全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
核 农
通
学 报 一。 。 , 了 一
八公 从
三叶草
、
豌豆和快生型大豆根
瘤菌类菌体繁殖研究的进展
周俊初 汪石青 颜玲琳
华中农业大学土化系生物固氮研究室 武汉
采用单个原生质体分 离和微室培养技术研 究 了三叶 草
、
豌豆和快生型 大豆根瘤
菌在根瘤中的分化和繁殖
。 结 果表明 快生型 大豆根瘤菌体的分化和繁植特性与慢
生型 大豆根瘤菌类似 , 多个杆状类菌体 包含在一个共 同的类菌体周膜 中 , 可 区分 出
未成熟的细 小 杆状类菌体和成熟的杆状类菌体 其繁殖率在 刚 现 瘤 时 ,
到 周瘤龄时增加 到 以 上
。 而 三叶草和豌豆根瘤菌在根瘤中的分化过程是从 小
杆菌‘ 未成熟细 长杆状类菌体‘ 成熟的棒状或 状类菌体
。
在一般条井下 , 只 有 小
杆菌才能繁殖 , 其繁殖率也随瘤龄而 增加
。 在根瘸发育后 期 , 少数成熟的三叶 草和
碗豆根瘤类菌体 , 在含水量较 多时 , 可 以转化 为活跃运动 的大杆菌
, 然后 在分裂过
程 中逐次缩 小 并最终转 变为正常的根瘤 小杆菌 含水量较少时 , 大杆菌继续生长形
成假丝状体 , 最后 再断裂为大杆菌或停止生 长 。 渗透压 保护不是根瘤类菌体或小杆
菌繁殖 的必要 条件 , 除对幼 小 根瘤的未成熟类菌体外 , 它妨碍成熟类菌体或 小 杆菌
的生长和繁殖
。
关键词 根瘤菌 美菌体
前 ‘ 言
类菌休是根启固氮的直接作川者 , 一直受到研究者的重视
。 文献上关于根瘤类菌体的定
义 、 分化过程和繁殖特性一直存在着争论 〔门 。 用单细胞分离培养证实豌豆 、 首藉
和三叶草根瘤类菌体不能繁殖 。 “ 报道三叶草根瘤的繁殖率与小杆菌数量 相当
大豆根瘤类菌体的繁殖率 乡‘。 但是到 年 , 。 等 〔 」
。
等 〔“ 和 五
等 〔“ 〕相继报道羽 扇豆 、 大豆和三叶草根瘤类菌休能够繁殖 , 并提出渗透压保护是它们繁
殖的必要条件
。
曹燕珍等 〔 」在重复 等人的工作时发现 , 即使有渗透压保 护 , 紫
云英 、 首着 、 三叶草和首子等根瘤类菌体仍不能繁殖 , 而能进行繁殖的只 有小杆菌 。
等 〔 , 。 」比较研究了 种豆 类根瘤类菌体的存活性后发现 , 只有大豆和百脉根类菌体能 抗 去
污剂并有较高的繁殖能力
。
周俊初等 〔‘“ 用微室培养法也证实三叶草根瘤 中只有小杆菌才能
繁殖 , 类菌体不能繁殖
。
木文报道二叶草 、 婉豆和人豆快生型根瘤 类菌休的繁殖特性 。
此文于 年 月 。日收到 ,
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该 农 学
材 料 和 方 法
供试植物和根油菌
表 供试植物和根瘤菌
植 物 根瘤菌
名 ⋯品 种 来 源
「
、 名 、 。 、
︸口曰当卜艺入拒“
︸矛扎盯︺八。︸甲列
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、
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野大豆
、 豌豆和三叶草种 子分别用浓硫酸或升永液表面灭菌并催芽 后 , 柳于
无氮植物营养液 〔‘ 门琼脂管中 三叶
一
草和野大豆 或砂土管中 碗豆 , 一天后接种相应的
根瘤菌 。 植物在人工光照主 内培养
, 少「技植物生
一
长特性 浏 诊温度 、 光照强度和光照 问 。
培养基和等渗液
系常规根瘤菌培养基 〔“ ’, 为不加琼脂的 夜体培养从 , 为
·
露 解
用量加至 的高渗培养毖
。 等渗 夜 、 渗透压保护稀释液 和原生质休酶解液的制
备及过滤除菌法见文献 。 。
根 破碎液总菌数和活菌数的刹定
