全 文 ：热带亚热带植物学报 2002，1 0(I)：77—82
如wn of Tropie rd∞Ii Subt；opical Botany
外源fpf对叶片衰老分子调控研究进展(综述)
王晓莺 范树 国 张明永 梁承邺
[中国科学院华南植 物研究所 ．广东 广州 510650)
摘要。综述了叶片衰老的分子机理 ，并介绍 了将外源异戊烯基转移酶 (ipt，isopentenyl~ansferase)基因转入
植物 获得抗衰老植株的研究进展
关键词 衰老；衰老相关基因；细胞分裂素；异戊烯基转移 酶，启动子
中图分类号 Q943 2 文献标识码：A 文章编号 1005—3395(2002 l一0077-06
M olecular Genetic M anipulation of Leaf Senescence with／pt
WANG Xi an．yi rig FAN Shu—gt)o ZHANG Ming．yong LIANG Cheng—ye
South China lnctitute， Chi~se Aeada,my of s ／e ∽ Guangzhou 510650，China)
Abstract： Progress in studios on molecular mechanism of leaf senescence and on retarding senescence
by introducing P ctr t into plants are reviewed
Keywords：Senescenc~ Senescence—associatedgene；Cytokinin；Isopentenyl transferase；Promoter
叶片的衰老是植物体上发生的普遍可见的自然现象。它不是叶片细胞的简单死亡 ，而是一种
动态的细胞程序性死亡过程(programmed cel death，PCD)。叶片衰老首先表现为占叶片蛋白总量
70％的叶绿体被破坏：蛋白质、膜脂、RNA等大分子物质和叶1绿索发生降解，所形成的氨素等营养物
质被运至幼嫩的叶片、发育中的种子和储藏器官中加以利用或储存。其它细胞器如细胞核降解的
时间相对较晚，可能是为了确保营养物再循环利用的顺利完成I J 但在农作物生产上，某些作物叶
片易发生过 早衰老，使植株整体光合作用水平下降 ，光合产物减少 ，导致作物产量低 、品质差。如某
些杂交水稻在发育后期叶片和功能的早 衰导致结实率低 ，空秕率高 ，严重影响了杂交稻产量潜力
的进一步发挥121
l造成叶片衰老的因素及衰老过程 中的相关基 因
Yoshida等 的实验表明，叶绿体的衰老是由细胞桉决定的。另一实验表明，若对植物施加放线
菌酮(一种蛋 白质合成抑制剂)或放线菌素D(一种RNA合成抑制剂 )，都可在一定程度上延迟 叶片
的衰老 “。
叶片衰老的启动及进程是 由遗 传物 质控制的 ，但同时也 受各种 内外因子所影响 ．如遮 阴
(shading)、 物质缺乏、干旱、极端温度、病原体侵染、机械伤害、激素、种子的发育、叶龄等_ 。在胁
迫条件下，叶片衰老提早发生，释放水分，养分被重新利用，以确保繁殖下一代 在内部因素中，衰
老与叶龄的关系尤为密切 种子发育促使叶片衰老可能是由于种子发育时对氮素的剧烈需求引起
收稿 日期 ：2000一I1一l3 接受 日期：2001—03—29
基金项目：r东省 自然科学基 (990770)瓷助
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 10卷
的，也可能是营养器官向叶片释放一种“衰老激素”导致其衰老
植物生长调节物质中的乙烯、脱落酸对衰老有促进作用，而生长素、赤霉素、细胞分裂素可抑制衰老。
以往．口1‘片衰老的研究仅限于形态解剖、显微结构、亚显微结构、生理生化方面。近年来，随着分子生
物技术的迅速发展，使得人们可以从分子水平对叶片衰老进行研究。目前，多采用差异筛选(diferential
screening)和减扣杂 交(subtractive hybridization)等手段来 检测 绿叶和衰老 叶片中的mRNA，并 用
mRNA来构建cDNA文库。研究发现，叶片衰老过程中，总DNA水平变化较小 ，而叶片RNA总量下
降，特别是rRNA水平剧烈下降[51。与之相反，某些基因则在衰老开始后，表达量反而逐渐升高。据
此，与衰老有关的基因被分为衰老下调基因(senescence down．regulated gene，SDC)和衰老相关基
因 (senescence—associatedgene，SAG)。
光合作用的下降和叶绿素丢失是叶片衰老的主要特征 因此与光合作用有关的一些蛋 白，如
RUBISCO(1，5一二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶)小亚基、叶绿素a／b结合蛋白等在衰老过程中被丢失，
其对应的遗传物质转录丰度也急剧下降 ．这一类的基因被称为SDC。
