全 文 ：植物在生长发育过程中通常会遭到各种非生
物逆境胁迫因子，如高温、低温、干旱、重金属、盐碱
等的影响。在这些胁迫条件下，植物表现出生长发
育迟缓，严重时可导致作物产量降低和品质下降，
水稻CPR5基因参与氧化胁迫响应
刘锋1, 舒曦1, 郑艳华1, 黎梓君2, 阳成伟2, 王亚琴1,2*
(1. 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006; 2. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州 510631)
摘要： 为探讨水稻(Oryza sativa L.)中 CPR5 基因的功能，以其 cDNA 文库为基础进行序列比对，并将 1 个同源性较高的序列命
名为 OsCPR5。生物信息学分析表明，OsCPR5 的开放阅读框长度为 1551 bp，编码 516 个氨基酸。软件预测该编码蛋白可能
是 1 个具有 5 个跨膜区的膜蛋白和核定位蛋白。组织表达和亚细胞定位分析表明，OsCPR5 在根中的表达水平较高，且广泛
分布在细胞膜、细胞质和细胞核上。逆境胁迫分析实验表明，植物激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)、过氧化氢(Hydrogen peroxide,
H2O2)、氯化钠(NaCl)、甲基紫精(Methyl viologen, MV)等环境胁迫可诱导 OsCPR5 的上调表达，其中氧化胁迫相关的 MV 和
H2O2 处理效果最为明显。拟南芥(Arabidopsis thaliana)转基因株系 atcpr5/OsCPR5 在浓度为 0.5 μmol L
–1、 1.0 μmol L–1 的 MV
以及 6 mmol L–1、 8 mmol L–1 的 H2O2 处理下，种子萌发率明显高于 atcpr5 突变体。这揭示了 OsCPR5 基因在植物抗氧化胁迫
响应中具有一定的作用。
关键词： 水稻； OsCPR5； 甲基紫精； 过氧化氢； 氧化胁迫
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.04.003
Involvement of Rice CPR5 in Response to Oxidative Stress
LIU Feng1, SHU Xi1, ZHENG Yan-hua1, LI Zi-jun2, YANG Cheng-wei2, WANG Ya-qin1,2*
(1. School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China; 2. Guangdong Key Laboratory of
Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)
Abstract: In order to understand the function of CPR5 in rice (Oryza sativa L.), a homologous sequence, named
as OsCPR5, was cloned from rice full-length cDNA library by BLAST. Bioinformatics analysis showed that
the length of ORF in OsCPR5 was 1551 bp, encoding 516 amino acids. The OsCPR5 protein contained five
transmembrane regions at the carboxy terminus, which also existed in AtCPR5. The expression of OsCPR5 was
high in roots. The subcellular localization showed that OsCPR5 distributed widely in cell membrane, cytoplasm,
and nucleus. The expression of OsCPR5 in rice was up-regulated by different environment stresses, including
exogenous abscisic acid (ABA), NaCl, especially methyl viologen (MV) and hydrogen peroxide (H2O2). When
transgenic lines atcpr5/OsCPR5 of Arabidopsis thaliana were treated with methyl viologen (0.5 μmol L–1,
1.0 μmol L–1) and hydrogen peroxide (6 mmol L–1, 8 mmol L–1), the seed germination rates were higher than that
of atcpr5 mutant. Therefore, it was suggested that OsCPR5 played a role in response to oxidative stress.
