全 文 ：核 农 学 报 ,
己
辐射技术制备固定化蛋白酶
李正魁 张伯森 谢宗传
江苏省农业科学院原子能农业利用研究所 南京
本文探讨 了在低温条件下 , ℃。一丫射线诱导亲水性单体丙 烯酸狂 乙醋
、 硫水性 的
聚‘ 二醉二 甲基丙 烯酸醋 系列单休聚合 固定化蛋 白酶的方 法 , 研 究 了单体的分子 结
构 , 单体性质对 固定化蛋 白酶活性 和 热稳定性 的影响 。 实验结果表明 , 采用单官能 团
单体 制备 的 固定化蛋 白酶相 对活性 高于双 官能 团单体 , 固定化酶相 对活性 随
疏水性 单体聚乙 二 醉二 甲墓 丙 烯酸醋 中乙二 醉数 的增加 而 增加 。 对 于 亲水性 单体
固定化蛋 白晦的相 对活性则随单体的冷却速率的增加而 增加 。 固定化蛋 白酶的
热稳定性随单体的亲水性而 变化 。
关键词 辐射聚合 固定化蛋 白酶 载体 热稳定性
前 台
自 。年 。 博士应用 射线开展 固定化胰肮酶研究工作以来 , 应用辐射技术进行固
定化酶的制备研究工作得到 了很大的发展 , , 〕等在低温条件下 , 应用‘。 射线对数种
酶进行固定化研究 , 表明低温可以避免热对酶活性的损失 图等采用亲水性单体进行固定
化酶研究 , 发现低温可减少射线对酶活性的损失 。作者 , ‘ 〕采用此技术对 一淀粉酶 、纤维素酶等进
行了固定化研究 , 探讨了载体的微观结构对固定化酶相对活性的影响 , 取得了良好的效果
。
本文采用亲水性单体丙烯酸轻 乙醋 和疏水性的聚 乙二醇二 甲基丙烯酸醋系列单
体辐射聚合形成载体材料固定化蛋 白酶 , 旨在研究单体的分子结构和性质对 固定化蛋 白酶相
对活性及热稳定性的影响 , 并对其它实验条件对 固定化蛋 白酶相对活性的影响进行了探讨 。
材 料 与 方 法
试验材料 采用亲水性单体丙烯酸经 乙醋 一 和疏水性的聚
乙二醇二 甲基丙烯酸醋系列单体 , , , ,
, , , 日本 和 化学有限公司产品 作为聚合材料 , 用作固定的酶为蛋 白
酶 枯草杆菌 姗 , 公司产品 , 底物为酪蛋白 。
固定化方法 将单体 、 、 、 、 与用 磷酸缓冲液溶解的蛋 白
酶 按照一定的体积 比加到反应器中混合均匀 , 抽真空后用高纯氮气饱和 , 置于 一 ℃ 干冰
此文于 年 月 日收到
辐射技术制备固定化蛋白酶的研究
乙醇 保温瓶中 , 立即用 ℃。 射线 又 。七 辐照使其聚合 , 辐照结束后 , 取 出并切成 厚
的薄片 , 用缓冲溶液洗涤数次 。
固定化蛋 白酶活性的测定 应用 一酚法在碱性条件下 , 蛋 白酶分解酪蛋 白 底物 生
成含酚基氨基酸的呈色反应 , 在 波长处测光密度值 , 表示蛋 白酶活性阁 。 固定化蛋 白酶
相对活性 固定化蛋白酶活性 游离蛋白酶活性 。
聚合物载体水合度的测定 将辐照形成的聚合物载体浸入水中直至重量不变时测定 。 水
合度一 聚合物吸收水份重量 含水聚合物重量 。
单体冷却速率的测定 单体的冷却速率为单体温度从 ℃下降至 一 ℃所需的时间 ℃
。
聚合物载体平均孔径和空孔率的测定 采用 日立 型扫描电子显微镜观察聚合
物结构并计算聚合物平均孔径和空孔率 。平均孔径 拼 义 平均孔面积 动 ’‘, , 空孔率 平
均孔径 只 单位面积上的孔数 单位面积 。
‘
蛋白酶热稳定性的测定 经过 各种温度处理后所保存的蛋白酶的相对活性 。
结 果 与 讨 论
一 单体的性质对固定化蛋白酶活性的影响
单体性质对固定化蛋白酶相对活性的影响见图 。从图中可以看出 , 单体的性质对 固定化
蛋白诱活性的影响很大 , 采用单官能团的丙烯酸轻 乙酷固定的蛋 白酶活性明显高于采用双官
能团的聚乙二醇二甲基丙烯酸醋系列单体所固定的蛋 白酶活性 官能团数 目由下式表示 一
二 一 一 一 , 官能团数 , 观察单体辐照后形成的
聚合物载体发现 , 由于所采用的单官能团单体和双官能团单体具有不同的基团和官能团数 目 ,
形成的载体也具有不同性质 。 由于带有亲水性的轻基且为单官能团单体 , 辐照后形成交
联密度较低 、柔韧性较高的多孔性软凝胶 , 具有呈连续 、 圆形状的微孔结构 图版 一 , 通透性
较好 , 底物的扩散容易 , 包埋固定的蛋白酶分子与底物酪素可以充分反应 , 故固定化酶相对活
性较高 。 聚乙二醇二 甲基丙烯酸醋为双官能团单体 ,辐照后形成的载体交联密度增加 图版
, 硬度增加 , 微孔结构的通透性较差 , 底物的扩散受到了限制 , 不能与固定的蛋白酶分子充分
反应 , 故其相对活性较低 。
二 单体的乙二醇数对聚合物载体水合度及固定化蛋白酶相对活性的影响
疏水性聚 乙二醇二甲基丙烯酸醋系列单体 分子通式为
所含 乙二醇数 目对聚合物载体水合度 、 固定
一 一 一 一 一 一 一
化蛋 白酶相对活性的影响见图 , 由图 可见 , 聚合物载体的水合度随 系列单体中所含 乙二
醇数目的增加而增加 , 固定化蛋白酶的相对活性也随乙二醇数 目的增加而增加 , 这是由于双官