在衰老期间，部分基因的表达呈上升趋势，这类基因被称为鼬 G基因。目前，人们从不同植物类
群中克 隆出大约3O多种 G基因，例如拟南芥 r 0 thalicma)~、石刁柏 、大麦 、油菜 、玉米 、
萝 和番茄141。这些SAG又可分为两类 ：一类称 为衰老特异 性基因 (senescence—specific gene，
SSC)，它的mRNA只有在叶片衰老时才能检测到；另一类SAG在叶片生长初期就可检测到有低水平
表达 ，衰老开始后表达量迅速上升。El前我们得到的sAG中仪有-d,部分表现m高度衰老特异性，
如从拟南芥中克隆出的酣C12、SAG13[ 和从欧渐f油菜(Brc~sic napus)中克隆出的LSC54t 】。鼬 C12
和 C13虽然是衰老特异的 ，但并不是叶片特异的．它们不仅在衰老的叶片中表达，也在衰老的茎 、
花瓣 、萼片、心皮等器官中表达【l】。
这些基网的功能有的已经被证实与衰老细胞内的犬分子物质的降解转运有关 ，如编码核酸
酶 、蛋白酶 、酯酶、谷氨酰胺合成酶等的基因。但还有不少克隆出的基因功能尚不清楚 如Lohmal 叭
拟南芥克隆的6个衰老下调基因，其产物含量在衰老期间下降到难以测出。
2 人为调控叶片衰老研究现状
叶片的衰老虽然是植物适应外界环境和 自身繁殖需要而进化的 自然现象 ，但农作物生产中，
早衰现象削弱了作物的增产潜力。因此．调控植物叶片的衰老．使衰老期延迟对提高农作物的产
量、质量有重大的意义。
目前延缓衰老的手段主要有两种：一是体外处理，往叶片上喷洒激素如细胞分裂素，或是在作
物结实期适当追加氮肥，都可一定程度的延缓衰老。另一种是分子遗传调控。植物自身细胞核基因
如何调控衰老进程 ，其中的分子机制尚不明确。目前控制衰老采用的遗传调控手段都是基于激素
生理学 研究最多的是运用转基因手段，增强细胞分裂素在植物体内表达来延缓衰老。也有人利用
乙烯的促进衰老功能 ，通过抑制乙烯 的合成 ，达到延缓叶片衰老的 目的。~lOeler等 q和John等 运
用反义RNA技术 ，将乙烯合成途径的关键酶ACC合成酶和ACC氧化酶的反义基因导人番茄中并成
功表达 ，使植株乙烯生成量减少 ，成功延缓番茄果实和叶片的衰老 拟南芥中乙烯不敏感的突变体
植株(etr．1)有叶t片衰老缓慢的现象 目，据此有人提出以与乙烯信号转导有关的基因在转基因植株
中的表达来延缓叶片衰老的战略。最近有拟南芥油菜素内酯(BR)缺陷型叶片衰老缓慢的报道 J。因
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 王晓莺等 ：外源 对叶片衰老分子调控研究进展
此有可能利用油菜索 内酯调控叶片衰老 但这 疗面的研究还未见报道
3 外源异戊烯基转移酶 (ipt)x,t衰老的调控
3．1 iet的作用与应用
细胞分裂素是五大植物生长调节物质之一 ，具有促进细胞分裂和扩大 91、诱导芽分化 、延缓叶
片衰老㈣、消除顶端优势、促进侧芽生长p-I]等功能。延迟衰老的机理是细胞分裂素抑制核糖核酸酶 、
脱氧核糖核酸酶 、蛋 白酶等的活性 ．能延缓核酸 、蛋 白质、叶绿体 等的降解 ；其次 ，细胞分裂素可促
使营养物质向应用部位移动 。已有实验证明，叶片衰老过程中叶片细胞分裂素的含量降低，通过
施加外源细胞分裂素可延迟叶片的衰老 细胞分裂素现被广泛用于调控植物叶片的衰老。
FI前 ，植物体 内细胞分裂素合成的详细途径尚不明了。曾有报道从烟草的非肿瘤细胞中克隆
出具有异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase， )活性的酶片段 ，但还无法将此酶完全纯化和
应用。 反 、根癌农杆菌 (Agrobmterium mmejhciens)中的细胞分裂素合成途径 已十分清楚。研究表
明，异戊烯荩转移酶是细胞分裂素生物合成步骤中的一个关键限速酶 ，它促使5-AMP和异戊烯基
焦磷酸合成异戊烯基腺苷一5-磷酸。此物质很快被转化成异戊烯基腺苷[(9R)IP】和异戊烯基腺嘌呤
(IP)。【(9R)I Pl和(IP)经过细胞分裂素氧化酶作用分别形成玉米素核苷和玉米索 。
当前大多利用从根癌农杆菌分离出来的 基因。将此基 因构建成 自动表达系统后 ．利用转基
因技术 导^植物体 ．使植物体 自动提高 内源细胞分裂素的浓度来延迟衰老 ．而不再需要施 加外源
细胞分裂素
3．2 枷 的表达与调控
有关 t转化初期的研究发现 ，以原始ivt~O未更换启动子的 ￡为外源基 田获得的转基 因植株
中，细胞分裂素浓度明显升高，同时带来相应的形态改变 。Smigocki和0weIS[26一 用CaMV 35S
启动子替代 l启动子，从含此嵌合质粒的转化植株中发现．CaMV 35S表现出比加 基因启动子更强
的启动 表达的能力 但无论含哪种启动子 ，植株都产牛 了过量细胞分裂素 ，导致植株矮化丛生 ，
完全失 去顶端优势 ．叶片小而恻，根系不能形成 ，从而 导致植株不能正常生K发育。因此 ，对转人
