全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，l4(5)：427—432
Journal oyTropical and SubtropicalBotany
二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素 a、
蛋白质、DNA含量的影响
刘洁生 ，杨维东， 张 珩，吴 彦
(暨南大学生物工程学系，广州 510632)
摘要：分析了二氧化氯 (1．0、1．5、2．0、2．5 mg L一，作用 96 h：2．5、6．0、8．0、l6．0 mg L一，作用 60 min)对球形棕囊藻叶绿素
a、蛋白质含量、氨基酸组成、核酸含量的影响，用透视电镜对二氧化氯(0．5 mg L-，0．8 mg L-)作用 24 h后藻细胞形态的
变化进行了观察，以探讨二氧化氯去除赤潮藻的机理。结果表明，二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素 a、蛋白质、DNA的含
量均有影响。实验各组 (1．0—2．5 mg L 。，2．5—16．0 mg L )球形棕囊藻的叶绿素 a、蛋白质、DNA的含量均显著低于对
照。二氧化氯浓度超过 2mgL 时，球形棕囊藻的叶绿素 a、蛋白质、DNA的含量持续降低，氨基酸相对含量发生明显
变化；半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸等的相对含量明显降低，而组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸则明显增加。当-氧化氯 (2．5—
16．0 mg L )作用 3 min后，DNA漏出率在 l3％一l8％之间；电镜观察发现，二氧化氯可使细胞膜破损，引起内容物外
泄。这些结果显示，二氧化氯能以单分子形式进入细胞，引起叶绿素、蛋白质结构的变化，并破坏藻细胞膜系统，最终导
致藻细胞死亡。
关键词：球形棕囊藻；赤潮；二氧化氯：细胞形态
中图分类号：Q948．85 文献标识码：A 文章编号：l005—3395(2006)05—0427—06
Efects of Chlorine Dioxide on Contents of Chlorophyll a，
Proteins and DNA in Phaeocystis globosa
LIU Jie-sheng ， YANG Wei—dong， ZHANG Heng， WU Yan
(Department of Biotechnology,3inaa University,Guangzhou 5 1 0632，China)
Abstract：Folowing the low dose of chlorine dioxide(1．0、1．5、2．0、2．5 mg L )treatment of Phaeocystis globosa
for 96 h and the high dose(2．5、6．0、8．0、16．0 mg L。)treatment for 60 min，the contents ofchlorophyl a，proteins，
amino acids an d DNA in cells were determined． Meanwhile， changes in cel morphology after 24 h treatment of
chlorine dioxide (0．5 mg L一， 0．8 mg L ) was observed by transmission electron microscope． Contents of
chlorophyll a， proteins and DNA in the treated P globosa were lower than those in controls． In the present of
chlorine dioxide over 2．0 mg L～，chlorophyll a，proteins，DNA in content and cysteine，tyrosine，lysine in relative
