全 文 ：热带亚热带植物学报 2004，12(5)：435—439
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)[1t绿体
psaA基因片段的序列分析
杨泽民 ，章 群 ，谢数涛 ，韩博平 ，吕颂辉 ，Hodgk i S S2
(1．暨南大学水生生物研究所，广东广州 510632：2．香港大学生物多样性系，香港)
摘要：根据 GenBank中检索到的南极棕囊藻(Phaeocystis antarcticn)psaA基因序列设计 psaAL和psaAR引物，对球形
棕囊藻(Phaeocyst~globosa)的psaA基因片段进行 PCR扩增并测序，获得了 629 bp的DNA序列。应用 ClustalX对球
形棕囊藻 P1、P2株系和南极棕囊藻的psaA基因片段序列进行比对，结果表明，球形棕囊藻psaA基因片段序列无插入
／缺失，核苷酸差异率为 3．34％。应用 DNAstar分析软件推断球形棕囊藻和南极棕囊藻的psaA基因对应的氨基酸序列
和 RNA二级结构，发现它们的氨基酸序列差异不大，序列中 209个氨基酸只有 1个发生了变化，其氨基酸变异率为
0．48％；除部分结构域比较相似外，RNA二级结构上体现一定程度的差异，这可能对棕囊藻的分子分类研究有参考价
值。因所获得的psaA基因片段序列及氨基酸序列具有种的极端保守性，不适宜用作 Phaeocyst~属种间的分子分类研
究。
关键词：球形棕囊藻；南极棕囊藻；psaA基因：DNA序列；氨基酸序列：RNA二级结构；藻类
中图分类号：Q949．261 文献标识码 ：A 文章编号：1005—3395(2004)05—0435—05
Sequence Analyses of Chloroplastic psaA Gene
Fragment from Phaeocystis globosa
YANG Ze-min ， ZHANG Qun ， XIE Shu．tao ，HAN Bo．Ping ， ELi Song．hui ， Hodgki S S
(1．Institute ofHydrobiology,Jino~t University，Guangzhou 510632，China；2．Department ofBiology Diversity,Hongkong University，Hongkong)
Abstract： Based on the complete psaA gene sequence of Phaeocyst~antarctica in GenBank，two primers psaA L
and psaA R were designed to amplify psaA gene sequence fragment of Phaeocyst~ globosa． An unambiguous
sequence of 629 bp was gained，which was align ed with the complete psaA gene of Phaeocystis an tarctica in
Clustal X． The corresponding nucleotide dissimilarity of the tw o sequences was only 3．34％ ， and no insertion／
deletion was found． The relative amino acid sequence and RNA secondary structure were concluded in DNAstar．
The concluded amino acid sequence was also conservative，and there was only one distinct base among 209 amino
acids，with the diference of 0．48％ ．However，the concluded RNA secondary structures were quite unlike，apart
from a few conservative domains． Perhaps the secondary structure of RNA may benefit the study on taxonomy of
Phaeocysitis．It iS considered that the DNA sequences and amino acid sequences ofpsaA are conservative．which iS
unadvisable to use for molecular interspecific classification ofthe genus Phaeocysit~．
