62BA 而缺少 2 ,42D 时 ,所有的组合均无愈伤组织产生。
表 3 　2 ,42D 和 62BA 对梭梭愈伤组织诱导的影响
Table 3 　Effects of 62BA and 2 ,42D on callus induction of Haloxylon ammodendron
实验号
experimental
No.
植物生长调节剂
plant growth regulators (mgΠL)
2 ,42D 62BA 接种数No. of explants 形成愈伤组织的外植体数No. of cultures with callus 出愈率callus inducing rate( %) 愈伤组织鲜重fresh weight(g)
1 0 011 40 0 - -
2 2 015 40 40 100 01045
3 1 015 40 40 100 01055
4 3 011 40 40 100 01036
5 0 0125 40 0 - -
6 2 0 40 36 90 01087
7 1 0 40 36 90 01066
8 3 0125 40 40 100 01063
9 0 0 40 0 - -
10 2 0125 40 40 100 0108
11 1 0125 40 40 100 01072
12 3 0 40 34 84 01051
13 0 015 40 0 - -
14 2 011 40 40 100 01069
15 1 011 40 40 100 01053
20 3 015 40 40 100 01069
　　方差分析结果表明 ,2 ,42D 和 BA 对愈伤组织鲜重的影响不显著 ,但对愈伤组织诱导均有极其显著
的影响。经多重比较 ,Tukey2Kramer 0. 05 检验 ,BA 浓度低于 015mgΠL 对愈伤组织诱导的影响不大 ,但当
培养基中添加 0. 5mgΠL 的 BA 时 , 可显著提高梭梭愈伤组织诱导率。比较所选的几个浓度处理 ,愈伤组
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织诱导率和愈伤组织鲜重没有明显差异。
212 　愈伤组织的选择性继代和植株再生
多种组合的愈伤组织选择性继代和分化培养基筛选试验结果表明 (表 4) :降低培养基中的 2 ,42D 含
量有利于颗粒状愈伤组织的发生 ,激素及其组成是影响梭梭外植体通过愈伤组织分化成苗的主要因素 ,
和 62BA 配合使用能进一步加速愈伤组织发育 ,但其浓度之间也有所差别 ,其中以 015mgΠL 的用量继代
效果最佳。
表 4 　不同激素配合对愈伤组织再生能力的影响
Table 4 　Combination of different plant growth regulators on regeneration ability of callus
植物生长调节剂
plant growth regulators (mgΠL)
IAA 62BA 2 ,42D 愈伤组织质地pallus quality 植株再生率plant regeneration rate ( %)
012 012 0 浅绿 ,致密 ,生长慢 light green ; compact ; slow growth 0
012 015 015 绿色 ,疏松 ,生长适中 green incompact ; intermediate growth ; 0
012 110 110 绿色 ,疏松 ,生长快 green incompact ; fast growth 0
015 012 015 绿色 ,松散 ,生长适中 green incompact , intermediate growth ; 0
015 015 110 浅绿 ,致密 ,生长慢 light green ; compact ; slow growth 0
015 110 0 浅绿色 ,疏松 ,颗粒状 light green ; incompact granule ; 0
110 012 110 绿色 ,致密 ,生长快 green ; compact ; fast growth 0
110 015 0 浅绿色 ,疏松 ,颗粒状 light green ; incompact ; granule 3313