percentage remarkably decreased， whereas histidine， valine and phenylalanine in relative percentage increased．
The leakage rate ofDNA was in the range of 13％一18％ after treated with chlorine dioxide of2．5—16．0 mg L一 for
3 min．We observed that the substance damaged the cell membran es，causing the leakage of cellular content．These
results suggested that chlorine dioxide might deform chlorophyll a and proteins in P globosa by single molecular
difusion，damage the cell membrane system by lipid peroxidation，and eventualy led to the death of cells．
Key words：Phaeocystis globosa；Red tide；Chlorine dioxide；Cel morphology
收稿 日期 ：2005—12-26 接受 日期 ：2006—07—10
基金项目：国家重点基础研究发展规划 973项目(2OOlcB4O97lO)：广东省科技计划项目(2004B20501007)资助
通讯作者 Coresponding author
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热带亚热带植物学报 第 14卷
作为氧化型杀生剂，二氧化氯已广泛应用于渔
业生产、工业水处理、食品加工、自来水、蔬菜水果
和肉食水产品的防霉保鲜等领域，其对细菌等微生
物的抑制和杀灭机理多有研究[1_2J。以前我们的研
究[3J发现，二氧化氯能显著抑制赤潮藻一球形棕囊藻
的生长，本研究将通过对二氧化氯对球形棕囊藻叶
绿素 a、蛋白质、DNA含量的影响研究，进一步探讨
其对赤潮藻的杀灭机理。
1材料和方法
1．1藻 种
实验用球形棕囊藻汕头株 (Phaeocystis globosa，
ST strain)由暨南大学水生研究所藻种室提供，1 997
年 7月采 自饶平海域。置于温度为 20~1℃，光照强
度为 54 mo1 m。s。，光暗 比为 12 h：12 h的 LRH一
250一GS型光照人工气候培养箱中培养。培养基为
33％。的人工海水配成的 f／2培养基。
1．2叶绿素 a与蛋白质含量的测定
取指数增长期球形棕囊藻液 200 ml(藻密度为
1．18x10a cels L )，依实验要求加入一定量的二氧
化氯母液。低剂量组，二氧化氯终浓度分别为 1．0、
1．5、2．0、2．5 mg L。，作用 0、24、48、72、96 h；高剂
量组 ，二氧 化 氯终 浓度 分 别为 2．5、6．0、8．0、
16．0mgL。，作用 3、6、15、30、60min。取作用后的
藻液 5 m1，加入 5 g L。硫代硫酸钠反应 10 min。
3 300 xg离心 20 min，去上清液。收集藻细胞用于蛋
白质和叶绿素a含量的测定。
叶绿素 a含量的测定 向离心管加入 5 m1
80％丙酮，置 4"C冰箱静置 24 h。室温下解冻，以
3 300 xg离心 10 min；上清液测定 OD63、OD645(空
白为 80％丙酮)。叶绿素 a含量用以下公式计算：
C a(mg L 1=12．70D63—2．690D645。
蛋 白质含量的测定 加入磷酸缓冲液 ，
JY92一II超声波细胞破碎仪(浙江宁波新芝生物科技
股份有限公司)破碎后用磷酸缓冲液定容。采用考马
斯亮蓝 G一250(Ultra Pure Grade，上海华舜)法测定蛋
白质含量，以结晶牛血清白蛋白BSA(Biotechnology
Grade。上海华舜)为标准品绘制标准曲线。蛋白质含
量用 mg L 表示。
1．3氨基酸含量的测定
取指数增长期的球形棕囊藻 1 000 ml，依实验
要求加入一定量的二氧化氯母液，使二氧化氯终浓
度为2．0 mg L～。作用 24 h后，3 300 xg离心 20 min。
