全 文 ：Vol. 30 No.1
Mar. 2012
第 30卷 第 1期
2012年 3月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2011-12-04
基金项目：国家自然科学基金项目 (31170569, 30800876)；黑龙江省自然科学基金项目 (C201017)；中央高校基本科研业务费专项资金项目
(DL11EA019)；青年拔尖人才支持计划项目 (YTTP-1011-09)；东北农业大学人才科研启动金项目 (STIP10)。
作者简介：商志伟 (1986—)，女，黑龙江齐齐哈尔人。硕士研究生，主要从事林木光合生理与分子生物学方面的研究。
通讯作者：宋兴舜 (1978—) ，男，黑龙江讷河人。博士，副教授，主要从事林木抗逆生理与分子生物学方面的研究。E-mail: sfandi@163.com。
叶黄素循环的启动：
外源 AsA对欧李幼苗干旱胁迫的缓解
商志伟 1，尹赜鹏 1，孙孟超 1，任 静 2，宋兴舜 1
(1.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要： 为给提高欧李幼苗植株 耐逆性提供理论指导，研究了在干旱胁迫下外源抗坏血酸 (AsA)对欧李幼苗叶
片光合作用和叶黄素循环的影响，并结合抑制剂与分子生物学的手段进一步研究玉米黄质 (Z)形成的机制。结果
表明，外施 AsA缓解了干旱胁迫引起的欧李叶片光饱和点的降低，促进了内源 AsA的产生，增加了叶黄素循环
中 Z的含量，使更多的紫黄质 (V)转化成单环玉米黄质 (A)和 Z。AsA还能在转录水平提高紫黄质脱环氧化酶
(VDE)的表达，而对玉米黄质环氧酶 (ZEP)的作用不显著。抑制剂二硫苏糖醇 (DTT)能显著抑制叶黄素的脱环
氧化状态，但葡糖胺 (Gla)作用不显著。表明外源 AsA通过启动叶黄素循环增加胁迫下的热耗散能力，从而提
高植株的抗胁迫能力，其中 VDE对叶黄素循环的启动起到主要作用。
关键词： 欧李；AsA；干旱胁迫；叶黄素循环
中图分类号： S662.5 文献标志码： A 文章编号： 1003—8981(2012)01—0028—06
Xanthophyll cycle initiation: Exogenous ascorbic acid (AsA) alleviating
drought-induced stress in Cerasus humilis seedlings
SHANG Zhi-wei1, YIN Ze-peng1, SUN Meng-chao1, REN Jing2, SONG Xing-shun1
(1. College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China;
2. Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;)
Abstra ct: In order to provide theoretical guidance for improving stress tolerance of seedlings in Cerasus humilis, the
impact of exogenous ascorbic acid (AsA) on photosynthesis and xanthophyll cycle under drought stress was studied,
taking seedlings of C. humilis as materials. Furthermore, the biosynthetic mechanism of zeaxanthin (Z) was also
investigated by using inhibitor and molecular biology approaches. The results indicated that application of exogenous
AsA alleviated reduction of light saturation point, promoted generation of endogenous AsA, and increased Z content
in x anthophyll cycle, as conversion of violaxanthin (V) into antheraxanthin (A) and Z was promoted. AsA upregulated
expression of violaxanthin de-epoxidase (VDE), but had weak effect on expression of zeaxanthin epoxidase ( ZEP).
Dithiothreitol (DTT) could significantly inhibit de-epoxidation state, and glucosamine (Gla) had weak effect on it.
Exogenous AsA improved heat dissipation capacity under stress through initiaing xanthophyll cycle, so plant tolerance
was improved, in which VDE played a major role.