110 110 015 浅绿 ,致密 ,被白霜 light green ; compact ; white frosty 0
　　从试验结果还观察到 ,外植体类型是影响梭梭愈伤组织分化的关键因素 (数据未显示) 。虽然下胚
轴和子叶均能诱导出愈伤组织 ,并且以子叶的诱导频率最高 ,但愈伤组织结构松散 ,不能分化出苗。而
从茎尖外植体得到的愈伤组织上 ,当 2 ,42D 浓度降低到 0 ,并添加 110mgΠL 的 IAA 和 015mgΠL 的 62BA
时 ,分化出了少量的芽和芽丛 (封 3 图版 Ⅱ(1) ) 。
将从愈伤组织上分化得到的的芽或芽丛连同少量愈伤组织转移到生根培养基上 ,芽生长速度慢且
芽的数量没有增加 ,20d 后个别芽丛从愈伤组织基部分化出根 (封 3 图版 Ⅱ(2) ) 。
3 　讨论
植物生理活动极其复杂 ,激素间的相互作用对形态发生起着关键的作用 ,与大多数植物种一样 ,梭
梭愈伤组织的诱导必需有生长素的存在 ,同浓度的 2 ,42D 效果优于 IBA 和 NAA。但却抑制胚性愈伤的
形成和分化。为了提高胚性愈伤产生率及不定芽的发生 ,在继代培养过程中 ,需逐渐降低培养基中的
2 ,42D 含量。另外 , 外源细胞分裂素 62BA 和生长素 IAA 对梭梭愈伤组织不定芽发生的刺激作用也是不
容忽视的。
愈伤组织再生植株在一定程度上受到器官或组织类型的影响 ,本试验产生不定芽的愈伤组织都来
源于茎尖外植体 ,可以进一步说明同一植物不同器官不同部位的再生差异是普遍存在的 ,造成这种差异
的主要原因可能是因为不同部位内源激素的不同 ,通过施用生长调节物质可以影响和改变内源激素水
平 ,由此改变其内源激素原始状态 ,以达到器官再生的目的[7 ,8 ] 。
本研究证明通过“成熟细胞 →愈伤组织 →出根出芽 →完整植株”建立梭梭再生体系是可能的 ,但愈
伤组织分化率低是梭梭组织培养中存在的主要问题 ,如何保持和提高梭梭愈伤组织的再生能力和分化
率还有待于进一步研究。
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3 　结论与讨论
311 　不同品种百合鳞茎适宜辐射剂量的筛选
以鳞片扦插繁殖率降至 50 %为参考标准 ,本试验筛选结果是 : 铁炮百合‘white fox’辐射诱导的适宜
剂量为 115～310Gy ;东方百合‘Marrero’的适宜剂量为 115～210Gy ,这与张克中等[6 ,7 ]在东方百合‘Berlin’
上得到的结果基本一致 ;对铁亚杂交系百合’Ceb Dazzle’品种而言 ,115～215Gy 为适宜的剂量。
312 　不同剂量辐射后 ,百合鳞片扦插幼苗耐热生理反应的差异
前人在园艺植物的耐热性研究[8～11 ]上 ,得出高温胁迫下耐热材料叶片相对电导率变化较热敏感材
料缓慢 ,耐热品种蛋白质含量降低、MDA 含量上升缓慢等结果。有关百合幼苗耐热性比较的研究也显
示 ,耐热材料叶片中游离脯氨酸含量比感热材料的上升慢[12～14 ] 。本试验采用辐射加高温双重胁迫来研
究不同品系百合幼苗的耐热生理反应 ,结果表明 ,铁炮百合‘White Fox’、铁亚杂交品种‘Ceb Dazzle’(除
210Gy 处理)和东方百合‘Marrero’经不同剂量辐射后 ,鳞片扦插苗的可溶性蛋白含量均降低 ;3 个品种百
合扦插苗叶片质膜透性均比对照增加 ,但是随着辐射剂量的提高叶片的相对电导率又呈波动性变化 ;游
离脯氨酸和 MDA 含量亦随辐射剂量的增加呈波动性变化 ,其中引起这两个生理指标含量降低的适宜辐
射剂量因品种而异 ,‘White Fox’为 210Gy、‘Ceb Dazzle’为 215Gy、‘Marrero’为 210～215Gy。
将耐热生理指标、鳞片相对繁殖率和 M1 植株的观赏品质综合考虑评价后 ,本试验认为‘White Fox’
在 115～210Gy 剂量、‘Marrero’和‘Ceb Dazzle’在 115～215Gy 剂量辐射后 ,扦插幼苗能够表现出一定的
耐热生理反应。但这种效应还需要在 M2 植株中做进一步的研究和验证。
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