植物体的外源 如何进行分子表达调控 ，成为目前的热点研究方向。
为探索植物组织中细胞分裂素过量表达产生 的影响 ，研究者应用了许多组织特异性启 动子和
可诱 导启动子来表达外源加 ．但应用最广泛的是热激启动子 ，并成功获得了许多转化植株 。这
些转摹困植株能够产生正常的根系，但植株通常矮小．并且有大量腋生芽，激索分析显示，在没有
高温刺激时 ，转基因植株内的激素水平仍高于对照植 株的激素水平 ；一旦施加高温诱导 ，这个差值
则更加显著，但不一定伴随更_人的形态变异 在近期的例子中用h．*p70-ipt转化拟南芥，转化株细胞
分裂素过 表达．同时观察到同源盒基因(homeobox genes)K~44TI和szM呈现高表达水平嗍。有趣的
是，在另一实验中．莴苣中KA 了，的过带表达引起了细胞分裂素产量的提高m．其机理 尚不明确。
总之，利用热激启动子诱导 ，得到的转化植株即使没有高温诱导，体内的细胞分裂素水平已
足以使植橡的形态发生改变 ，同时 ，这一诱 导条件本身对植物的生长 不利。Gatz和Lenk~ ,为作 为
一 个理想的启动子，如果它所带动的基冈合成产物需求量是极低的 ，那么在诱导者不存在时，目的
基因的表达水平应该是零， 在诱 导者存在时 ，其表达水平也不能很高。细胞分裂素作为一种生长
调节物质，植物体的需要量是很低的，因此加z在作为外源基因时，它的本底越低越好。即不存在诱
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 l0卷
导因子时，启动子的活性应尽可能低。铜诱导启动子的应用使外源咖 在烟草中能以较低的水平表
达∞。但是 ，植株对铜这种毒性金属的内部生理反应限制了这一系统的应用。Kunkel等人嗣将加睹
台四环素诱导启动子转化烟草和莴苣，愈伤组织 自身产生细胞分裂素，再生出苗。在不存在诱导因
素时 ，细胞分裂素表达量很低 ，植株形态与对照相同 此外还有光诱导启动子 、果实特异性启动
子 、伤害诱导启动子等的应用 ，都获得了相应的抗衰老植株。
上述这些启动子的效果明显好于热激启动子 ，在延迟衰老的同时，大部分的转基因植株的表型
不发生变异。对实验室研究来说，这些启动子的作用无可厚非 但由于它们或者诱导因子自身对植株
生长不利，或者诱导因子的施加不便利，大大限制 了抗衰老遗传转化工程在农业生产上的应用。
Lohman等人 吁 1994年从拟南芥中克隆出一组SAG，证明其中的鲋 G，2是高度衰老特异的。Gan和
Amasmo又将sdG12启动子与咖编 码区连接 ，构建出一个可延缓衰老的自调控系统 ：民 一加f 。其工作
原理是 ：当叶片刚开始衰老时 ，SAG12启动子被活化 ， t开始表达，细胞分裂素浓度升高 ，衰老被抑
制；当细胞分裂素浓度达到一定的水平 ，衰老的症状消失，SA G12启动子不再有活性 ， 不再表达 ，
细胞分裂素 的浓度也得到控制 ，从而防止过量的激素对植物的负面影响 (见下图)。
用根癌农杆菌介 导转化法将此系统转人烟草 ，获
得了8个独 立的转基因植株 ，并对转化株 系T。、T．代与
野生型的形态和生理学特征进行了比较 ， 结果表明转
化株系的叶片衰老期及光合速率的下降 ，比野生型大
大延迟 ；转化株 的开花总数和结种数都明显高于野生
型 ，而株高和主茎上叶片数量 与野生型相差无几 。同
时 ，还 比较 了 一 g 、民 共转化株和 一 gz时{
化株 的GUS活性 ，结果表明 ，前者的GUS活性 的提高明 (AfterGan S andAmasinoR．M．，1995)
显比后者缓慢 ，说明 m一 自调控系统确实起到了 自动调节的作用 一 咖 自调控系统具有低水
平表达 、自动调节表达的优点、不需要耗费巨大的人力物力 ，就可能实现延缓作物衰老 ，提高产量。
4 展 望
以往，我国对作物衰老的调控研究，一直局限于宏观调控上。但近几年基于 啪 作物遗传育种
取得了可喜成绩。付永彩等人利用基因枪法把带有特异衰老基因SAG12启动子ft,0ipt导入水稻，经
PCR、点杂交以及Southern杂交分析 ，证明外源基因已整合到水稻基因组 中。通过GUS活性 、细胞分
裂素含量的分析以及T．代转基因植株成熟期的形态观察 ，证明此抑制衰老的 自我调节系统在部分
转基 因水稻 中表达 ，叶片衰老受到明显抑制 】。华中农业大学张启发实验室也公开报道已从四个水
稻品种中获得 一 如啭 化阳性植株 。
虽然能够获得 ￡的转基因作物 ，但叶片衰老的分子机制尚不明了，这在很大程度上限制了对
叶片衰老的分子调控 的研究和应用。X,~SA G表达调节 的研究有助于阐明叶片衰老的分子机制。动力
学研究表明，sAG的表达相当复杂，可能存在由多条途径组成的调节网络来控制叶片衰老Il。所以阻
断某个途径对衰老的进程没有明显的效用。这方面的研究还有待深人 。
目前 ， ￡基因的研究还多集中于烟草 、番茄等双子叶植物 ，在单子叶植物中的研究和应用相对
较少。最近研究发现 ： 的表达程度与实验中对材料的处理方式和材料的组织部位有很大关系。如