Key words: Cerasus humilis; AsA; drought stress; xanthophyll cycle
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2012.01.010
29第 30卷 经 济 林 研 究
在全球变暖为主要特征的气候条件下，极端
干旱气候频发已经引起科学界的广泛关注 [1]。干
旱是限制植物生长的重要环境因子，能够影响植
物地理分布并限制农作物的产量。水分是植物体
的重要组成部分，它几乎参与了植物所有的生理
生化过程 [2]。欧李 Cerasus humilis Bar极耐干旱，
能在坡度大、光照强的极干旱阳坡成活，具有防
风固沙的功效，同时又具有润肠通便，利水消肿
的药用功效。欧李果实中还含有各种对人体有益
的矿质元素，尤其是钙元素的含量比一般的水果
都高。因此欧李是集果、牧、药等多种用途为一
身的优良节水型树种。但是，在欧李幼苗扦插阶段，
外界环境因素对其影响较大，干旱、高盐、高温
等胁迫会影响欧李幼苗的正常生长。
研究发现，干旱胁迫会影响植物的光能转化
效率，导致植物光饱和点的下降，进而使过剩 光
能急剧增加，造成植物光合器官光抑制的发生，
严重时还会造成光合器官的破坏 [2]。植物在进化
过程中形成多种能够抵御胁迫的保护机制，其中
依赖于叶黄素循环的非光化学淬灭 (NPQ) 就是保
护植物光合机构免受过剩激发能破坏的机制之一。
然而，研究手段的限制是影响植株叶黄素循环脱
环氧化状态与胁迫关系深入探讨的重要因素。到
目前为止，还没有直接测定叶黄素循环中 2个关
键酶紫黄质脱环氧化酶 (VDE) 和玉米黄质环氧
酶 (ZEP) 活性的可靠方法。但近期的报道发现，
Glucosamine(Gla，葡糖胺 )等氨基糖类是 ZEP的
有效抑制剂 [3]；DTT( 二硫苏糖醇 ) 是 VDE的抑
制剂 [4]，利用 这些新的发现将为利用抑制剂间接
研究环境胁迫下 VDE、ZEP活性的变化以及两
者的互作提供了新的思路，同时结合此关键酶在
mRNA水平表达的研究，将能更为全面地揭示胁
迫下欧李叶黄素循环的响应。
抗坏血酸 (AsA) 可以作为叶黄素循环中紫黄
质去环化酶的辅助因子，在保护光合机构及光合
调节过程中起重要作用；AsA作为自由基消除剂，
也可以作为初级抗氧化物直接清除单线态氧、超
氧化物和羟自由基 [5]。近年来，越来越多的研究
表明，外源 AsA处理可以提高植株的抗逆性 [6]。
因此本研究中笔者用外源 AsA处理干旱胁迫下的
欧李幼苗，结合施用 VDE和 ZEP的靶向抑制剂，
进而在 mRNA水平考察这 2种酶的表达情况，从
不同角度研究 AsA对欧李幼苗的影响，以期从种
植角度为提高欧李幼苗植株耐逆性提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料和处理
本试验中选择温室培养的 3年生喇嘛沟门品种
欧李幼苗为材料。共设置 3种处理：1) 对照处理，
每日正常给幼苗浇清水至饱和；2) 干旱处理，干
旱处理开始至结束 (共 21 d) 均不给植株浇水；3)
外施 AsA处理，在干旱处理的基础上每隔 3 d对
每株幼苗叶片外施 1次 AsA(50 mL，5 mmol/L)。
干旱处理 21 d时，从干旱处理中挑选出部分植株
进行外施抑制剂处理，分别施以 200 mL的 H2O、
DTT(3 mmol/L)、Gla(0.5%) 及 DTT+Gla， 处 理
24 h后对叶片样品进行取材。D TT和 Gla分别是
VDE和 ZEP的抑制剂。每个处理至少 20棵植株，
共处理 28 d，第 22天开始复水解除胁迫，即正常
浇水至饱和。分别在处理过程中的第 0、7、14、
21和 28天对试材植株叶片样品进行各相关指标测定。
1.2 试验方法
1.2.1 光合指标的测定
采用 Ciras-2 型光合仪 (英国 PP-S ystems 公司
生产 )，于幼苗处理的时间点 9：00 ～ 11：30进
行光合指标的测定。每个处理至少选取 3片生长
一致的功能叶进行测定。
人工设置 18种不同光强(1 200、1 100、1 000、
900、800、700、600、500、450、400、350、300、