将藻细胞移至 10 ml离心管 中，用蒸馏水洗涤 ，
3 300xg离心 20 min(3次)。收集藻细胞置 6O℃烘
箱干燥过夜。氨基酸含量的测定采用 Waters高效液
相色谱，PICO．TAG氨基酸分析柱。在 38℃，流速
1 mlmin。，254 nm波长下进行。
1．4 DNA含量的测定
以小牛胸腺 DNA fSigma)为标准，绘制标准曲
线。取指数增长期的球形棕囊藻400 ml，依实验要
求加入一定量的二氧化氯母液。使二氧化氯终浓度
分别为 1．0、1．5、2．0、2．5 mg L～。作用 0、24、48、72、
96 h后取 50 ml藻液 3 300xg离心 20 min，去上清
液。加入蒸馏水 15 m1，超声波破碎仪破碎后定容至
25 ml，加入 50 l 20 mg L 蛋白酶 K(Merck)，37。C
水浴 1 h，测定 OD ∞，从 DNA标准曲线确定待测样
品的浓度 。
1．5藻细胞 DNA漏出率的测定
取指数增长期的球形棕囊藻400 ml藻液，依实
验要求加入一定量的二氧化氯母液，使其终浓度分
别为 2．5、6．0、8．0、16．0 mg L～，作用 3、6、15、30、60
min后，取 50 ml藻液加入 5 g L 的硫代硫酸钠反应
10 min，3 300 xg离心 l5 min。测定上清液 OD26o值，
从 DNA标准曲线确定样品DNA含量；阳性对照加
入 50 l 20 mg L。蛋白酶 K，37℃水浴 60 min。加入
终浓度为20 mg L 二氧化氯，按同样方法处理后测
定上清液 OD 值。漏出率 =实验样品 DNA的含
量 ／阳性对照 DNA的含量x100％。
1．6电镜观察
取对数生长期的球形棕囊藻藻液，加入一定量
的二氧化氯母液，作用24 h后 4 000 xg离心 15 min
浓缩藻细胞。沉淀物用 0．1 mol／L磷酸缓冲液 (pH
7．2—7．4)清洗后，依次用 2．5％戊二醛、1％锇酸固
定。经脱水、包埋、修剪、切片、染色后于透视电镜
(飞利浦)下观察。
2结果和分析
2．1二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素 a的影响
图 1显示二氧化氯对藻细胞叶绿素 a的影响
与二氧化氯剂量明显相关，随着二氧化氯剂量的升
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第 5期 刘 等： 钒化氯对球形 炎滦n_绿豢a、蛋I I质、DNA含 的影响
喇
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24 4 72
时间 Time h-
15 3·j 6O
Time fmin1
I ‘氧化氯对球彤镓瞧藻叶绿素a含量的影响
Fig l Efects of chlorine dioxide on chlorophyl a content in Phaeocystis globos．
A．低剂精Low dose；B高剂 High dose
高，叶绿素 a含量减少。低剂量I寸，24 h内藻细胞叶
绿素 a显著下降。随时问的推移，1．0、1．5 mgL。组
分别在 24 h、48 h后叶绿素 a含量开始增加；大于
2．0 mg L-组叶绿素 a含量持续降低，96 h趋于零。
高剂量时，叶绿素 a含量均迅速下降；3 min后下降
趋势趋于缓和，藻液颜色由棕黄色变为浅绿色。其
中6．0 mg L-组藻细胞明显脱色，由棕黄色变为近
无色，细胞变成空泡状小球。
2．2二氧化氯对球形棕囊藻蛋 白质含量的影响
图2显示，二氧化氯对球形棕囊藻蛋白质含量
的影响与其剂量明显相关。随着二氧化氯剂量的升
24 48 72
时间 Time(h)
429
高，藻体蛋白质含量明显下降。低剂量组蛋白质在
24 h内都仃 一定程度的下降，但下降幅度较小。随
时 问的推移 ，1．0、1．5 mg L。组分别 在 24 h与 48 h
后蛋白质的含量开始上升；人于2．0mgL-组蛋白
质含量持续减少。高浓度时，各组蛋白质含量均迅
速下降，存在明显的剂量 一效应关系。
2．3二氧化氯对球形棕囊藻氨基酸含量的影响
表 1列出了对照组与样品经 2．0mgL 二氧化
氯处理 24 h后，藻细胞中各氨基酸组成和含量百分
比。从表 1可知，球形棕囊藻含有 17种氨基酸，二