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 王晓莺等 ：外源 对叶片衰老分子调控研究进展
培养基中加入少量的NAA会使细胞分裂素的产量有很大提高．而施加BA则对细胞分裂素的产量
没什么影响 。其中机理还在探索之中。
随着分子生物学技术迅猛发展和转基因技术的不断完善，对衰老进行分子遗传调控的研究将
不断深入 ，并将成功应用到农作物生产中。
参考文献 ：
【I】 Gan S，AmasinoRM Making sense ofsenescence『J_P]antPh~sinl，l997．1l3：313 3l9
『2J段慢 粱承邺．黄毓文 杂交水稻开花结安期 间uf片衰老 【J1．植物生理学报 ，[997．23(2)：139 144．
『3】 YoshidaY Nuclear control ofchloroplast activityin Elodealeafcells『J_Protoplasma，196]．54：476J,92
【4】沈成国， 塥锁 毛逃自[植物叫片衰老过程 中 冈的表达与侧控 『J_植物 生理学通讯．】998，34(4)：304—312
【5】 Bate N J．Rothsten S J，Thompson J E．Expression ofnuclear and chloroplast photosynthesis·specifc genes during leafsenescence
『J_J ExpBot、[99[，42：g0l—gl1
【6】 Henze[LL GrbicV，BaumgartenDA、et al Developmental and age·m]sted processesthatinfluencethe[ongevivy and s e nceof
photos)mthetictissuesinAn “ ¨『J_P[antCel，[993．5：553—564 ，
【7】Jiang C Z，Rodermel S R1 Shib[es R M Photosynthesis，rubiseo activity and amount，and their regu[ation by tmascription in Wne~cing
soybeanleaves『J_P]antPhysio[．1993，l0I：105一l12
『8】 C[ouse SD Moleculargenetic studies confirmthe ro[eofbmssinosteroidsin plant growthanddevelopment[-q．P]am J，1996，10=1-g．
【9】 King G A．Davies K M．Stewart R J，et al Simi[arities in gene expression during the postharvest-induced,~nescen~~of~ears and
the nstum[fo】iar senescence ofasparagus plant[JJ Plant Physio[．1995，l08：125一l28
【10] Becker ApelK Diferencesin gene expression between naturaland artifcially induced[eat"senescencegJ．Plant,a,1993,189：
74—79
[I1】Buchanan-Wo][aston IsolationofcDNA clonesforgenesthat 81．e expressed during]eaf senescenceinBrasica p Identification
ofa gene encoding a senescence·specifc metaIothionein—like protein_J_Plant Physiol，[994．t05：839—846
【l2】SmanCM．Hosken SE，ThomasH，et al Th etiming ofmaizeleaf sen~ @nceand characterization of senescenee-relsted cDNAs『J_
Physio[Plan t，[995 93：6734 82
fI3 J AzumiY，WstanaheA Evidencefora sen幅。cnce—associatedgeneinduced bydadknessf盯．PlantPhysiol，1991．95：577—583．
【14】Davies K M．Grierson 13 Identifcation ofcDNA clones for tomato(L)eope~icon eseulemwa M．J】．)mRNAs that accumulate during