250、200、150、100、50、0 μmol•m-2s-1) 测定各功
能叶的净光合速率 (Pn)，用以制作光响应曲线。
1.2.2 荧光指标的测定
用 FMS2脉冲调制式荧光仪 (英国 Hansatech
公司生产 )测定荧光参数。每种处理选择 3株进行
挂牌标记作为标准株，每株选定至少 3片相同部
位受光一致的叶片，同样挂牌标记，以后每次都
测定相同的功能叶。暗适应荧光参数测定前，先
将叶片暗适应至少 30 min。
1.2.3 内源 AsA的测定
取适量叶绿体提取液，加入 5%的 偏磷酸提
取，15 000×g离心 15 min，取适量上清，加 PBS
和H2O，再加入显色液，10%的 TCA，44%的磷酸，
30 第 1期商志伟，等：叶黄素循环的启动：外源 AsA对欧李幼苗干旱胁迫的缓解
4%的一连吡啶，3%的 FeCl3，40 ℃ 反应 40 min，
离心除杂，525 nm处比色。
1.2.4 叶黄素组分的提取与测定
色素提取的全过程在暗处进行。取 0.3 g叶片
放入预冷研钵中，加 4 mL 85％丙酮、少许 CaCO3
和 SiO2，研磨至匀浆，再加入 1 mL 100％的丙
酮，匀浆 1 min，冰上静置 15 min，1 200×g离心
2 min，取上清，用 0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。
用高效液相色谱法分析叶黄素循环中紫黄质
(V)、单环玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)的含量。色
谱柱为 Spherisorb C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；
流动相 A液为乙腈和甲醇 (体积比 85︰ 15)，B
液为甲醇和乙酸乙酯 (体积比 68︰ 32)，流动速度
为 1 mL/min，检测波长为 445 nm[5]。
叶黄素脱环氧化状态用(Z+0.5A)/(V+A+Z)表示。
1.2.5 RT-PCR
对于 qRT-PCR，采用定量 PCR仪进行重复
样品的分析。使用 CTAB法提取总 RNA，之后对
RNA进行消化纯化处理。取纯化后的 5 μg RNA
进行反转录。PCR扩增体系如下进行 40个循环：
94 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，7 min。
基因的相对表达水平通过 2−ΔΔCT( 差异倍数 )
表现。CT( 循环阈值 ) 被定义为荧光信号所需的
到达设定阈值时所经历的循环数。CT水平与样品
中目标核酸总数成反比。ΔCT是对照基因产物
和目标基因产物 CT的差值。ΔΔCT=(ΔCTCK －
ΔCTWS )。
PCR反应分别应用下列引物：
actin - F(5′ -GTGAAGGCTGGGTTTGCT- 3′)，
actin - R(5′ - CCCATCCCAACCATAACA - 3′)，
VDE-F(5′ -GTGGGGAATTTGTCTTGGAG-3′)，
VDE- R(5′-AGGCTGATTTGGGTCTTGC-3′)，ZEP
- F(5′ - GGAAGAACTTGTTTGGAT - 3′)，ZEP - R
(5′- GGAATTAATGTCAGCAGG - 3′)。
2 结果与分析
2.1 不同处理欧李植株光合作用的响应曲线
图 1中是温室条件下测定的功能叶的净光合
速率与光合有效辐射的关系曲线。由图 1中可以
看出，3 个不同处理的净光合速率均会随着光合
有效辐射的增加逐渐增加，但当光合有效辐射增
加到一定程度时，净光合速率不再显著增加，并且
3 个不同处理的光饱和点的差异较大，对照、外施
AsA处理和干旱处理的光饱和点分别为 900、750
和 350 μmol•m-2s-1。同时，最大光合效率也有明显
差异，对照最高，外施 AsA处理次之，最低为干
旱处理。
D：干旱胁迫；D + AsA：干旱胁迫 +抗坏血酸。下同。
D: drought stress; D+AsA：drought stress +AsA. The same as below.