Key words：Phaeocysit~ globosa,．Phaeocysitis an tarctica；psaA：DNA sequence；Amino acid sequence；Secondary
structure of RNA：Algae
棕囊藻属(Phaeocystis)隶属定鞭金藻纲(Prym．
nesiophyceae或 Haptophyceae)，是有害赤潮藻，能产
生二甲基硫化物 (DMS)和溶毒素等有害物质，给
海洋水产业、海洋生态环境和自然景观造成严重的
破坏。从 1997年 10月至 1998年 2月我国东南沿海
首次爆发大规模棕囊藻赤潮以来，1999年 7月在饶
收稿 日期 ：2004-03一l0 接受 日期 ：2OO4一O6一O4
基金项目：国家自然科学基金(4OlO6Ol4)；广东省自然科学基金(00O760)资助
}通讯作者 Corresponding author
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436 热带亚热带植物学报 第 12卷
平、南澳等海域再次爆发了棕囊藻赤潮W4]。近年来棕
囊藻赤潮爆发的频率有加快的趋势，规模也不断扩
大。以前作为温带和寒带海域的优势种球形棕囊藻
( globosa)[51目前正不断地向热带和亚热带扩散，
2003年 8月和 12月在广东饶平和珠海相继发生了
两次赤潮，给我国沿海养殖业造成严重的危害。
棕囊藻由于具有复杂的异型生活史【l46J，且形体
微小、地理差异显著，缺少可靠而有效的鉴别特征，
种类鉴定困难 。棕囊藻属一般分为 6种 ：P
pouchetii、P globosa、P antarctica、P cordata、P
scrobiculata、 ahnit ，并且新的命名还在不断出
现。由于棕囊藻分类的混乱，严重影响了信息和情
报交流，给赤潮的预测和相关研究带来了困难。
随着分子标记技术的发展，DNA分子是区分不
同类群的有效手段。目前应用于棕囊藻分子分类的
DNA序列有 ITS、 18S rRNA、 28S rRNA、 5．8S
rRNA、rbcL等，但都不很理想。叶绿体psaA基因是
编码光反应中心蛋白A的基因，中心蛋白A因其
能结合反应中心色素 P彻，故又称 P铷脱辅基蛋白，
它是由叶绿体基因组编码的，位于大单拷贝区中
央。Hwan等[71曾在研究psaA基因的系统发育时对
南极棕囊藻 antarctica)的 psaA基因序列有过报
道，但有关球形棕囊藻的psaA基因研究还未见报
道。本文报道球形棕囊藻 P1株和 P2株的psaA基
因序列，并将其与南极棕囊藻的psaA基因序列进
行比较，希望能找到一种有效的分子分类标准，以
便为棕囊藻的分子分类和鉴定提供理论依据。
1材料和方法
藻种来源 球形棕囊藻 (Phaeocystis globos
P1株和 P2株由香港大学生物多样性系藻种室提
供，采 白香港将军澳水域。
DNA的提取 采用改良的CTAB(十六烷基
三甲基溴化铵 Cetyltrimethylammonium bromide)法
进行 DNA提取。取少量藻液加入 300 trl CTAB和
1％的蛋白酶 K，50℃水浴 3 h，加入等体积的氯仿与
异戊醇(24：1)抽提两次，在上清液加入 5 1的玻璃
粉，静置 15—30 min，加 3倍体积的 Ultra—SepTM
Binding Bufer(Ultra—Sep Gel Extraction Kit—Omega)，
摇匀放置 15—30 min，10 000xg离心 10 min沉淀
DNA，沉淀物用 DNA Wash Bufier(Ultra—Sep Gel
Extraction Kit—Omega)500 pA冲洗两次，室温晾干，
加40 1 AE溶液(Ac／EDTA缓冲液)溶解 1 h以上，
离心去沉淀，DNA在 一20℃保存备用。
psaA基因的扩增 引物 psaAL：5，_TGGA
TTAGTCAAGCATATTTCCACGGTGC一3’：psaA R：
5，_AGCATTTGGAGCAGTATTACCTGGAGC一3’。
PCR反应在UNO I Biometra仪(德国Biometra产)上
进行，20 1反应体系中含 10xExTaqBufer(Takara)
2．0 1，dNTP (Takara)1．5 1，引物为 0．8 i~mol／L，
DMSO 1．5 1，Ex Taq polymerase(Takara)0．4 U，1 1
模板 DNA，灭菌蒸馏水。PCR反应条件为：95℃变
性 4 min；然后 29个循环，每个循环为：95℃30 S，
58℃45 S，72℃ 1 min，最后 72℃延伸 10 min。PCR
扩增产物用 1％的琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭
Ethidium Bromide)染色，在 2F一90型暗箱式紫外透