Key words: Rice; OsCPR5; Methyl viologen; Hydrogen peroxide; Oxidative stress
收稿日期： 2013–01–05　　　　接受日期： 2013–04–15
基金项目： 国家自然科学基金项目(30970216); 广东省自然科学基金项目(S2011010003358); 广东省科技计划项目(2007A020100001)资助
作者简介： 刘锋(1988 ~ )，女，硕士，主要从事植物生理与分子生物学研究。E-mail: liufeng_csd@sina.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: yqwang@scut.edu.cn
热带亚热带植物学报　2013， 21(4)： 305~314
Journal of Tropical and Subtropical Botany
306 第21卷热带亚热带植物学报
甚至引起死亡。例如，氧化胁迫(Oxidative stress)[1]
作为逆境应答中的一种普遍现象，会导致活性氧
(Reactive oxygen species, ROS)产生。当环境胁迫
长期作用于植株，产生的活性氧超出活性氧清除系
统的能力时，就会产生氧化损伤[2–3]。一直以来，研
究作物对逆境胁迫响应的机制，发掘作物中能够抗
逆境胁迫的基因，培育具有良好抗逆特性的农作物
品种，成为国内外科研工作者关注的焦点问题。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中组成性表达相
关发病机理基因 CPR5 (Constitutive expression of
pathogenesis-related genes 5)是 一 个 多 效 性 基 因，
最早发现其对梨枯病原体和寄生性病原菌卵菌产
生组成性的抗病性[4–5]。随后的研究表明，拟南芥
CPR5 在细胞增殖、细胞衰老、细胞死亡、蔗糖的感
受、脱落酸途径、膜蛋白的编辑、细胞壁形成等方面
都发挥着极其重要的作用[5–9]。Clarke 等[10–11]报道
AtCPR5 可通过依赖水杨酸和茉莉酸途径来调控基
础耐热性。而 Wang 等[12]认为在长期的热胁迫条
件下，AtCPR5 通过调控热激蛋白和热激转录因子
的表达来间接提高拟南芥的耐热能力。还有研究
报道指出，AtCPR5 是一种新型的调控因子，可参
与调节种子萌发、幼苗发育[13]以及植物活性氧 ROS
信号途径[4,14]。甲基紫精(MV)是除草剂百草枯的有
效成分，可作为内源诱导物[15]来诱导细胞内出现氧
化逆境；过氧化氢(H2O2)在调节植物活性氧 ROS 过
程中作为第二信使[16]参与植物机械伤害和其他多
种胁迫应答。
迄今为止，国内外对于拟南芥 CPR5 的生理功
能已经进行了广泛的研究，而水稻中 CPR5 功能的
报道尚属空白。因此，本文首次克隆了水稻 CPR5
同源基因(命名为 OsCPR5)，对其生物信息学、组织
表达特异性、亚细胞定位及各种非生物胁迫响应进
行了研究，探讨该基因的序列特征及在逆境条件下
的表达特性，为深入研究水稻抵御逆境胁迫的作用
机理提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
水 稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)品 种‘中
花 11’种 子、拟 南 芥(Arabidopsis thaliana)野 生 型
(Columbia 生态型)、突变体 atcpr5、植物双元表达载体
pCanG、荧光表达载体pBEGFP、大肠杆菌(Escherichia
coli) DH5α 菌 株、根 癌 农 杆 菌(Agrobacterium
tumefaciens) EHA105 均由华南师范大学阳成伟实
验室惠赠。
将水稻种子用手剥去掉颖壳，先用 70% 乙醇
表面消毒 1 min，用无菌水清洗 3 次，再用 0.1% 的
升汞杀菌消毒 15 min，期间时常振荡，然后用无菌
水冲洗 5 次，转移到无菌滤纸上吸干表面的水分，
均匀接种在 MS 固体培养基表面，用封口膜封好后，
将其置于光强 100 μmol m–2s–1，光周期为 16 h / 8 h
(光 / 暗)，温度为 28℃，相对湿度为 80% 左右的培
养室中培养。培养 14 d 左右，将一部分水稻幼苗从
培养基中移出，洗净根部(注意避免对其造成机械
损害)，用吸水纸吸干水分，取少许幼苗用锡箔纸包
裹好于液氮中速冻作为对照，其余进行相关胁迫处
理。非生物胁迫处理如下：盐胁迫处理是将洗净水
稻的根部于200 mmol L–1 NaCl溶液中，分别处理 2、
4、6、24 h 后取样；热处理是将生长在培养基上
的水稻幼苗，置于 37℃ 培养箱，分别处理 1、 2、 6、
12、24 h 后取样；冷处理是将生长在培养基上的
水稻幼苗，置于 4℃冰箱，分别处理 2、4、6、12、
24 h 后取样；ABA 处理是将洗净的水稻根部置于