取不同瘤龄的根瘤用升永溶液表向灭菌后 , 分别在
、 和蒸训水 , , 压
碎 , 用 一 计
,
算曾
、
菌数 , 然 亏川相 司溶液作系列稀释 , 仪 涂
抹 或 “ 平板 , 培养后计算活菌数 。
从根油中分离单个原生质体
将经表面灭菌的根瘤切开或不切开 , 加 一 酶解 夜 , 于 ℃ 豌 豆 和 野 大 少戈 或
℃ 三叶草 下酶解 一 小时 , 取根痛用针刺法将原生质体释放 在载玻片 的 小 滴
中 , 用我们研制的新型简易显微操作器 〔‘ “ , 在 卜木 一 相差显微镜
一
勺日事先吸
入 了灭菌液体石蜡的毛细管吸取单个原生质体 , 卜将其转入
、 戍 小滴 中 , 让
液体石蜡与原生质充分接触 , 从川 使原生质体破 义和 行放出其 ,扫匕台的类菌体 , 该 恳
、
肤 可用
于测定总菌数和活菌数 , 及微室培养测定类菌体的繁殖能力 。 测总菌数时取 一 个中等大
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期 兰叶草 、 豌豆和快生型大豆根瘤茵类菌休繁殖研究的进展 ”
小的原生质休于 户使其破裂 , 用 一 测定 曾
、
菌数 。
显微微室培养和生长过程的磁带录像
在灭菌的盖玻片上加一小滴半固体 琼 培养纂 , 迅速倾 斜使之形成均匀的薄层 ,
吸去多余的培养基 , 随后 加一小滴根瘤破碎液或加一小滴上述单个原生质体悬液 , 倾 斜盖玻
片
, 用灭苗吸水纸吸去多余的菌悬浪 , 然后把盖玻片反转放在灭菌凹 玻片上 , 周 围 用 蜡 密
封 , 形成一个封 闭微室
。
在保 温 ℃的培养室 内用 日本 一 相差显微镜 , 在 油
镜下定位观察 , 并在不同时间用 日产 摄像机和 录像系统记 录其生 长全过程 。
结 果
一 根瘤原生质体的形态和类菌体的分化
从图版 一 和 中着出 , 豌豆和三叶草根瘤释放的原生质体 , 吸水后呈球形或椭 园形 ,
中部有一个较大的液泡 , 可 以区分出大 、 ,
、
小三种类型 。 而从野大豆根肩中释放的原生质
休为不规则伏 , 乒戊泡较小 图版 一
。
三叶草根瘤类菌体的形态分化如图版 所示 , 从图
版 看出 , 在 小原生质体中的类菌体呈杆状 , 处于分化前期 原生质体 「 为细 长杆状 , 处
于分化 中期 大原生质体中呈棒状 , 少数 形为成熟类菌体
。 野大豆根瘤类菌休的形态 分化
见图版 , 由图版 一 看出 , 在 幼龄根痛原生质体 「 很容 易观察到 山植物性周膜包裹多个
图版 碗豆 、 三叶草和野 大豆根瘤释放的单个原生质体
,
豌豆 三叶草 野大豆
爪 、爪 口户口性
月
图版 三叶 草根瘤中不 同形态类 菌体
杆状 细长杆状 特化的成熟类菌体 。
, ,
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核 农 学 报 卷
赞
麓 纂
祝
黔娜备
图版
一
、
野大豆根瘤原生质体 的小 胞 囊结 构和 类菌体形态
小咆福结构
, 一川、
艺,
,
一
类菌沐的形态 小箭头指未戍熟的小杆状沐 , 大箭头指成熟的杆伏 详
、 , 川 ‘ 一 、飞 。
一。 月。
图版 野 大豆根瘤类 菌体繁 殖过程
培养 小时 培养 小时 培养 小 执
培养 小时 培养茱 , ’
礴 ,
卜、
, ’ , 、 。
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期 三叶草
、
豌豆和快生型大豆根瘤苗类菌休繁殖研究的进展 钩
类菌体而形成的小胞囊结构 。 至于类菌休的形态 , 在幼龄根瘤的小原生质体中为细小杆状 ,
在成熟根瘤的大原生质体中为杆状 图 一 。 、
二 从根瘤破碎液中释放的类菌体和小杆菌的繁殖能力
由表 可见 根瘤破碎液巾的类菌休 野大豆 和小杆菌 豌豆 在低渗条件 一