射仪下观察。
采用 PCR产物直接测序 ，引物 为 psoAL和
psaAR。序列分析在上海博亚公司PE ABI PRISM
377 DNA 自动测序仪上进行。
数据分析 将实验测得的序列与从 GenBank
获得的南极棕囊藻psaA基因序列用 Clustal X软件
进行 比对。用 DNAstar软件包推 断基 因片段 的
RNA二级结构。
2结果和讨论
2．1 DNA 的提 取
本实验采用 了改进的 CTAB法提取 DNA，获
得了较好的结果，PCR扩增出来的条带亮且整齐，
可能是棕囊藻能够形成囊状群体，细胞外周有一胶
质层，含有较多的糖类次生物质，在加入 CTAB裂
解细胞时加入少量的蛋白酶 K有助于细胞的裂解
和 DNA的释放，其次，在经过醇的抽提后，不是用
盐直接沉淀，而是与试剂盒里的玻璃粉结合以纯化
DNA，这样得到的 DNA较纯，对以后的PCR反应
干扰较少，有助于产量的提高。同时本方法未使用
有毒物质酚，这样沉淀 DNA时可大大节约时间，且
对藻的量要求不高。因此，本实验方法对次生物质
含量比较多且量较少的藻类和细菌的 DNA提取可
能是一种比较理想的方法。
2．2 psaA基因比较
DNA序列比较 经 PCR扩增后测序表明，
球形棕囊藻P1株和 P2株的psaA基因序列完全相
同(图 1)，无任何碱基替换，其中球形棕囊藻 Pl序
列有 516 bp，P2序列有 629 bp，这说明从香港海域
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第5期 杨泽民等：球形棕囊藻(Phaeocystis globo~a)叶绿体 psaA基因片段的序列分析 437
不同地理环境中分离出的球形棕囊藻 Pl株和 P2株
的psaA基因序列非常保守。由此，针对球形棕囊藻
P2的psaA序列，我们在 GenBank中采用BLAST进
行搜索，发现同源性最高的南极棕囊藻ps 基因序
~IJ(AY1 19720)，把它们的序列用Clustal X软件比对
后得到 629 bp的有效可比序列 (图 1)。再应用
DNAstar分析，结果显示球形棕囊藻 P2的碱基含量
为：A(169)26．91％、C(108)17．20％、G(135)21．50％、
T(216)34．39％，A+T含量为 61．31％，C+G含量为
38．69％；南极棕囊藻的碱基含量为：A(172)27．39％、
C(103)16．40％、G(132)21．02％、T(221)35．19％，
A十T含量为 62．58％，C+G含量为 37．42％。两者 A、
T含量都明显高于G、C含量。大量实验证明线粒体
中基因碱基 A、T含量高于 G、C含量 0】，本实验显
示叶绿体中psaA基因的碱基含量也具有类似的特
点。在分析psaA基因的密码子时还发现其密码子第
二位和第三位上是A或T的比例都在 60％以上，这
与高等植物叶绿体psaA基因和其他基因表现出高
度的一致性⋯1。psaA基因A、T含量高可能与其本身
Pl
P2
P antarct a
Pl
P2
it,antarct a
Pl
P2
it,antarct a
Pl
P2
it,antarctica
Pl
P2
it,antarct a
Pl
P2
it,antarctica
Pl
P2
P antarct1’,Ca
的表达有关，Linkt 2】和Gilmartin等【I3】研究发现psaA
基因受光敏色素介导，在转录水平上受光的调控，
而其A、T含量高，则自由能相对较低，从而更能迅
速对环境的变化做出反应，这也是生物进化的一种
表现。
由两个序列比对结果可以看出，球形棕囊藻 Pl
株和 P2株的psaA基因序列间无插入／缺失；核苷
酸差异数为 21，核苷酸差异率为 3．34％，其中 16个
位点为转换 (C—T转换 l2个，A—G转换 4个)，5个
位点为颠换 (A—T颠换 1个，G—T颠换 4个)。核苷
酸差异率明显大于两者在编码 PS I的光反应中心
DI蛋白 -psbA基因 (1．88％)中的差异 (待发表)，
但 由于对psaA基因所获得的序列不完全，其是否
适合用于棕囊藻种上水平的分子分类分析，还需进
一 步的研究。
氨基酸序列比较 GenBank中检索到的南极
棕囊藻psaA完整基因序列已经包含起始密码子，
所 以我们可 以容易得到开放读框 (ORF)。选用
GenBank中细菌和植物质粒密码子表，将球形棕囊
一 TGGTGTTCAAGTTACATCTGGTTTCTTTGAACTTTGGAGAGcTGCAGGTATTACTAATGA从 CTGAGTTGTACTGGACTGcGATGGGTG
TCTGGTGTTCAAGTTACATCTGGTTTCTTTGAACTTTGGAGAGcTGcAGGTATTACTAATGA从 CTGAGTTGTACTGGACTGCGATGGGTG