100 μmol L–1ABA 溶液中，分别处理 1、2、6、12、
24 h 后取样；聚乙二醇(PEG)处理则是洗净的水稻
根部置于 20% PEG6000 溶液中，分别处理 1、2、
6、24 h 后取样；H2O2 处理是将洗净的水稻根部置
于 100 μmol L–1 H2O2 溶液中，分别处理 2、4、6、
24 h 后取样；MV 处理则是洗净的水稻根部置于
15 μmol L–1 MV 溶液中，分别处理 6、12、24 h 后
取样。每次胁迫处理后的材料用锡箔纸迅速包好
置液氮中速冻，–80℃冰箱保存备用。
实验中用到的质粒小量提取试剂盒(Plasmid
Miniprep Kit)、琼 脂 糖 凝 胶 回 收 试 剂 盒(Gel/PCR
extraction Kit)购 自 BioMIGA 公 司。RNA 提 取 试
剂盒(Trizol)购自 TaKaRa 公司。其它各种试剂购
自 SIGMA、生工生物工程(上海)有限公司和广州化
学试剂厂等生物公司的分析纯试剂。
1.2 逆转录-PCR反应
按照 Trizol 试剂盒说明书提取上述胁迫处理
水稻的总 RNA，取 2 μg 总 RNA 用于 cDNA 第一
链的合成(具体方法参见 TaKaRa 相关试剂盒说明
书)，然后以该逆转录产物作为模板扩增 OsCPR5
基 因。 扩 增 OsCPR5 片 段 的 引 物 为 OsCPR5-F：
第4期 307
5′-TAACGCATCTTCGGCATAGC-3′；OsCPR5-R：
5′-ACTGAATTTGGCATCCACCA-3′。内参基因引
物 OsActin-F：5′-GGAACTGGTATGGTCAAGGCT-
3′；OsActin-R：5′-ACACGGAGCTCGTTGTAGA-
AG-3′。扩增 OsActin 的 PCR 程序为：94℃预变性
3 min；然后 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共 25
个循环；最后 72℃延伸 10 min。扩增 OsCPR5 的
程序为：95℃预变性 5 min；然后 94℃ 30 s，56℃
30 s，72℃ 30 s，共 29 ~ 30 个循环；最后 72℃延伸
10 min。在严格保证样品处理、总 RNA 提取、反转
录、PCR 等过程中各条件和参数一致的情况下进
行 3 次重复实验。
1.3 表达载体的构建
按 照 OsCPR5 基 因 序 列 设 计 含 有 Kpn Ⅰ 和
BamH Ⅰ酶切位点的引物，OsCPR5-pCanG-F: 5′-
TTGGTACCATGTCCTTCGCCGCCGT-3′；OsCPR5-
pCanG-R: 5′-GGATCCTCATGCTTCAATCTTGTC-
AC-3′。OsCPR5-pBEGFP-F: 5′-GGTACCTATGTCC-
TTCGCCGCCGTC-3′；OsCPR5-pBEGFP-R: 5′-GGA-
TCCACTGCTTCAATCTTGTCACCGA-3′。提取野
生型水稻幼苗总 RNA，通过 KOD 高保真酶(ToYoBo)
和对应的引物对 OsCPR5 基因片段进行 PCR 扩增，
连接 pMD18-T Vector 并转化大肠杆菌，筛选出阳
性克隆提取质粒，经 PCR 和酶切验证后送华大基
因有限公司测序验证。然后，将测序正确的片段分
别与 pCanG 和 pBEGFP 载体连接转化，从而构建
出 OsCPR5-pCanG 和 OsCPR5-pBEGFP 表达载体。
1.4 生物信息学分析
从 拟 南 芥 TAIR 数 据 库(The Arabidopsis Infor-
mation Resource)中找到 AtCPR5 的氨基酸序列，然
后在水稻数据库(Rice Genome Annotation Project)
中通过 BlastP 来寻找其同源序列。借助 ExPASy 数
据库中的 ProtParam 在线工具(http://expasy.org/tools/
protparam.html)对蛋白序列进行基本理化性质分析。
The Predict Protein server (http://www.Predictprotein.
org/)[17]对潜在的核定位信号进行分析。利用工具
TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[18]
分 析 蛋 白 质 的 跨 膜 结 构 域。 在 NCBI 数 据 库 中
搜索与 OsCPR5 蛋白同源的其他植物序列，借助
MEGA 5.0[19]软件，采用 Neighbor-joining (NJ)方法
来构建系统发育树[20]，其中 Bootstrap 分析重复数
为 1000。蛋白质的亚细胞定位分析软件为 WOLF
PSORT (http://wolfpsort.org/)和 SubLoc v1.0 (http://
www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/eu_predict.