fruit ripening and leafsene~cence in response to ethylene【刀 Pinata,I989 】79：73—8O
【l5】LohmanKN，Gan S，JohnM C，et a[Molecu]at analysis ofnaturalleafsenescencein月柚 r “ lhrdi~ fJ]Physio]Plank】994，
92：322 328
【16】Oe1]er P W．Wong L M，Taylor L P．el al Reversible inhihition oPtomsto fruit s 。町1ce by antisense RNA『J_Sc1．】99]．254：
437_439
【】7】John J．DrakeR．Fanell A． al Delayedleaf senescen~ in etbylene-deficientACC-oxidase antisensetomatop]ants：mo[ocalarand
physiological analysis『J】P[ant J，1995．7：483—490
f18]GrbicV，BJeeckerA B Ethylene regulatesthetiming of]韶fs助船cPnc inAmbh／op，“『J1 P]antJ，】995 8 595—602
口9】Skoog F，Mil]er C Chemical regulation ofgro~ h and organ formation in plant tissues cu]tured 1；itro[Jl Syrnp Soe Exp Bio1．
I957．[[：II 8 【3I．
[2o】Richmond A E，Long A Effect ofkinetin of protein content and survival ofdstached Xemthitur*]eaves _J】．Sci，]957，125：650—65]
【2】】Sachs T ThimannKV Release of[antral budsfrom apical dominance『J1 Nature，l964，201：939—940．
[22】谱瑞l魍 黄愚得 植物生 学 【M】第三版．北 京：高等教 学出版计，1995，203
[23】Singh S．Letham D S Palni L M S C)~okinin biochemistry in relation to leaf senescence Ⅶ．Endogenous cytokinin le~e]s and
exogenous app[icatinns ofc3．~okininin retation佃sequentia1]eaf$~Descence oftobacco『J_Pbys Jol Plant．1992，86：388—397．
[24】Hen C M，Melitz D K C)~okinin biosynthesis in a cel free system rmm cytokinin autotrophic tobacco tisue cultul~『J1l FEBS Lett，
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 l0卷
l979,107：15—20
【25】Akiyoshi D E Klee H，Amasino R M，et al T-DNA ofAgrob rz terium f encodes all enzyme ofcytokinin biosynthesis_Jj_
Pro~Natl Acad gci USA．】984，S】：5994—5998
【26]Srnigocki AC，OwensLD C2~okinin genefusedwith astrong promoter enhances shoot organogenesis and zeatinlevelsin~ansfommd
plant celsI Jl ProcNatlAcad Sci USA，1988，85：51 31—51 35．
[27】Be Jnsberger S El，Valcke R LM DeblaereR Y_et a1．Efects oftheintroduction of 4grrd)~wterilmt f“ T-DNA加f genein
rlf m f， l删 L cv PetitHavana SRI plant cell sU】PlantCel Phys Jol，199l，32：489~96
【2S] SrnigoM A C Owens L D Cytokinin·to-auxin ratios and morphology of shoots and tissues transformed by a chimeric isopentenyl
|ransfer~％g-gene l Jl_Plant Physiol，l989，9 l：808-8l 1