TCTGGTGTTCAAGTTACATCTGGTTTCTTTGAACTTTGGAGAGcTGCAGGTATTACTAATGA从 CTGAGTTATACTGGACTGCGATGGGTG
CTTTAGGAATGTCGGCATTAATGGTCTTCGCCGGTTGGTTCCATTACCATA从 GcAGCACCA从 GcTTGAATGGTTCCAGAATGTTGAG
CTTTAGGAATGTCGGcATTAATGGTCTTCGCCGGTTGGTTCCATTACCATA从 GcAGcACCA从 GcTTGAATGGTTCCAGAATGTTGAG
CTTTAGGAATGTCAGCATTAATGGTCTTTGCCGGTTGGTTCCACTACCACA从 GCAGCACcAAAGCTTGAATGGTTCCAJ ATGTTGAA
木木木木木 木木木木木木木木
TCAATGATGAACCATCATTTAGcTGGTTTATTAGGTTTAGGTTGTTTATCTTGGTCAGGGCACCAGATTCATATCAGTCTTCCTATTAAT
TCAATGATGAACCATCATTTAGcTGGTTTATTAGGTTTAGGTTGTTTATCTTGGTCAGGGCACCAGATTCATATCAGTCTTCCTATTAAT
TCAATGATGAATCATCATCTAGcTGGTTTATTAGGTTTAGGTTGTTTATCTTGGTCAGGGCACCAGATTCATATCAGTCTTCCGATTAAT
木木木木木木木木木木木 木木木木木木 木木木木木木
AAGTTATTAGATGcTGGTGTAGCTCCGcAAGAGATTCCATTACCTCACGAGTTATTATTCAACCAAGATTTAATGGCCCAGCTTTATCCA
AAGTTATTAGATGcTGGTGTAGCTCCGCAAGAGATTCCATTACCTCACGAGTTATTATTCAACCAAGATTTAATGGCCCAGCTTTATCCA
AAGTTATTAGATGcTGGTGTAGcTCCGCAAGAGATTCCATTACCTCATGAGTTATTATTCAACCAATATTTAATGGCTCAGCTTTATCCT
木木木木木木木木木木 木木木木木木木木木木木
AGTTTTAAGA从 GGATTACTTCCATTTTTTACACTA从 CTGGAGTGAGTATTCTGATTTCTTAACTTTTA从 GGTGGTTTA从 CCCAATTA
AGTTTT从 GAAAGGATTACTTCCATTTTTTACACTA从 CTGGAGTGAGTATTCTGATTTCTT从 CTTTTAAAGGTGGTTTAAACcC从 TTA
AGTTTTAAGA_AAGGATTACTTCCATTTTTTACACTA从 TTGGAGTGAGTATTCTGATTTCTTAACGTTTA从 GGTGGTTTA从 CCCAATTA
CAGGTAGTTTATGGTTAACTGATCAGGCACATCATCACTTAGCTCTTGCGGTCTTATTTATTTTTGC
CAGGTAGTTTATGGTTAACTGATCAGGCACATCATCACTTAGCTCTTGCGGTCTTATTTATT~TTGCTGGCCATATGTACCGCACA从 T
CAGGTAGTTTATGGTTAACTGATCAGGCACATCATCATTTAGCTCTTGCGGTTTTATTTATTTTTGCTGGTCATATGTACCGTACA从 T
TGGAGTATCGGTCATAGTATGA从 GAGATTCTAGAAGCTCATAAGGGTCCACTAACTGGTGAAGGTCACA从 GGTTTATTTGAGATTT
TGGAGTATCGGTCATAGTATGA从 GAGATTCTAGAAGCTCACAAGGGTCCACTAACTGGTGAAGGTcACA从 GGTTTATTTGAGATTT
图 l球形棕囊藻Pl、P2与南极棕囊藻psa,4基因序列比对
Fig．1 psaA gene sequences alignment ofP．gtobosa PI，P2，and antarctica
“．，’表示三者序列碱基相同，空格表示有差异，“一”表示碱基缺失Asterisk,space
and short dash indicate base identical，difereat an d absent，respectively．
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438 热带亚热带植物学报 第 12卷
藻 P2 psaA基因DNA序列转化为相应的氨基酸序
列 ，用 BLAST的 CD(conserved domain)搜索氨基
酸序列，发现在位点 67—76之间有各种生物 psaA
基因共有的富含L(5／10)的保守结构域。将球形棕
囊藻 P2与南极棕囊藻(AAM62028)的氨基酸序列