htm)。
1.5 拟南芥的遗传转化及转基因植株的鉴定
参照 Fillatti 等[21]的方法，将构建的重组质粒
OsCPR5-pCanG 通过冻融法导入农杆菌 EHA105
中备用。拟南芥种子用 75% 乙醇消毒 1 min，再用
2% 的次氯酸钠灭菌处理 3 ~ 5 min，期间不断振荡，
然后用无菌水冲洗 3 ~ 5 次，均匀接种在 MS 固体
培养基(MS 大量元素、有机物质、铁盐、微量元素相
同，添加 0.8% 琼脂(W/V)和 1.5% 蔗糖，用 1 mol L–1
NaOH 溶液调至 pH 为 5.7 ~ 5.8)上，在 4℃冰箱中
春化 2 ~ 3 d。之后将其置于光强 100 μmol m–2s–1，
光周期为 16 h / 8 h (光 / 暗)，温度为 22℃ ~ 24℃，
相对湿度为 80% 左右的培养室中培养。培养 7 d 左
右，将幼苗转移到混合营养土中培养至长出花苞，转
化前需将已授粉的花和果荚剪掉。然后将之前保
存的 OsCPR5-pCanG 农杆菌，接种到含有 75 mg L–1
卡那霉素(Kan)和 60 mg L–1 利福平(Rif)的 5 mL LB
液体培养基中(胰蛋白胨 10 g L–1 + NaCl 10 g L–1 +
酵 母 提 取 物 5 g L–1)，在 28 ℃ 下 以 200 r min–1 摇
菌培养过夜(12 ~ 16 h)收集菌体，参照 Clough 和
Bent 等[22]的 方 法，采 用 花 序 浸 染 法 进 行 拟 南 芥
atcpr5 突变体的转化，转化植株在含有 50 mg L–1
Kan 的平板上筛选并进行 RT-PCR 检测，选取单
拷贝插入的纯合转基因株系用于后续实验。PCR
检 测 目 的 基 因 OsCPR5 的 引 物 为 OsCPR5-F：
5 ′-TTGGTACCATGTCCTTCGCCGCCGT-3 ′；
OsCPR5-R：5′-GGATCCTCATGCTTCAATCTTG-
TCAC-3′，内 参 基 因 AtActin 的 引 物 为 AtActin-F：
5′-CTACGAGCAGGAACTCGAGA-3′；AtActin-R：
5′-GATGGACCTGACTCGTCATAC-3′。扩增 AtActin
的程序为：94℃预变性 3 min；然后 94℃ 30 s，55℃
30 s， 72℃ 30 s，共 25 个循环；最后 72℃延伸 10 min。
扩增 OsCPR5 的程序为：95℃预变性 5 min；然后
94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共 30 个循环；最
后 72℃延伸 10 min。
1.6 亚细胞定位
参照 Horsch 等[23]的方法，略有改进。野生型
烟草(Nicotiana tabacum)种子消毒灭菌后，接种于
刘锋等：水稻CPR5基因参与氧化胁迫响应
308 第21卷热带亚热带植物学报
1/2 MS 固体培养基上，在 4℃冰箱中春化 2 ~ 3 d，
然后置于 22℃ ~ 23℃、16 h / 8 h (光照 / 黑暗)的培
养室中生长 4 ~ 6 周，直至长成健壮的成苗，将烟草
无菌苗的叶片切成小方块(大小约 0.5 cm × 0.5 cm)
作为转化的起始外植体材料。把携带有 OsCPR5-
pBEGFP 的根癌农杆菌，在含有 60 mg L–1 利福平和
75 mg L–1 卡那霉素的 YEB (胰蛋白胨 5 g L–1 + 酵
母提取物 1 g L–1 + 牛肉浸膏 5 g L–1 + MgSO4·7H2O
0.493 g L–1 + 琼脂粉 15 g L–1，调节 pH 至 7.0 ~ 7.2)
平板上划线，置 28℃恒温培养箱培养约 2 d，挑取
单菌落于 20 mL 含相应抗生素的 YEB 液体培养液
中，于 28℃下以 200 r min–1 振荡培养 36 h。按 1%
接种量再接种于含相同抗生素的 YEB 液体培养基
中，于 28℃下以 250 r min–1 振荡培养 6 h，至 OD600
值为 0.8 ~ 1.0。取 1 mL 菌液用 MS 培养液稀释至
OD600 = 0.2，用于侵染烟草叶片。将剪切好的烟草
叶盘置于菌悬液中轻微振荡 10 min 后，在无菌的
滤纸上吸干菌液，转移到 SIM 培养基(MS 培养基 +
1 mg L–1 6-苄氨基腺嘌呤 + 0.1 mg L–1 α-萘乙酸，用
1 mol L–1 NaOH 溶液调至 pH 为 5.7 ~ 5.8)上，28℃