、 正常条件 一 和高渗条件 一 斗 ” 下的繁殖率均随瘤龄增加而 上
升 高渗条件仅对幼龄根瘤 野大豆在 周 以内 , 豌豆 周 以内 中的类菌体和小杆菌的繁殖
能力有促进作用 , 但对成熟根瘤却表现为抑制作用 , 它使类菌体和小杆菌的生
一
民延迟 , 繁殖
率降低 。
三 从根右原生质休中释放的类菌体的象殖能力
表 为快生型大豆根痛菌侵染野大豆后不 同瘤龄根瘤原生质体
一
,类菌休的繁殖 能 力
。 与
表 根痛破碎液的测定结果相 比 , 类菌休的繁殖能力也呈现 出随瘤龄而增加的规律
, 但 在 同
庆 一瘤龄下 , 从原生质体测得的繁殖率要 比根痛破碎液低得多 。 在三种渗透压条件下 , 繁殖率
从高到低的排列顺序是 一 一 一 斗 “
。
四 单个类菌体和小杯菌的繁殖过程与微菌落的形成
图版 那示野大豆根瘤类菌体的繁殖过程 , 注意类菌体只有一部份能最终 长成微菌落 。
图版 示豌豆根瘤小杆菌的繁殖过程 , 注意在同一视野中 , 许多类菌体并没有繁殖 。
图版 豌豆根瘤小 杆菌繁 植过程
“阴 “ ,
培养 小时 培养 小时 培养 一 小时
培养弓 小时
一
培养基 ,
’
一
一 礴
,
‘
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的 核 农 学 报 卷
五 三叶草和豌豆根瘤类菌体繁殖过程 的新证据
周俊初 从 三叶草老根痛 瘤龄比周 中获得一个完整的单原生质体
, 并从‘卜释
放 大 鼠典型的戍熟棒状类菌体 , 微室培养发现这些类菌体逐渐转变为活跃运动 的大杆苗 ,
继续培养时 , 大杆菌能进行多次分裂 , 井在 分裂过程中依次变为正常大小的根瘤小杆菌 图
版 城
。
从这些小杆菌
一
民成的微菌落具有典型的根瘤菌形态
、 ‘毅色和培养特征 , 能使 自三叶
草有效结瘤 , 与出发菌株 的荧光抗体有强的正反应
。
我们在研究豌豆根瘤菌类体的分化和繁殖特性时 , 发现类菌休在绝大多数情况下不能繁
殖 , 但是也 曾几次观察和记录列成熟根棒 中的个别 类菌体表现 出
一
与上述三叶
·
草根瘤类菌体相
似的转化和繁殖过程 当培养基含水 量较高时 , 转化 与繁殖过程与上述三叶草根痛菌类菌体
相似 , 图版 表明类菌休转化来的大杆菌的运动性和分裂后依次变小的情况 。 而当培养华含
图版 矶 三叶 草根瘤成熟类菌体转 变为 欠
杆菌和 分裂繁 殖过程
矶
从单个原生质中释放的类菌体
卜时后杆菌分裂变小
培养基 , ’
、 一
并小日
全部转为小汗菌
》
。
,
、
,
,
,
积
士。
,
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兰呼草
、
豌员和快生型大豆根瘤菌类菌体繁殖研究的进展 只期八乙
卜
城镶珊
怂
分班截彝獭靛囊撇 瓣嘟娜 」漏
图版 皿 碗豆根瘤类菌体转 变为大杆菌和
随分 裂逐次 变小 的过程
孤 。
誉众撬烹背‘糕岁乞梦忿毖几留乞
鼎撇桑窦翼黑鬓黔瓤票辫、很 , 空箭头示第二次分裂 。
一 玉
裂
,
,
岭
豁鬃
鳃
足泥劳粼
馨鬓携
蘸缨鬓鹦巅撒黝礼幼翻男影馨
图版孤 豌豆根瘤成熟类菌体转 变为 “
并断 裂为 大杆菌的过程
月券 一 〕
丝 状休 ”
恤 一
” 阴
培养 天后类菌体开始生长 天后形成二又分枝
天 后迸一 步分 枝 , 天后 断裂为大杆菌
培养基 , ℃
,
,
,
纽 士 , “ ” ,
,
’ , 一
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兰呼草
、
豌员和快生型大豆根瘤菌类菌体繁殖研究的进展 只期八乙
卜
城镶珊
怂
分班截彝獭靛囊撇 瓣嘟娜 」漏
图版 皿 碗豆根瘤类菌体转 变为大杆菌和
随分 裂逐次 变小 的过程
孤 。