用 ClustalX比对后(图21，可以看出，在 209个氨基
酸序列中只有 1个发生了变化，氨基酸变异率为
0．48％。在 21个碱基替换中，大部分碱基变化发生
在密码子的第三位上 (18个)，由于密码子的兼并
性没有引起氨基酸的变化，仅有 3个碱基替换发生
在密码子的第一位上 ，并且只有一个碱基的替换
(位点 337)引起 了氨基酸的变化 (D—Y)，在氨基
酸序列中的第 1 13个氨基酸上球形棕囊藻 P2为不
带电的天冬氨酸 (D)，南极棕囊藻为带负电的酪氨
酸 (Y)。这种差异可能与其生活的环境有着密切的
关系，球形棕囊藻 P2主要生活在温带和亚热带的
水域中，光照较强，光合作用也较活跃，其最佳生长
温度为 25℃，而南极棕囊藻则仅分布在南极水体中，
其最佳生长温度为4．5℃，光合作用也相对较弱【5l。
从球形棕囊藻 P2和南极棕囊藻的氨基酸序列
比较可以看出，氨基酸作为基因的表达产物和功能
的执行者，其序列更加保守，这也从另一方面证明
了psaA基因可能不适合用于棕囊藻种间水平的分
子分类研究。
2．3 棕囊藻psaA基因 RNA二级结构的分析
应用 DNAstar软件包，根据获得的基因片段推
断其 RNA二级结构(图 3)，由图可知，由于球形棕
囊藻 P2与南极棕囊藻psaA基因的碱基差异分布比
较分散，其RNA二级结构总体差异较大，但是球形
P2 SGVQVTSGFFELWRAAGITNETELYWTAMGALGMSALMVFAGWFHYHKAAPKLEWFQNVESMMNHHLAGLLGLGCLSWSGHQIHISLPINKLLDAGVAPQEIPLPH
P antarctica SGVQVTSGFFELwRAAGITNETELYwTAMGALGMSALMVFAGwFHYHKAAPKLEwFQNVESMMNHHLAGLLGLGCLS~SGHQIHISLPINKLLDAGVAPQEIPLPH
半半半半半半半年半半半半半半半半年半年半年半半半年半年半
P2 ELLFNQDLMAQLYPSFKKGLIJPFFTLNwSEYSDFLTFKGGLNPITGSLWLTDQAHHHIJALAVLFIFAGHMYRTNwSIGHSMKEILEAHKGPLTGEGHKGLFEI
P antarctica ELLFNQYLMAQLYPSFKKGLLPFFTLNWSEYSDFLTFKGGLNPITGSLWLTDQAHHHLALAVLFIFAGHMYRTNWSIGHSMKEILEAHKGPLTGEGHKGLFEI
术术术术术术 术术半术术术术术术术术术术术半术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术术半术术术术术术术术术术术木术术术术术术术术
图 2球形棕囊藻 P2和南极棕囊藻psoA基因编码的肽链氨基酸序列比对
Fig．2 Alignment ofamino acid sequence coded by amplifiedpsaA gene fragments of P globosa P2 and P antarctica
“ ’表示两序列氨基酸相同，空格表示有差异 Asterisk and spacesindicate amino acidindentical and diferent，res自ectively．
麓 谴 ≮麓 ≯ 。=一
∞
≤
．
一
P ·an fa rc f，c a 器 ；冀
图3球形棕囊藻P2和南极棕囊藻psoA基因 RNA二级结构
Fig．3 The RNA secondary st兀Ictures ofP．globosa P2 and P antarctlcapsoA gene
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第 5期 杨泽民等：球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)叶绿体 psaA基因片段的序列分析 439
棕囊藻P2的6、7、8茎环结构与南极棕囊藻的5、6、7
茎环结构域却表现出非常明显的相似性(图 3)，并且
球形棕囊藻P2与南极棕囊藻富含 L(5／lO)的保守结
构域 (位点 198—228)分别在 6、8和 5、7茎环中，其
分布也非常相似，可见这一保守结构域不仅在蛋白
质结构上保守，而且在其 RNA二级结构上也非常
保守。同时，也显示了不同种、不同地理环境下的棕
囊藻，其 RNA二级结构也表现出明显的差异性，这
与王见杨等【“】、Irina等【 】报道的家蚕微粒子病原虫
和多核巨变形虫具有相同的结果。
综合 DNA序列、氨基酸序列分析，我们认为
psaA基因DNA序列不适宜用作棕囊藻种间水平的
分子分类研究，但其 RNA二级结构对于棕囊藻的
分子分类分析有较好的参考价值。
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