暗培养 2 d。外植体用灭菌的 MS 液体培养基洗
3 ~ 5 次，然后用无菌的滤纸吸干水分，转移到含
100 mg L–1 卡那霉素和 250 mg L–1 的羧苄青霉素
(Cd)的 SIM 上培养。每两个星期换 1 次 SIM 培养
基，直到长出小芽。切取带少量愈伤组织的小芽于
1/2 MS 固体培养基上生根成苗，然后转移至混合
营养土中栽培，获得转基因烟草植株。然后利用
Zeiss LSM 710 激光共聚焦显微镜来观察烟草根尖
细胞中目的基因的表达情况，以未转基因的野生型
植株作对照。GFP 的激发波长是 488 nm，发射波
长是 508 ~ 530 nm。
1.7 甲基紫精和过氧化氢处理
配制含不同浓度梯度 MV、H2O2 的 MS 固体
培养基，将灭菌后的野生型 WT，atcpr5，atcpr5/
OsCPR5(两个株系 HB3、HB4)的拟南芥同批种子
均匀铺到相应的培养基上，用于观察种子萌发情
况。种子萌发以胚根突破种皮作为标准。所得实
验 数 据 用 Excel 统 计，并 用 SigmaPlot 12.0 作 图。
采用 One-Way 方差分析和最小显著差异法(LSD)
来比较不同处理间的差异显著性。3 次独立的重复
试验，P < 0.05 表示差异达到显著水平。
2 结果和分析
2.1 OsCPR5的分子特征
OsCPR5 基因编号为 Os01g68970，其开放阅读
框长 1551 bp，编码 516 个氨基酸，OSCPR5 分子
量为 57.01 KD，等电点 PI 为 8.93。OsCPR5 含有 5
个外显子和 4 个内含子，不存在标记的功能区域，
其中内含子相位均为 0，处在两个完整的密码子之
间(图 1: A)。
已 知 AtCPR5 蛋 白 是 1 个 膜 蛋 白，在 第 4 个
外 显 子 上 含 有 5 个 跨 膜 区 域。 该 蛋 白 N 端 含
有 核 定 位 信 号(NLS)，位 于 第 40 ~ 56 位 氨 基 酸
(KKKKDTNPSNLEKRKL)[6]。用 TMHMM 软件预
测显示，水稻 CPR5 蛋白没有已知的功能结构域，
但是存在与 AtCPR5 蛋白结构类似的 5 个跨膜区
域(图 1: B)。采用 The Predict Protein server[17]预测
核定位信号，表明 OsCPR5 蛋白在 第 51 ~ 58 位也
同样存在核定位信号(LRRRGRQ)。表明 OsCPR5
可能是 1 个膜蛋白和核定位蛋白。
2.2 OsCPR5的氨基酸同源性分析
在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对，结果表
明，葡萄(Vitis vinifera)、蓖麻(Ricinus communis)、玉
米(Zea mays)等物种中存在与水稻 CPR5 同源的蛋
白序列。本研究选取了同源性较近的 11 种植物的
氨基酸序列来构建系统发育进化树(图 2)。这 11 种
植物的 CPR5 可划分为二类：拟南芥、葡萄、蒺藜苜
蓿(Medicago truncatula)、大豆(Glycine max)、蓖麻、
毛果杨(Populus trichocarpa)聚为一类，它们均为双
子叶植物；二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、
大麦(Hordeum vulgare)、高粱(Sorghum bicolor)、水
稻聚为一类，它们都是单子叶植物，这与形态学上
的分类是一致的。从图中还可以看出 OsCPR5 蛋
白与 AtCPR5 的亲缘关系处在较近的分支上，推
测 OsCPR5 可能在水稻生长发育过程中起重要作
用。
2.3 OsCPR5的表达模式
基因的时空表达是其正常行使功能的基础与
前提，分为组成型表达与组织特异型表达。为了研
究 OsCPR5 基因的表达是否具有组织特异性，本文
通过 RT-PCR 方法检测水稻植株不同组织器官中
OsCPR5 的表达情况。结果表明，OsCPR5 在老根
第4期 309
图 1 OsCPR5 蛋白的结构特征。A: OsCPR5 基因结构图；B: OsCPR5 蛋白的跨膜分析。
Fig. 1 Structure characteristic of OsCPR5. A: Genomic organization of OsCPR5; B: Transmembrane analysis for OsCPR5.