图 1 不同处理欧李叶片净光合速率的光响应曲线
Fig. 1 Response of net photosynthetic rate in C. humilis
to light intensity under different treatments
2.2 持续干旱对欧李叶片相对含水量和内源 AsA
的影响
图 2中显示的是持续干旱处理下欧李植株相
对含水量 (LRWC)和内源 AsA的变化。从图 2中
可以看出，对照植株 LRWC相对稳定，水分胁迫
下，干旱处理和 AsA处理植株 LRWC随着处理时
间的延长呈现出不同程度的下降，在干旱处理第
21天时出现最低值，AsA处理的 LRWC显著高于
干旱处理。复水后干旱处理与 AsA处理的 LRWC
均有所上升 (见图 2A)。关于内源 AsA，对照植株
的 AsA含量相对稳定，干旱处理和 AsA处理植株
的内源 AsA均会随着干旱处理时间的延长呈现不
同程度的增加，在第 21天达到最大。与对照相比，
AsA处理增加了 93.6%，干旱处理增加了 65.6%。
复水后干旱处理与外施 AsA的内源 AsA含量均降
低，但未恢复到对照水平 (见图 2B)，AsA处理始
终高于干旱处理。
2.3 持续干旱对欧李非光化学淬灭系数和叶黄素
脱环氧化状态的影响
图 3中显示的是持续干旱处理下欧李植株非
光化学淬灭系数 (NPQ) 和叶黄素脱环氧化状态的
净
光
合
速
率
P n

/ (
μm
ol
·m
-2
s-1
)
模拟光辐射 PAR / (μmol·m-2s-1)
31第 30卷 经 济 林 研 究
变化。从图 3A中可以看出，植株的 NPQ随着水
分胁迫时间的延长而明显上升，在处理持续 21 d
时，干旱处理与对照植株相比升高 44.9%，AsA处
理升高 23.7%。虽然在复水期间NPQ值有所降低，
但处理组仍然高于对照水平。由图 3B可知，在胁
图 2 不同处理对欧李叶片叶片相对含水量 (A)和内源 AsA含量 (B)的影响
Fig. 2 Response of LRWC (A) and AsA content (B) in C. humilis to different treatments
2.4 持续干旱后抑制剂对欧李植株叶黄素循环的影响
图４中显示的是干旱处理 21 d外施DTT和Gla
处理后叶黄素循环脱环氧化状态的变化。DTT在干
旱胁迫下显著抑制了叶黄素脱环氧化作用，Gla对叶
黄素脱环氧化作用无显著影响，而外源AsA可显著
提高叶 黄素脱环氧化作用。
2.5 持续干旱对欧李植株叶黄素循环关键酶的影响
图 5中显示的是持续干旱处理对欧李叶片
VDE(A) 和 ZEP(B) 表达水平的影响。由图 5可
图 3 不同处理对欧李叶片 NPQ (A)和叶黄素脱环氧化状态 (B)的影响
Fig. 3 Response of NPQ (A) and xanthophyll de-epoxidation state (B) in C. humilis to different treatments
迫条件下，植株叶黄素循环的脱环氧化状态与对
照植株相比逐渐升高，AsA处理能更好地启动叶
黄素循环，胁迫 21 d后 AsA处理达到 0.46，干旱
处理达 0.36。复水 7 d后各胁迫植株的叶黄素脱环
氧化水平仍然高于对照植株。
知，在水分胁迫过程中 VDE基因的表达呈现平稳
上升，处理第 21天时达到最大，AsA处理能有效
地提高 VDE的活性，AsA处理较对照上升 2.12倍，
干旱处理上升 1.75倍。在复水 7 d后，胁迫植株
和对照植株的 VDE的表达情况仍略有差别 (见图
5A)。然而，在干旱胁迫下 ZEP的表达呈下降趋
势。在胁迫过程中ZEP的转录丰度处于较低水平，
AsA处理和干旱处理无显著差别。在处理 21 d
后，AsA处理植株的 ZEP转录水平仅为对照植株
32 第 1期商志伟，等：叶黄素循环的启动：外源 AsA对欧李幼苗干旱胁迫的缓解
的 41.5%，干旱处理为 34.3%。复水 7 d后，均基
本恢复到对照水平。
3 讨 论
迄今为止，关于外施 AsA对叶黄素循环的影
响并结合代谢抑制剂和 RT-PCR的手段来研究叶黄
素循环的报道甚少。本研究中结果表明，持续干旱
胁迫使欧李幼苗的光饱和点下降，导致植株固碳能
力下降，但外施 AsA会缓解光饱和点的降低，使
植株在很大程度上避免因为干旱胁迫造成的固碳
能力与生产潜力的降低 (见图 1)。由于最大净光
合速率是反映植物光合作用能力的 重要指标，而其
又由叶片中光合酶活性 (RuBP) 的差异决定 [7]，因
此外施 AsA对固碳能力的维持可能归因于 AsA对
RuBP酶活性的诱导。
在持续干旱胁迫下，欧李植株的 LRWC显著
续干旱使 NPQ明显升高 (见图 3A)，表明干旱胁
迫下过剩的光能以热耗散的方式散失，这种耗散
方式是水分胁迫下避免光抑制的光保护机制 [9]。
许多研究表明，热耗散与叶黄素循环的去激发密
切相关，即 NPQ与叶黄素脱环氧化水平呈线性正
相关。水分胁迫使叶黄素脱环氧化水平增高 (见
图 3B)，外施AsA可促进叶黄素循环的脱环氧化，
使叶黄素循环中 Z的生成量增多，这可能是由于
AsA能够促进叶黄素循环中 V的脱环氧化，使 Z
增多，进而增加植物的 NPQ [10]，使植株更好地启
动热耗散机制，将过剩的光能散失掉而免受光抑
垂直虚线表示植物恢复到对照条件。The vertical dashed line indicates that plants have been transferred to the control conditions.