能团单体 系列 的侧链上含有二个 甲基 , 单体具有一定 的疏水性 , 当含有的乙二醇数 目较
少时 , 分子链较短 , 甲基的疏水作用 明显 , 分子的疏水性较强 , 聚合后可以形成一种具有团形
状态的载体结构 图版 一 , 载体较硬 , 膨胀力差 , 水合度也就较低
。这种载体结构的通透性
核 农 学 报 卷
图版 聚合物载体微孔结构的电子显微镜照片
由亲水性单体 制备的聚合物载体 , 冷却速率 ℃
由亲水性单体 制备的聚合物载体 , 冷却速率 ℃
由疏水性单体 制备的聚合物载体 。
由疏水性单体 制备的聚合物载体
℃
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图 单体的性质对 固定化蛋 白酶相对活性的影
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单体
单体浓度
图 聚 乙二醇二 甲基丙烯酸酷系列单体的乙二醇数
对聚合物载体的水合度及固定化蛋 白酶相对活
性的影响
相对活性 。
聚 合物载体 水合度
辐射技术制备固定化蛋白酶的研究
差 , 底物的扩散受到限制 , 故固定化酶的相对活性较低 随着乙二醇数 目的增加 , 分子链增长 ,
甲基的疏水作用变得不明显 , 分子的疏水性减弱 , 辐照后形成具有微孔的聚合物载体 图版
。 , 膨胀能力增加 , 水合度随之增加 , 底物的扩散容易进行 , 故固定化酶的相对活性较高
三 亲水性单体的冷却速率对聚合物载体的空孔率 、固定化酶相对活性的影响
在本文采用的数种单体中 , 聚合反应的冷却速率对亲水性单体 所形成的聚合物结
构影响较大 。 由图 可以看出 , 随着单体聚合反应冷却速率的增加 , 辐照后形成的聚合物载体的
空孔率降低 , 而 固定化蛋 白酶的相对活性相应增加 。这表 明由于单体聚合反应冷却速率的改
变 , 反应体系中的液相结晶化过程发生了明显的变化 。冷却速率越小 , 结晶的过程越慢 , 形成的
冰晶也就越大 , 辐照后聚合物载体的平均孔径增加 , 单位面积上的孔数下降 , 综合的结果是空
孔率随冷却速率的下降而增加 , 这种情况下包埋的酶分子 由于载体的平均孔径大大超过 了蛋
白酶分子而容易造成泄漏 , 故固定化蛋白酶的相对活性较低 。 当冷却速率增加时 , 单体一缓冲液
体系在低温下的结晶过程很快 , 所形成的冰晶很小 , 聚合反应后载体微孔的空孔径很小 , 单位
面积上的孔数增加 , 综合的结果是空孔率随冷却速率的增加而下降 , 这种情况下包埋的蛋 白酶
分子 , 由于载体的孔径大小适合于酶分子的固定 , 不易造成泄漏 , 故固定化蛋 白酶相对活性较
高 图版 一 , 。
四 单体性质对固定化蛋 白酶热稳定性的影响
由于蛋 白酶较容易 自分解 , 游离酶在一定温度下的 自分解反应十分迅速 , 因此热稳定性是
恒量固定化酶的重要因素之一 。 由图 可以看出 , 不同性质的单体对 固定化酶的热稳定性有很
大影 响 , 由亲水性单体 作为载体聚合材料固定的蛋 白酶的热稳定性 明显高于 由疏水性
单体聚乙二醇二 甲基丙烯酸醋系列作为载体聚合材料固定的蛋 白酶 , 而 由疏水性单体固定的
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图图 亲水性单体的冷却速率对聚合物载体的
空孔率 、 固定化蛋白酶相对活性的影响
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蛋白酶的热稳定性随单体所含 乙二醇数的减少而降低 。 这是 由于亲水性单体 聚合形成
的载体为低交联度的多孔状微孔结构 , 酶分子被固定于微孔中并可以与周围的聚合物凝胶发
生分子间作用 , 减轻了由于温度升高而造成的蛋白酶分子的过量运动 , 从而减少了蛋白酶分子
的热变性 , 表现为热稳定性较高 而疏水性单体聚合时由于双官能团的存在 , 形成了高交联度
的刚性聚合物载体 , 固定在这种聚合物载体中的蛋白酶分子被牢固的包埋 , 酶分子之间的相互
作用增加 , 产生 自分解作用 , 故热稳定性较低 。 随着疏水性单体聚 乙二醇二 甲基丙烯酸酷系列
中乙二醇数 目的减少 , 单体分子链缩短 , 疏水性增加 , 聚合后的载体趋向于形成微粒状结构 , 蛋
白酶分子被包埋于这种微粒状载体结构的表面 , 当温度升高时 , 蛋白酶分子之间的相互作用随
之增加 , 自溶作用明显加强 , 表现为固定化酶的热稳定性随乙二醇数的减少而降低 。
参 考 文 献
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李正魁 辐射聚合固定化 。一淀粉酶探讨 江苏农业学报 , ,
李正魁 低温辐射聚合固定化纤维素酶的研究 核农学通报 , ,
张龙翔等 生化实验方法和技术 北京 高等教育出版社 , ,
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