图 2 水稻 OsCPR5 与其他物种同源序列的进化树分析。XP_003573035: 二穗短柄草；BAJ93647: 大麦；XP_002454622: 高粱；NP_001146273:
玉米；XP_002280314: 葡萄；XP_003602473: 蒺藜苜蓿；XP_003526824: 大豆；XP_002528666: 蓖麻；XP_002306346: 毛果杨。
Fig. 2 Phylogenetic analysis of rice OsCPR5 and other species. XP_003573035: Brachypodium distachyon; BAJ93647: Hordeum vulgare;
XP_002454622: Sorghum bicolor; NP_001146273: Zea mays; XP_002280314: Vitis vinifera; XP_003602473: Medicago truncatula; XP_003526824:
Glycine max; XP_002528666: Ricinus communis; XP_002306346: Populus trichocarpa.
和幼根中的表达水平较高，在幼叶、旗叶、穗中的表
达较弱，而在老茎和幼茎中几乎没有表达(图 3)，说
明 OsCPR5 的表达具有组织特异性，这为后续研究
其功能提供了重要的线索。
2.4 OsCPR5的亚细胞定位
采用蛋白质分析软件 WoLF PSORT 和 SubLoc
v1.0 对 OsCPR5 基因表达蛋白的定位方式进行预
测，结果表明该蛋白可能定位在细胞核、叶绿体
刘锋等：水稻CPR5基因参与氧化胁迫响应
310 第21卷热带亚热带植物学报
类囊体膜或细胞质中。为了进一步确定 OsCPR5
蛋 白 在 细 胞 中 发 挥 功 能 的 具 体 部 位，本 文 构 建
了 p35S::OsCPR5-GFP 融 合 表 达 载 体，通 过 叶
盘 转 化 法 将 其 转 入 烟 草 中。 分 别 选 取 野 生 型、
p35S::OsCPR5-GFP 转基因烟草靠近根尖的部位，
在共聚焦显微镜下进行观察(图 4)。结果表明，在
野生型对照烟草的根尖细胞中没有绿色荧光，而转
p35S::OsCPR5-GFP 烟草的根尖细胞中，可以明显
地观察到绿色荧光出现在细胞膜、质和细胞核中。
初步确定 OsCPR5 定位于细胞核、细胞膜和细胞
质中。
2.5 OsCPR5基因在逆境胁迫下的表达分析
为了探讨 OsCPR5 基因如何响应逆境胁迫，
首先对 OsCPR5 基因的启动子区域进行了预测分
析，发现其启动子区域含有大量与植物激素以及非
生物逆境胁迫相关的顺式作用元件。因此初步推
测 OsCPR5 基因可能参与一些非生物胁迫的应答。
因此，我们研究了 ABA、H2O2、PEG 等非生物胁
迫因子对该基因的影响。结果表明，在 7 种胁迫处
理下，OsCPR5 基因的表达模式存在一定的差异
(图 5)。与对照相比，冷和热击处理下 OsCPR5 基
因表达水平并未发生明显的变化(图 5: C,E)，暗示
图 3 OsCPR5 在拟南芥不同组织中的表达。YR: 幼根； OR: 老根； YL: 幼叶； FL: 旗叶； S: 穗； YS: 幼茎； OS: 老茎。
Fig. 3 Expression of OsCPR5 in different tissues of Arabidopsis thaliana. YR: Young root; OR: Old root; YL: Young leaf; FL: Flag leaf; S: Spikelet;
YS: Young stem; OS: Old stem.