氧化氯对球形棕囊藻氨基酸组成有明显的影响，氨
3 6 15 3O 6O
时间 Time (min)
图2二氧化氯对球形棕囊藻蛋白质含量的影响
Fig．2 Efect ofchlorine dioxide on protein content in Phaeocystis globosa
A．低剂量 Low dose；B．高剂量Higl dose
一【．]舍lIl一芒∞芒0o cIa苦 ■姐 皿醐
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430 热带亚热带植物学报 第 l4卷
表 1二氧化氯对球形棕囊藻氨基酸的影响
Table l Efects ofchlorine dioxide on amino acid contents in Phaeocystis globosa
括号内的数值是实验组与对照组比较，氨基酸变化的相对百分数。Datain bracket
means relative percentage changes in amino acids compared with controls．
基酸的相对含量发生了变化。其中，相对含量减少
的有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、半
胱氨酸、赖氨酸等，半胱氨酸的减幅最大，其次为酪
— ●一 Control
— 0— 1
． 0 mg L-
24 48 72 96
时间 Time (h)
氨酸和赖氨酸。相对含量增加的有组氨酸、缬氨酸
和苯丙氨酸等。
3O
25
2O
15
10
5
O
— -．卜一 2
— ●卜_-6
5 mg L-
0 mg L-
3
图3二氧化氯对球形棕囊藻DNA的影响
Fig．3 Efects ofchlorine dioxide on DNA in Phaeocystis globosa
A．低剂量 Low dose；B．高剂量 High dose
6 15 30 60
时间 Time (min)
一{)6一∞苗 ∞ ．[《N口辟丑磐《N口
3 3 2 2 1 1 O
一【_J旨一=∞苫。o vN口棚姐vN口
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第5川 q-等： ．钮化 对球形稼囊藻il绿索a、伍I iJ面 DNA 的嘭唰
2．4二氧化氯对球形棕囊 藻脱氧核糖核酸 cDNA)含
量的影响
从 3A IiJ‘以厅f¨，一瓴化簸I 5&并减少球形
棕瞧藻DNA n J 量 加入 氧化氟 24 l1内，各
DNA含量均 l、降， 降 冁较小 1．o、I 5mg 目1
分N?I：24 h 48 h DNAf19含量 H始 『 升。夫手
2．0 mg U-．辅化氯处 的 液 DNA含景随时 I
的延长持续 降 ．
从 3B I,j-以看il，DNA湘；⋯牢 ．氧化氯的
浓度之 存 【 戈 加八 氰化氯3rain ．再浓
J望组 DNA黼⋯ ．^13％一】8％之问 ，刺 足小 剥漏
出毕的影响 簪4-：大 J ，挣纽 DNA潲⋯ 仃 一
定 Jil 提 -。 验浓度 范I,l内， 辆化氯可 盘接
破蜘、球J 踪瞧楼圳胞雌系统，投I"／L~／I胞的屏蟑』J能
·曼剑傲 H、，造 f位DNA f19黼 ⋯ DNA 黼Ⅲ {-璎 发 1
3讨论
_二氧化氯作刑的前3 rain，我l／J．钒化氯迅逃破
坏球形棕囊澡细胞幞的结I}f=J足 披藻gI胞死 亡的
丰 原
2．5二氧化氯对藻细胞结构的影响
册透 I 镜观察 l『-N 4 j+I 0球彤棕囊藻细胞
整体} 佝清晰完挫，圳1地膜完 拟， 胞质比较
均匀，纠胞器敞落f1 1 I 细胞1_=螽较夫．孩膜完栏甲
滑，怯、质界线I】 、清晰“r辨．』=幺f l刿 ．。 俐
状，说【!I=J梭增啦功能 盛。低剂 鬣化氯作川的
凛细胞，整体艟柑敛密暗淡、结构 、 ．细l啦脱与坎
膜发， 破损 高制量 一艇化氯f1。 1勺菠邹l J胞．细胞
膜和细胞棱[ 经没仃完挫纳构，胞膜破损，lI_ 剑
{ 内容物外}Il} 细咆器人多 } 破蹿．ft}l胞梭已始
完全破损删解．胞质内 剩 1 人 }±n{J质地 ：均匀物
质
4球形栋幄凛细胞琏 电镜陌
Fig 4 Pho【0富 Pns(SEM)0¨ 听 ， ，¨