誉众撬烹背‘糕岁乞梦忿毖几留乞
鼎撇桑窦翼黑鬓黔瓤票辫、很 , 空箭头示第二次分裂 。
一 玉
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足泥劳粼
馨鬓携
蘸缨鬓鹦巅撒黝礼幼翻男影馨
图版孤 豌豆根瘤成熟类菌体转 变为 “
并断 裂为 大杆菌的过程
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培养 天后类菌体开始生长 天后形成二又分枝
天 后迸一 步分 枝 , 天后 断裂为大杆菌
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赞 期 三林 豌豆和快生型大豆根瘤菌类菌体繁殖研究的进展 “
水量较低时 , 由类菌体转化来的大杆菌因不能游走而停在原处 , 形成类似于放线菌的丝状物
后停止生长 当水份条件没有改善时 或断裂成大杆菌 当水份条件改善时 , 这些大杆菌
可以按图版 孤所示的过程继续分裂繁殖
。 图版 租是从类菌体演变为丝状体并断裂为大杆菌的
全过程 , 这一变化十分缓慢 , 完成全过程约需 一 天
。
讨 论
八
快生型大豆根瘤菌侵 染野大豆后 , 其根瘤含菌细胞的形态结构 , 类菌体形态分化和繁殖
特性与周俊初等 ‘“ 报道的慢生型大豆根瘤菌侵染大豆后的情况相同 , 但与三叶草 、 首褶
、
紫云英
、
豌豆等快生型根瘤菌形成根瘤的情况不同 。 等 」将他们研究的 种豆科 植
物区分为两大类 一类以大豆为代表 , 类菌体为杆状 , 没有明显的形态分化 , 多个类菌休包
含在一个类菌休周膜中 , 它们能够繁殖 另一类 以豌豆
、 首着和三仆卜草为代表 , 类菌体为棒
状或 形 , 单个地包含在类菌体周膜中 , 它们不能够繁殖
。
本研究则取得了豌豆根瘤小杆 菌
能够进行繁殖的直接证据 。
对豌豆 、 三叶草等的特化类菌体 , 有的学者认为 , 在人工培养条件下不能繁殖 〔‘
年 等 报道类菌休能够进行繁殖 , 但不久又被曹燕珍等
、
等 和周
俊初等 ‘“ 所否定
。 但曹燕珍等的试验结果并不能排除在植物生长后 期根瘤中类菌休发生转
化的可能性 。 仁“ 认为在老根瘤中出现的小杆菌可能来源于 侵入线内或含菌细
胞外的小杆菌大量繁殖 土壤中根瘤菌或其它细菌的侵染和繁殖 由类菌体转化成小杆
菌 。 我们在研究中发现 , 三叶草老龄根瘤单个原生质体释放的类菌体和豌豆根瘤破碎液中的
少数类菌体 , 循着从类菌体‘ 运动的大杆菌 ”正常根瘤小杆菌的模式进行生长繁殖 , 表明特
化类菌体在根瘤发育后 期可以重新转化为小杆菌而回到土壤中 , 从而充实了根瘤菌生活史学
说 。 由于特化类菌休需要到植物生 长和根瘤发育的某一特殊阶段才具有转化和繁殖能力 , 在
此之前的任何时期 , 分离的类菌体都不能够繁殖 , 而只有根瘤小杆菌才具有生长 和 繁 殖 能
力 。
本课题受国家自然科学基金资助 , 在陈华癸教授指导下进行
参 考 文 做
〔门 周俊初 根瘤菌类菌体繁殖能力的研究历史 。 华中农学院学报 , , 正 一
〔〕 , , 了 ,
一
〔 〕 , ,
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〔 〕 士 , , 一 一 幻
价 , , 一
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〔 〕曹燕珍等 根瘤菌在寄主细胞内的分化及存活性 中国科学 辑 生 一
〔 〕 , , 五 。。 士 冬 ” 乒 牙 乒典礴
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一
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