图 4 OsCPR5 在烟草细胞中的亚细胞定位。左： GFP 绿色荧光信号；中： DIC 白光信号；右： Merged GFP 信号叠加信号。标尺 = 50 µm
Fig. 4 Subcellular localization of OsCPR5 in tobacco cell. Left: GFP fluorescence image; Middle: Bright-field image; Right: Merged GFP fluorescence
image. Scale bars = 50 µm
第4期 311
OsCPR5 的表达可能不受冷和热处理的诱导；PEG
胁迫处理 6 h 以内，OsCPR5 的表达明显下调(图
5: D)，说明短时间内 PEG 胁迫可抑制 OsCPR5 基
因的表达；而 ABA、NaCl、MV 和 H2O2 处理可促
进 OsCPR5 基因的表达(图 5: A,B,F,G)，尤其是 MV
和 H2O2 对 OsCPR5 基因表达的促进作用最为明显。
这些结果说明 OsCPR5 基因可能在氧化胁迫信号
应答过程中发挥一定的作用。
2.6 OsCPR5提高转基因拟南芥对外源MV、H2O2
的氧化胁迫响应
水稻作为单子叶植物研究的模式植物，其转
化方法通常采用农杆菌介导的遗传转化体系，该方
法虽然已经比较成熟，但是水稻从愈伤组织分化到
出苗的周期相对较长且步骤繁琐。因此，本文先通
过异源表达的方法，将 OsCPR5 转化拟南芥 atcpr5
突变体来探究 OsCPR5 在氧化胁迫响应方面的功
能。本文采用花序浸染法(floral dipping)[22]转化拟
南芥，在含有 50 mg L–1 卡那霉素的平板上筛选获
得 atcpr5/OsCPR5 转基因植株。RT-PCR 分析结果
表明，OsCPR5 基因在野生型和 atcpr5 突变体对
照中没有表达，却在 atcpr5/OsCPR5 转基因植株中
有较强的表达水平，说明该外源基因已经成功转入
到拟南芥中，可用于后续的生理实验(图 6: A)。
将 WT、atcpr5、atcpr5/OsCPR5 (HB3, HB4)
转基因拟南芥的同批种子播种于含有不同浓度
MV 和 H2O2 的 MS 固体培养基上(对照组播种于不
含 MV 和 H2O2 的 MS 固体培养基上)，统计 24 h 后
的种子萌发率，分析不同转基因拟南芥种子对外源
胁迫诱导剂 MV 和 H2O2 的敏感性。结果表明，随
着 MV 处理浓度的增加，拟南芥种子的萌发率均受
到不同程度的影响，其中 atcpr5 的抑制作用尤为明
显；在 0.5 μmol L–1，1.0 μmol L–1 的 MV 处 理 后，
atcpr5/OsCPR5 的萌发率明显高于 atcpr5，且差异
达到显著水平(P < 0.05)(图 6: B)。而不同基因型的
转化植株经 H2O2 处理后，结果表明，H2O2 处理也
会抑制拟南芥种子的萌发；在 4 mmol L–1 H2O2 处
理下，3 种转基因植株之间的萌发率并没有太大的
差异，但是 6 mmol L–1、8 mmol L–1 H2O2 处理下，
atcpr5/OsCPR5 与 atcpr5 的萌发率却存在显著差异
(图 6: C)。结果表明 OsCPR5 转基因植株在氧化胁
迫下的抗性有所提高，揭示了 OsCPR5 基因可能在
图 5 水稻 OsCPR5 在不同胁迫下的表达分析
Fig. 5 Expression of OsCPR5 in rice under abiotic stresses
刘锋等：水稻CPR5基因参与氧化胁迫响应
312 第21卷热带亚热带植物学报
植物响应氧化胁迫过程中起一定的作用，这与前面
RT-PCR 初步分析结果(图 5: B,G)基本一致。
3 讨论
植物在遭遇逆境胁迫时，通常会产生一系列的
应答反应以减轻或消除胁迫对其造成的危害，植物
的这种自我保护机制具有多基因、多信号途径与多
基因产物的特点[24]。水稻作为世界上最重要的粮
食作物之一，是全球超过一半人口的主要食物和能
量来源，同时也成为植物生长发育、逆境反应等基
础研究的模式植物[25]。各种生物和非生物胁迫是
影响水稻生长和产量的重要因素，因此发掘水稻抗
逆境胁迫的基因将为基因工程改良水稻新品种打
下基础。
生物信息学分析在生物学研究中起着越来越
重要的作用，是系统生物学发展的基础。通过生物
信息学手段可对基因的表达和功能、基因的启动子
功能分析、基因对外界条件的响应以及氨基酸序列
特征、蛋白结构功能特征等进行分析并获得庞大的
数据资源，从而为研究不同物种中未知基因的功