A Jl常细1胞 Control：B 0 5mg L = ￡氯f1_』 后的势¨胞Algal cellinthe口r c爪oft)5mg 。chlodne dioxide．
( ()8mg 一氧化氯怍埔 杓翔J弛Algal cellinthepresent nr0 8mgld chlonne dioxide
光合作用是海洋微藻得以维持生命的能量来
源，而光台作川的关键物质是光合色素。叶绿素能
眵将太阳能转换为化学能并利用它将二氧化碳和
水等无机物合成糖类，同时释放氧气，维持生物的
同化作用。强氧化剂对海洋微藻叶绿素具有强烈的
脱色效果，能使微藻光台色素脱色 使微藻无法进
行光合作用，即使在适宜牛长的环境中也会很快地
死亡 。本研究表明，2．5mgL 的二氧化氯存3 min
内可使叶绿素明显脱色，卅 绿素 a含量显著 F降
提示二氧化氯分子能透过藻细胞膜，进而氧化叶绿
素 a．造成藻类色素脱色。
蛋白质是藻细胞生命活动的主要承担者．氨基
酸是蛋白质的基本组成单位，其组成、结构、数量不
仅与藻类的生长环境、营养状态有关，而且与藻类
的光合作用、代谢作用紧密棚连，稳定性二氧化氯
活化时能产生较多氧自由基、羟自⋯基等 自il基
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432 j蔓I带 E攥I ：植物学报
自由基能使微生物蛋白质f1的氨基酸氧化分解，导
致氨基酸链断裂，蛋白质结构和功能发生变化，最
终导致细菌等微生物的死亡[61。研究发现，芳香族和
含硫类氨基酸最易受到二氧化氯的氧化破坏，氨基
酸与二氧化氯反应能力顺序为：酪氨酸 >色氨酸>
半胱氨酸 >蛋氨酸I71。本研究显示，二氧化氯能使藻
细胞蛋白质含量显著下降，同时使藻细胞氨基酸的
相对含量发生明显变化。氨基酸相对含量的变化提
示二氧化氯对不同氨基酸的氧化破坏作用不同，表
现出一定的选择性。在所有氨基酸l{J，相对含量减
幅最大的是半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸，提示 氧
化氯与其反应的能力最强；与此相应，组氨酸、缬氨
酸和苯丙氨酸等氨基酸的相对含量有一定增幅，表
明二氧化氯对这些氨基酸的破坏作用很弱。研究发
现，半胱氨酸是含巯基的重要化合物，巯基在体内
具有清除自由基的能力，是许多蛋白和酶保护正常
结构和功能的重要基团[s1；酪氨酸、赖氨酸是生物体
中重要的氨基酸，在酶催化、信号传导、去除自由基
等方面发挥重要的作用I91。可以推测，二氧化氯可选
择性地作用于半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸等氨基酸，
造成相关蛋白质结构和功能的变化，进而影响细胞
的正常生理功能，引致细胞死亡。
细胞膜作为活细胞与环境之间的接口和屏障，
保证胞内外物质交换有序进行，保持细胞正常的生
理活动和功能。胞内成分的外渗能够反映出膜的完
整性，由于 DNA在 260 nm波长处有强吸收，很容
易通过 UV光谱检测。因此，260 nm波长处吸收光
谱的测定已广泛用于细胞膜、核膜完整性的检测『lo1。
本研究发现，二氧化氯不仅能显著减少藻细胞
DNA的含量，而且能引致 DNA的漏出；DNA的漏
出主要发生在二氧化氯作用的前 3 min，这些结果
提示，二氧化氯能破坏球形棕囊藻细胞膜系统，造
成胞内，甚至核内物质如 DNA的外泄，二氧化氯对
球形棕囊藻细胞膜的破坏作用可能是引起藻细胞
死亡的主要原因之一⋯】。这一结果也得到透视电镜
和叶绿素含量测定结果的证实。透视电镜观察结果
显示，低剂量二氧化氯作用的藻细胞，藻体显得致
密暗淡、结构不清，细胞膜与核膜发生破损。高剂量
二氧化氯作用的藻细胞，细胞膜破损，细胞核发生
崩解，部分细胞器破裂，可见到有胞内物外泄。
第 l4卷
综上所述， 氖化氯分了可能以 ．分了扩散的
形式穿透细胞膜进入胞内，氧化光 也素 一叶绿素
的吡咯环，破坏叶绿素的结构，使细胞脱色；其产生
的(j由 能氧化分解某些氨 酸，导致荆I关蛋白质
结构和功能发生改变，从而影响细胞的 常功能。
同时，自由基使溧细胞膜系统 (细胞膜、细胞器膜、
核膜系统)发牛脂质过氧化，造成膜系统和细胞器结
构的破坏，引起膜内物质的外漏 ，最终导致藻细胞
死 l ：。
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