{29】SchmiHling Beinsberger S，DeGreef J，et al Construction of a heat-inducible chimeric genetoincreasethe ey~okinin contentin
ttan sgenic Planttissue⋯ FEBS Left，1989，249：40】 O6
【301 Medford j】，Horgan R．El—Sawi三 et al Alterations ofendogenous cylok Jnins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl
transferase gene_】J．PlantCell，l987，】：4O3_4l 3
[31】Smart C M，Scofield S R，Bevan M W．et a1．Delayed leaf sen#sognce in tobacco plants uansformed with fmr．a gene for ey~okinin
productioninAgr,gtwterlt~t PlantCe¨ 11991，3：647~ 56
I32】Van Loven K，Beinsberger S E l，Valcke R L M．et a】Morphometric analysis ofthe gro~h of 矿 transgenic tobacco plants U】
J Exp Bet,】993，44：l671一l678．
[33】Rupp H M，Frank M，Wether et al／ncreased steady state mRNA levels ofthe ST?d and KNA homeobox genes in cytokinin
0verprod “gH， ¨ thali~maindicate a roleforey~okininsinthe shoot apicalmeristcrnI Jl Plant J 1999，l8：557—563
口4】Fmgis G，Giannino D，Mele G，et al Are homeobox knoaed—like genes and cytokinins the lezfarchitects?『J1 Plant Physiol，1999，
I】9 37]一374．
[35】GatzC，LenkI Promotersthat respondto chemicalinducemIJj Trendsin Plant Sci，]998．3：352-358
[36】 Mckenzie M J． Mett Reynolds P H S，et a1．Controled cytokinin production in transgenic tobacco using a copper．inducible
promoterl Jl Plant Physiol，1998，l l 6：969—977
【37】Kunkel T，Niu Q w_Chart Y S，et al Inducible isopentenyl transferee as a high—efficiency marker for plant transformation Nat
Biotechnol_l999．1 7：9】6-9l9
【38】 Redig P．Schmfilling T Van Onckelen H Analysi s ofeytokinin metabolism in ipt transgenic tobacco byliquid chromatography-
tandemmass spectrometry【J_Plant Physiol，1996，l22：141一】48
[39】Martineau B，Houck C M．Sheehy R E．et a】Fruit-specifc expression ofthe^ u， ㈣ isopentenyl transferase gene in tomato：
efects onfruit ripeningand defense-related gene expressioninleaves_J Plant J，l 994．5：1I-l 9
【40】Gan S，Anlasino RM Inhibition ofleafsenescence by autoregulated production ofcytokinin[Jl Sci，l995．270：l986—1988．
⋯ 】付永彩．J月云．刘新仿 抑制衰老的嵌台基 因在水稻中的转化 [Jl 科学通报，】998，43：]963一l 967
[45】曹盂 良 农杆曲升导的水稻高教遗传转化体 系的建立 ⋯ 湖南农业大学学报．1999，25：349—356
维普资讯 http://www.cqvip.com