能提供线索。通过结构域预测发现，OsCPR5 与
AtCPR5 之间均存在跨膜结构(图 1: B)。Gao 等[13]
构建 PCanG-CPR5 △ TM 缺失最后 3 个跨膜区的
表达载体，转化 atcpr5 突变体，得到转基因植株却
不能互补其矮小、表皮毛分叉少的表型，证实了蛋
白质的跨膜区是影响蛋白质功能的重要结构。因
此，我们推测 OsCPR5 的跨膜结构也可能对其蛋白
质功能的维持起作用。
蛋白质作为生命活动的主要承担者，其功能
的研究已成为生物学研究中的一个热点话题。基
因的组织特异性表达和蛋白质的亚细胞定位能为
蛋白质功能研究提供重要的线索和依据。本文通
过 RT-PCR 检测 OsCPR5 在水稻不同组织中的表
图 6 WT、 atcpr5、 atcpr5/OsCPR5 (HB3, HB4)基因型植株对 MV 和 H2O2 的响应。A: 转基因植株的 RT-PCR 鉴定。1: 野生型；2: atcpr5 突变体；
3 ~ 5: atcpr5/OsCPR5 (HB3, HB4, HB5)植株；B: 不同基因型在含有 0、0.5、1.0 和 1.5 μmol L–1 MV 的 MS 培养基上的萌发率；C: 不同基因型
在含有 0、4、6 和 8 mmol L–1 H2O2 的 MS 培养基上的萌发率。*: atcpr5 与 atcpr5/OsCPR5 间的差异显著(P < 0.05 )。
Fig. 6 Germination rates of WT, atcpr5, atcpr5/OsCPR5 types under MV and H2O2 treatment. A: Identification of transgenic Arabidopsis lines. 1:
Wild type; 2: atcpr5 type; 3 – 5: atcpr5/OsCPR5 type; B: Germination rates on MS medium containing 0, 0.5, 1.0, 1.5 μmol L–1 MV, respectively; C:
Germination rates on MS medium containing 0, 4, 6, 8 mmol L–1 H2O2, respectively. *: Significant difference between atcpr5 and atcpr5/OsCPR5 at 0.05
level.
第4期 313
达水平，表明根中 OsCPR5 的表达水平较高，幼叶、
旗叶、穗中也能检测到较弱的表达，而在茎中却几
乎没有表达(图 3)。通过转基因烟草研究 OsCPR5
的亚细胞定位，结果表明 OsCPR5 广泛分布在细胞
膜、细胞质和细胞核上，这与软件预测的结果一致，
然而却与拟南芥 CPR5 蛋白的细胞质定位方式[13]
不一致。我们知道，不同物种间同源基因的亚细胞
定位方式是可能存在差异的，如 Bousquet 等[26]和
Cardazzo 等[27]报道酵母 ABC1 在拟南芥中的同源
蛋白 AtABC1 定位在线粒体；而 Wang 等[28]观察到
小麦 TaABC1 定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。
水稻和拟南芥同源蛋白 CPR5 亚细胞定位方式存
在差异可能是这两个蛋白参与行使功能的方式不
同所致。
课 题 组 在 研 究 拟 南 芥 CPR5 功 能 时，认 为
AtCPR5 基因在植物 ABA、干旱胁迫信号传导以
及耐热性方面具有重要的功能[12–13]。本研究对
OsCPR5 的 研 究 表 明，在 MV 和 H2O2 胁 迫 处 理
下，OsCPR5 在水稻中的转录水平明显上调，且
OsCPR5 转基因植株的萌发率明显高于 atcpr5 突
变体(图 5, 6)，表明 OsCPR5 可一定程度地提高植
物对氧化胁迫的耐受能力。推测该基因可能通过
体内的调控网络应答外界胁迫信号，从而抵御环境
伤害。Jing 和 Dijkwel[14] 认为 AtCPR5 是作为细胞
内 ROS 信号途径中的主要调节因子参与氧化胁迫
的应答调控过程。虽然 OsCPR5 和 AtCPR5 在提高
植物抗氧化胁迫方面都具有非常重要的功能，但是
由于它们分别所属单子叶植物和双子叶植物，在整
个生物进化过程中彼此之间也存在较大的差异，因
此我们还需进一步研究才能明确 OsCPR5 参与调
节氧化胁迫的作用机制。
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