图 5 不同处理对欧李叶片 VDE(A)和 ZEP(B)表达水平的影响
Fig. 5 Response of expression level of VDE (A) and ZEP (B) in C. humilis to different treatments
D + H2O：干旱胁迫 +蒸馏水；D + DTT：干旱胁迫 +二硫苏糖
醇；D + Gla：干旱胁迫 +葡萄糖苷；D + DTT + Gla：干旱胁迫 +二硫苏
糖醇 +葡萄糖苷。“*”表示对照和干旱处理之间存在统计学显著性差异
(P <0.05)。D+H2O: drought stress + distilled water; D+DTT: drought stress +
dithiothreitol; D+Glu: drought stress + glucosamine (Gla)；D + DTT + Gla：
drought stress + dithiothreitol + glucosamine. “*” indicates statistically signifi cant
differences (P<0.05) among the different treatments.
图 4 干旱处理 21 d后抑制剂对欧李叶片中叶黄素
脱环氧化状态的影响
Fig. 4 Response of xanthophyll de-epoxidation state
in C. humilis to inhibitors after 21 day under
drought treatments
下降 ( 见图 2A)，但在复水阶段迅速恢复，这表
明欧李植株具有迅速恢复的能力。如图 2B显示，
持续水分胁迫导致内源 AsA明显增加，且外施处
理明显高于干旱处理。由于 AsA作为抗氧化剂，
其本身可直接消除活性氧，外源 AsA又可增加
原生质中抗氧化酶的活性，可以提高原生质体的
活力，因此，在胁迫条件下植物体通过增加内源
AsA的量来使胞内物质和膜系统受到保护。
NPQ反映了植株从暗适应到光适应转变过程
中叶绿素荧光的非光化学淬灭 [8]，是用来衡量叶
黄素循环耗散多余激发能的指标。研究发现，持
33第 30卷 经 济 林 研 究
制的伤害。这与 Venema[11]等在胁迫条件下通过增
加Z的合成可以降低光抑制的程度的结果相一致。
在本研究中，首次将抑制剂和 qRT-PCR技术
结合在一起来评估干旱胁迫下 VDE 或 ZEP催化
Z形成的水平。如图 4所示，DTT明显抑制叶黄
素脱环氧化水平，Gla抑制作用不明显，说明在水
分胁迫下，VDE是催化 V形成 Z的关键酶，这与
North等 [12]分析干旱胁迫下 VDE在拟南芥中的作
用的研究结果相符，与 ZEP相比 VDE对叶黄素循
环的启动起到主要作用。并且 AsA明显促进脱 环
氧化状态，再次说明 AsA可促进叶黄素循环中 V
向 Z的转化。与抑制剂对VDE和 ZEP的作用相比，
在水分胁迫过程中，VDE的转录水平呈现平稳的
上调，ZEP下调 (见图 5)，表明它们是在转录后
水平的调控 [13]。
4 结 论
综上所述，干旱胁迫下，外施抗坏血酸 (AsA)
缓解了欧李叶片光饱和点的降低，也缓解了叶片
相对含水量降低的程度，促进内源 AsA的增加，
促进叶黄素循环中玉米黄质 (Z) 的生成，提高紫
黄质脱环氧化酶 (VDE)的活性，从而使欧李植株
的热耗散能力有所增加，这使植物的光合机构免
受干旱胁迫的伤害，这样可以赋予植株更好的光
保护的能力和在恶劣环境下生存的能力。
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[本文编校：闻 丽 ]